Luận án tiến sĩ về hoạt tính sinh học và bản chất hóa học của hoạt chất từ nấm nội sinh trên cây khổ sâm và cây bùm bụp

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Và Hóa Học Của Hoạt Chất Từ Nấm Nội Sinh Trên Cây Khổ Sâm Và Cây Bùm Bụp
• Loại tài liệu: Luận Văn

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 0.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 0.1.1. Đại cƣơng về các cơ thể nội sinh thực vật (CTNS) và nấm nội sinh thực vật (NNS)
• 0.1.2. Sinh học và sinh thái học của NNS
• 0.1.3. Quan hệ của NNS với cây chủ của chúng
• 0.1.4. Nấm nội sinh
• 1. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.1. Vi sinh vật kiểm định
• 1.2. Các dòng tế bào
• 1.3. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
• 1.4. Môi trƣờng
• 1.4.1. Môi trƣờng phân lập nấm nội sinh
• 1.4.2. Môi trƣờng nuôi và giữ các chủng nấm nội sinh
• 1.4.3. Các môi trƣờng thử hoạt tính enzym
• 1.4.4. Môi trƣờng nuôi VSVKĐ và tế bào
• 1.5. Phƣơng pháp
• 1.5.1. Phân lập NNS từ mẫu cây
• 1.5.2. Phân loại nấm bằng phƣơng pháp hình thái học
• 1.5.3. Phân loại nấm bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
• 1.5.4. Thu nhận cặn chiết từ dịch lên men của các chủng NNS
• 1.5.5. Tách các chất từ cặn chiết của dịch lên men chủng Trichoderma konilangbra KS14
• 1.5.6. Xác định cấu trúc các hợp chất tách đƣợc
• 1.5.7. Xác định các hoạt tính sinh học của các chủng NNS
• 1.5.7.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
• 1.5.7.2. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thƣ
• 1.5.7.3. Xác định hoạt tính chống oxy hoá
• 1.5.7.4. Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào
• 1.5.8. Khảo sát tác dụng của các chế phẩm Trichoderma konilangbra KS14 đối với cây khổ sâm
• 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. Phân lập nấm nội sinh từ cây thuốc
• 2.2. Các chủng nấm nội sinh từ cây khổ sâm
• 2.3. Các chủng nấm nội sinh từ cây bùm bụp
• 2.4. Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng NNS phân lập đƣợc
• 2.5. Phân loại các chủng nấm nội sinh bằng phƣơng pháp hình thái và bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
• 2.5.1. Phân loại các chủng NNS bằng phƣơng pháp hình thái
• 2.5.2. Phân loại chủng nấm nội sinh KS14 bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
• 2.6. Hoạt tính sinh học của cặn chiết và của dịch lên men các chủng nấm nội sinh đã đƣợc lựa chọn
• 2.6.1. Hoạt tính kháng VSV của các cặn chiết etylaxetat
• 2.6.2. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thƣ của các cặn chiết etylaxetat
• 2.6.3. Hoạt tính chống oxy hoá của các cặn chiết etylaxetat
• 2.6.4. Hoạt tính enzym ngoại bào của dịch nuôi các chủng nấm lựa chọn
• 2.7. Tìm hiểu các điều kiện nuôi thích hợp cho hoạt tính kháng VSV của chủng nấm T.
• 2.7.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men
• 2.7.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi
• 2.7.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi
• 2.7.4. Ảnh hƣởng của nguồn cácbon và nguồn nitơ
• 2.8. Bản chất hóa học của các hợp chất tách đƣợc từ dịch lên men của chủng NNS T.
• 2.8.1. Hợp chất KS14-1
• 2.8.2. Hợp chất KS14-2
• 2.8.3. Hợp chất KS14-3
• 2.8.4. Hợp chất KS14-4
• 2.8.5. Hợp chất KS14-5
• 2.9. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách đƣợc từ chủng T.
• 2.9.1. Hoạt tính kháng VSV
• 2.9.2. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thƣ
• 2.9.3. Hoạt tính chống oxy hoá
• 2.10. So sánh hoạt tính của sorbixilin và ergosterol peroxit với ent-7β-hydroxy-18-axetoxy-kaur-16-en-15-on
• 2.11. Tác dụng của chế phẩm T. konilangbra KS14 đối với cây khổ sâm
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nấm nội sinh và cây thuốc

Nấm nội sinh (NNS) là một phần quan trọng trong hệ sinh thái thực vật, đặc biệt là trong các cây thuốc. Chúng sống bên trong mô thực vật mà không gây ra triệu chứng bệnh. Nghiên cứu cho thấy NNS có khả năng sản sinh ra nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học cao, như các chất kháng vi sinh vật và chất chống oxy hóa. Các cây thuốc như khổ sâm (Croton tonkinensis) và bùm bụp (Mallotus apelta) chứa nhiều NNS, tạo ra các hợp chất có lợi cho sức khỏe con người. Việc khai thác các hoạt chất từ NNS có thể giúp bảo tồn đa dạng sinh học và giảm thiểu tác động tiêu cực đến cây thuốc. Nghiên cứu này không chỉ mở ra hướng đi mới trong y học mà còn trong nông nghiệp và công nghiệp.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm nội sinh

NNS có mặt ở hầu hết các loại thực vật, từ cây lớn đến cây thân thảo. Chúng thuộc hai lớp chính: Nấm nang (Ascomycetes) và Nấm bất toàn (Deuteromycetes). NNS có khả năng tương tác với cây chủ, tạo ra các sản phẩm thứ cấp có giá trị. Những sản phẩm này không chỉ giúp cây chủ chống lại các tác nhân gây hại mà còn có thể được sử dụng trong y học. Nghiên cứu về NNS giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa chúng và cây thuốc, từ đó khai thác các hoạt chất có lợi cho sức khỏe con người.

II. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của nấm nội sinh

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết xuất từ NNS. Các phương pháp như phân lập, xác định cấu trúc hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học được áp dụng. Kết quả cho thấy các hợp chất từ NNS có khả năng kháng vi sinh vật và gây độc tế bào ung thư. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới từ NNS. Việc nghiên cứu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn trong y học và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp chiết xuất và phân tích hóa học được sử dụng để thu nhận các hợp chất từ NNS. Các thử nghiệm hoạt tính sinh học được thực hiện để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật và độc tính của các hợp chất. Kết quả cho thấy một số hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có thể được phát triển thành các sản phẩm dược phẩm. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về NNS mà còn mở ra hướng đi mới trong việc khai thác các hoạt chất từ thiên nhiên.

III. Ứng dụng thực tiễn của nấm nội sinh trong y học

NNS có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm y học mới. Các hợp chất chiết xuất từ NNS không chỉ có khả năng kháng vi sinh vật mà còn có tác dụng chống ung thư và chống oxy hóa. Việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm từ NNS có thể giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng và bảo vệ môi trường. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc khai thác các hoạt chất từ NNS trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới và bền vững.

3.1. Tác động của nấm nội sinh đến cây thuốc

NNS có thể tác động tích cực đến sự phát triển của cây thuốc thông qua việc cung cấp các hoạt chất có lợi. Nghiên cứu cho thấy NNS có thể kích thích cây thuốc sinh trưởng và tăng hàm lượng các chất có hoạt tính. Điều này không chỉ có lợi cho cây mà còn cho con người, khi các cây thuốc này được sử dụng trong điều trị bệnh. Việc hiểu rõ mối quan hệ giữa NNS và cây thuốc sẽ giúp tối ưu hóa việc sử dụng các nguồn tài nguyên thiên nhiên trong y học.

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh phát triển mạnh mẽ của nghiên cứu về cơ thể nội sinh thực vật (CTNS) và đặc biệt là nấm nội sinh thực vật (NNS) trong hai thập kỷ gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng NNS không chỉ tồn tại phổ biến trong mô thực vật khỏe mạnh mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây chủ và cung cấp các hoạt chất sinh học quý giá. Ước tính có khoảng 1 triệu loài nấm nội sinh trên toàn cầu, trong đó chỉ một phần nhỏ được mô tả chi tiết. Việt Nam với kho tàng cây thuốc phong phú, trong đó hai loài khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.) và bùm bụp (Mallotus apelta Lour.) được nghiên cứu nhiều về hóa học, là môi trường lý tưởng để khai thác tiềm năng của NNS.

Mục tiêu nghiên cứu tập trung vào việc phân lập và xác định hoạt tính sinh học của các chủng nấm nội sinh từ hai cây thuốc này, đồng thời phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hoạt tính được tách chiết. Ngoài ra, nghiên cứu còn thăm dò khả năng tác động của một chủng nấm nội sinh tiêu biểu lên cây thuốc thông qua chế phẩm, nhằm đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng và tăng hàm lượng hoạt chất trong cây chủ. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và môi trường nuôi cấy tại Việt Nam, với các mẫu thu thập từ cây khổ sâm và bùm bụp.

Ý nghĩa của nghiên cứu được thể hiện qua việc cung cấp nguồn nguyên liệu sinh học mới có hoạt tính kháng vi sinh vật, chống oxy hóa, kháng ung thư và các enzym thủy phân ngoại bào, góp phần phát triển các sản phẩm dược liệu và bảo vệ cây trồng. Đồng thời, việc khai thác các hoạt chất từ nấm nội sinh giúp giảm áp lực khai thác trực tiếp lên cây thuốc, góp phần bảo tồn đa dạng sinh học và hệ sinh thái.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết về mối quan hệ cộng sinh giữa nấm nội sinh và cây chủ, trong đó nấm nội sinh được định nghĩa là các vi sinh vật sống bên trong mô thực vật khỏe mạnh mà không gây triệu chứng bệnh rõ ràng. Lý thuyết về sự đa dạng sinh học của NNS nhấn mạnh tính đặc hiệu vật chủ và sự phân bố đa dạng của các chủng nấm trong các bộ phận khác nhau của cây. Mô hình sinh thái học của NNS tập trung vào vai trò của chúng trong việc bảo vệ cây chủ chống lại côn trùng hại, các tác nhân gây bệnh và các điều kiện môi trường bất lợi.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Hoạt tính sinh học của nấm nội sinh: khả năng tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kháng ung thư và enzym thủy phân ngoại bào.
• Tính đặc hiệu vật chủ: sự ưu tiên nội sinh của các chủng nấm đối với các loài cây hoặc bộ phận cây nhất định.
• Mối quan hệ cộng sinh và hỗ sinh: nấm nội sinh giúp cây chủ tăng cường sức đề kháng và sinh trưởng, đồng thời nhận chất dinh dưỡng từ cây.
• Phân loại nấm nội sinh: dựa trên phương pháp hình thái học và sinh học phân tử để xác định chủng loại và mối quan hệ tiến hóa.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu nấm nội sinh được phân lập từ mô lá, cành và rễ của cây khổ sâm và bùm bụp thu thập tại các vùng trồng cây thuốc ở Việt Nam. Cỡ mẫu khoảng vài chục chủng nấm được phân lập và sàng lọc hoạt tính sinh học. Phương pháp chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên có chủ đích nhằm đảm bảo đa dạng chủng loại và bộ phận cây.

Phân loại nấm được thực hiện kết hợp giữa phương pháp hình thái học (quan sát đặc điểm khuẩn lạc, bào tử, sợi nấm) và phương pháp sinh học phân tử (phân tích trình tự gen ITS). Các chủng nấm tiêu biểu được nuôi cấy trong môi trường lên men để thu nhận dịch lên men và cặn chiết.

Phân tích hoạt tính sinh học bao gồm:

• Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (vi khuẩn và nấm gây bệnh).
• Hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên các dòng tế bào ung thư tiêu chuẩn.
• Hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp quang phổ.
• Hoạt tính enzym ngoại bào (pectinaza, proteinaza, xylanaza, glucanaza).

Thời gian nghiên cứu kéo dài khoảng 2 năm, bao gồm các giai đoạn thu thập mẫu, phân lập, sàng lọc hoạt tính, tách chiết hợp chất, xác định cấu trúc hóa học bằng phổ NMR, LC-MS, và thử nghiệm tác động lên cây chủ. Phân tích dữ liệu sử dụng các phần mềm thống kê chuyên dụng để đánh giá mức độ hoạt tính và so sánh giữa các chủng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và đa dạng nấm nội sinh: Từ cây khổ sâm và bùm bụp, đã phân lập được khoảng 40 chủng nấm nội sinh khác nhau, thuộc các chi phổ biến như Trichoderma, Penicillium, Fusarium, và Xylaria. Trong đó, chủng Trichoderma konilangbra KS14 được xác định là chủng tiêu biểu với hoạt tính sinh học nổi bật.

2. Hoạt tính kháng vi sinh vật: Các cặn chiết etylacetat từ chủng KS14 thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng của nhiều vi sinh vật gây bệnh kiểm định với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dao động từ 15 đến 50 µg/mL, trong đó hiệu quả kháng khuẩn đạt trên 70% so với nhóm đối chứng.

3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Các hợp chất tách chiết từ dịch lên men của KS14 có hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 với giá trị IC50 trong khoảng 10-30 µg/mL, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.

4. Hoạt tính chống oxy hóa và enzym ngoại bào: Cặn chiết của KS14 có khả năng bẫy gốc tự do với hiệu suất SC% đạt khoảng 65%, tương đương với các chất chống oxy hóa chuẩn. Dịch nuôi cấy chủng này cũng biểu hiện hoạt tính enzym pectinaza và proteinaza cao, hỗ trợ vai trò phân hủy mô thực vật và tương tác với cây chủ.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập đa dạng chủng nấm nội sinh từ hai cây thuốc cho thấy sự phong phú sinh học của NNS trong môi trường nhiệt đới Việt Nam, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về tính đa dạng của NNS trong các hệ sinh thái nhiệt đới. Hoạt tính kháng vi sinh vật và gây độc tế bào ung thư của các hợp chất tách chiết từ chủng KS14 tương đồng với các nghiên cứu về nấm nội sinh Trichoderma ở các vùng khác, khẳng định tiềm năng khai thác các hoạt chất sinh học từ nấm nội sinh.

Hoạt tính enzym ngoại bào cao của chủng KS14 cho thấy vai trò quan trọng của enzym trong việc hỗ trợ nấm nội sinh xâm nhập và tương tác với mô cây, đồng thời góp phần vào khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh. Các dữ liệu này có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hoạt tính enzym và hoạt tính kháng vi sinh vật giữa các chủng nấm phân lập.

So với các nghiên cứu trước đây, việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hoạt tính từ KS14 cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc phát triển các sản phẩm dược liệu và sinh học. Ngoài ra, thử nghiệm tác động của chế phẩm nấm lên cây khổ sâm cho thấy khả năng kích thích sinh trưởng và tăng hàm lượng hoạt chất trong cây, mở ra hướng ứng dụng thực tiễn trong nông nghiệp và dược liệu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình nuôi cấy và lên men chủng Trichoderma konilangbra KS14 nhằm tối ưu hóa sản xuất các hoạt chất sinh học, tập trung vào điều chỉnh pH, nguồn carbon và nitơ trong môi trường nuôi, dự kiến hoàn thành trong 12 tháng, do các phòng thí nghiệm vi sinh và công nghệ sinh học thực hiện.

2. Nghiên cứu sâu về cơ chế tác động của các hợp chất hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư và vi sinh vật gây bệnh, kết hợp phân tích gene và protein, nhằm phát triển thuốc sinh học mới, thời gian 18 tháng, do các nhóm nghiên cứu dược lý và sinh học phân tử đảm nhiệm.

3. Ứng dụng chế phẩm nấm nội sinh trong canh tác cây thuốc để tăng năng suất và chất lượng dược liệu, triển khai thử nghiệm trên diện tích canh tác thực tế tại các vùng trồng khổ sâm và bùm bụp trong vòng 2 năm, phối hợp giữa viện nghiên cứu và nông dân địa phương.

4. Xây dựng chương trình bảo tồn và phát triển đa dạng sinh học nấm nội sinh trong các hệ sinh thái rừng và vùng trồng cây thuốc, nhằm bảo vệ nguồn gen quý và duy trì cân bằng sinh thái, thực hiện liên tục với sự phối hợp của các cơ quan quản lý môi trường và khoa học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh vật và sinh học phân tử: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu chi tiết về đa dạng và hoạt tính sinh học của nấm nội sinh, hỗ trợ phát triển các đề tài về vi sinh vật học và công nghệ sinh học.

2. Chuyên gia dược liệu và phát triển sản phẩm sinh học: Thông tin về các hợp chất hoạt tính và phương pháp tách chiết giúp phát triển thuốc mới, sản phẩm bảo vệ thực vật sinh học và các chế phẩm hỗ trợ sức khỏe.

3. Nông dân và nhà quản lý nông nghiệp: Kết quả nghiên cứu về tác động của nấm nội sinh lên cây thuốc cung cấp cơ sở khoa học để áp dụng chế phẩm nấm trong canh tác, nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

4. Cơ quan bảo tồn đa dạng sinh học và môi trường: Luận văn nhấn mạnh vai trò của nấm nội sinh trong bảo tồn hệ sinh thái và đa dạng sinh học, hỗ trợ xây dựng chính sách bảo vệ nguồn gen và môi trường tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm nội sinh là gì và tại sao chúng quan trọng?
   Nấm nội sinh là vi sinh vật sống bên trong mô thực vật khỏe mạnh mà không gây bệnh. Chúng quan trọng vì có thể tổng hợp các hoạt chất sinh học quý giá, giúp cây chủ chống lại sâu bệnh và điều kiện môi trường bất lợi.

2. Làm thế nào để phân lập và xác định nấm nội sinh?
   Phân lập nấm nội sinh được thực hiện bằng cách lấy mẫu mô cây, xử lý bề mặt và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt. Xác định chủng nấm dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen ITS.

3. Các hoạt tính sinh học của nấm nội sinh được đánh giá như thế nào?
   Hoạt tính được đánh giá qua các thử nghiệm kháng vi sinh vật, gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào, sử dụng các phương pháp chuẩn trong phòng thí nghiệm.

4. Nấm nội sinh có thể ứng dụng trong nông nghiệp như thế nào?
   Nấm nội sinh có thể được sử dụng làm chế phẩm sinh học để kích thích sinh trưởng cây trồng, tăng sức đề kháng với sâu bệnh và cải thiện chất lượng dược liệu, giảm sử dụng hóa chất độc hại.

5. Tại sao nghiên cứu nấm nội sinh ở cây thuốc lại có ý nghĩa?
   Cây thuốc chứa nhiều nấm nội sinh có khả năng tổng hợp các hoạt chất tương tự hoặc mạnh hơn cây chủ, mở ra nguồn dược liệu mới, đồng thời giúp bảo tồn cây thuốc và đa dạng sinh học.

Kết luận

• Đã phân lập và xác định được đa dạng chủng nấm nội sinh từ cây khổ sâm và bùm bụp với hoạt tính sinh học nổi bật.
• Chủng Trichoderma konilangbra KS14 thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật, gây độc tế bào ung thư và enzym ngoại bào cao.
• Các hợp chất hoạt tính được tách chiết và xác định cấu trúc hóa học, mở ra tiềm năng ứng dụng trong dược liệu và bảo vệ thực vật.
• Chế phẩm nấm nội sinh có khả năng kích thích sinh trưởng và tăng hàm lượng hoạt chất trong cây thuốc.
• Đề xuất phát triển quy trình nuôi cấy, nghiên cứu cơ chế tác động và ứng dụng thực tiễn trong canh tác cây thuốc.

Tiếp theo, cần triển khai các nghiên cứu ứng dụng quy mô lớn và phát triển sản phẩm sinh học từ nấm nội sinh. Mời các nhà khoa học, doanh nghiệp và nông dân cùng hợp tác để khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên sinh học quý giá này.