Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Tài nguyên cây thuốc giữ vai trò thiết yếu trong việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển. Theo số liệu từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển có nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu phụ thuộc vào y học cổ truyền và các hoạt chất chiết xuất từ dược liệu tự nhiên. Nhu cầu sử dụng dược liệu trên thế giới không ngừng gia tăng; tại Trung Quốc nhu cầu đạt 1.000 tấn/năm (tăng trưởng khoảng 9%/năm), trong khi tại châu Âu và Bắc Mỹ mức tăng trưởng đạt khoảng 10%/năm.
Việt Nam sở hữu hệ thực vật đa dạng với khoảng 10.500 đến 12.000 loài thực vật bậc cao thuộc 2.275 chi và 305 họ, trong đó có khoảng 3.950 loài được sử dụng làm thuốc (chiếm 17% số loài cây thuốc trên thế giới). Chủ trương kết hợp y dược học cổ truyền với y học hiện đại đòi hỏi việc phát hiện và chuẩn hóa các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu bản địa.
Cây Lông cu li (tên khoa học: Cibotium barometz (L.) J.Sm, thuộc họ Dicksoniaceae) là một dược liệu quý trong y học cổ truyền, thường dùng trong các bài thuốc bổ can thận, mạnh gân cốt và trừ phong thấp. Mặc dù đã có một số công trình quốc tế khảo sát về loài này, dữ liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Lông cu li sinh trưởng tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực Lâm Đồng, còn rất hạn chế.
Đề tài khóa luận được xác định với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:
- Tìm kiếm và khảo sát các điều kiện chiết tách thích hợp đối với các nhóm hợp chất từ lông cây cu li bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau.
- Xác định sơ bộ các nhóm chức và định danh thành phần hóa học hiện diện trong các phân đoạn dịch chiết của cây Lông cu li.
- Đóng góp thêm hệ thống dữ liệu khoa học về loài Cibotium barometz tại Việt Nam, tạo cơ sở thực nghiệm cho các nghiên cứu ứng dụng dược liệu tiếp theo.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Lông cây cu li (Cibotium barometz L.) thu hái thực địa tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 8 năm 2017.
- Phạm vi thời gian và địa điểm thực hiện: Đề tài được giao ngày 01/08/2017 và hoàn thành ngày 21/04/2018 tại Phòng thí nghiệm B2, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng; phân tích sắc ký khí khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và phân loại hóa thực vật
Nghiên cứu dựa trên cơ sở phân loại thực vật học của chi Cibotium Kaulfuss (chi có 12 loài phân bố ở vùng nhiệt đới, tại Việt Nam ghi nhận loài Cibotium barometz) và các nghiên cứu hóa học đã công bố trên thế giới về các nhóm hợp chất tự nhiên có trong loài:
- Nhóm axit béo: Axit palmitic, axit oleic, axit linoleic, este metylpalmitat, este etylstearat, 1-mono-palmitin.
- Nhóm hợp chất phenol và dẫn xuất: Axit protocatechuic (axit 3,4-dihydroxybenzoic), axit caffeic, 3,4-dihydroxybenzaldehyde, (3R)-des-O-methyllasiodiplodin.
- Nhóm sesquiterpen và hợp chất glycosid: Ptaquiloside, isohistopterosin A, pterosin Y, pterosin Z, shinbarometin, hợp chất cerebrosid.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Nghiên cứu sử dụng kết hợp các phương pháp chiết tách hóa học truyền thống và kỹ thuật phân tích hóa lý hiện đại:
- Phương pháp chiết mẫu:
- Chiết chưng ninh trực tiếp: Sử dụng 12 g mẫu nguyên liệu chia vào 4 bình cầu, chưng ninh 3 lần (mỗi lần 6 giờ, khuấy đều mỗi giờ) với 150 ml của từng dung môi riêng biệt gồm n-Hexane (70°C), Benzene (80°C), Dichloromethane (40°C) và Ethyl acetate (80°C).
- Chiết chưng ninh hồi lưu kết hợp chiết phân bố lỏng - lỏng: Chưng ninh 21 g mẫu khô với dung môi Ethanol 96% (3 lần, mỗi lần 4 giờ ở nhiệt độ 85°C với 200 ml dung môi). Dịch chiết cồn sau khi thu hồi dung môi tạo cao rắn được hòa tan trong 200 ml nước cất, sau đó tiến hành chiết lỏng - lỏng phân đoạn lần lượt qua 4 dung môi có chỉ số phân cực tăng dần: n-Hexane (độ phân cực: 0), Benzene (độ phân cực: 2,7), Dichloromethane (độ phân cực: 3,1) và Ethyl acetate (độ phân cực: 4,4). Mỗi phân đoạn thực hiện lắc 2 lần, mỗi lần 250 ml trong thời gian 4 giờ.
- Phương pháp định tính hóa học (Phytochemical Screening):
- Định tính Alkaloid: Phản ứng với thuốc thử Mayer (tạo tủa trắng) và thuốc thử Wagner (tạo tủa nâu hoặc dung dịch màu nâu đỏ).
- Định tính Flavonoid: Phản ứng với dung dịch $H_2SO_4$ đậm đặc và phản ứng kiềm hóa bằng NaOH 1% trong ethanol.
- Định tính Steroid/Terpenoid: Phản ứng Salkowski (sử dụng chloroform và $H_2SO_4$ đậm đặc, quan sát sự chuyển màu đỏ đậm/xanh tím).
- Định tính Glycosid: Phản ứng Keller-Kilian ($Fe_2(SO_4)_3$ 5% trong axit axetic loãng phối hợp $H_2SO_4$ đậm đặc) và phản ứng Phenol - $H_2SO_4$ đậm đặc.
- Định tính chất béo: Phản ứng với $H_2SO_4$ 50% trong methanol/ethanol.
- Định tính hợp chất Phenol: Phản ứng Bortrager (KOH 50% trong methanol, quan sát màu đỏ, tím hoặc xanh lục).
- Định tính Sesquiterpen lacton: Phản ứng tráng bạc với thuốc thử Tollens và phản ứng tạo màu với $H_2SO_4$ đậm đặc.
- Phương pháp phân tích công cụ:
- Quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: Thiết bị UV-VIS Lambda 25, thực hiện quét phổ hấp thụ phân tử trong dải bước sóng 200 nm – 800 nm đối với dịch chiết Ethanol tổng và đo mật độ quang của các dịch chiết phân đoạn tại bước sóng hấp thụ cực đại 425 nm.
- Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Thiết bị Shimadzu GC-MS 2010 QP PLUS, sử dụng cột mao quản và buồng ion hóa để tách và định danh các cấu tử bay hơi dựa trên thư viện phổ khối chuẩn.
| Tên hóa chất / Thuốc thử | Độ tinh khiết / Tiêu chuẩn | Nguồn gốc | Mục đích sử dụng |
|---|---|---|---|
| n-Hexane, Benzene | Tinh khiết (TCCS) | Trung Quốc | Dung môi chiết phân đoạn không phân cực và phân cực thấp |
| Dichloromethane, Ethyl acetate | Tinh khiết (TCCS) | Trung Quốc | Dung môi chiết phân đoạn phân cực trung bình |
| Ethanol 96%, Methanol | Tinh khiết (TCCS) | Trung Quốc | Dung môi chiết tổng và hòa tan thuốc thử định tính |
| $H_2SO_4$ (98%), HCl đậm đặc | Tinh khiết (TCCS) | Trung Quốc | Tác nhân cho các phản ứng định tính hóa học |
| $AgNO_3$ (99,8%), NaOH, $NH_4OH$ | Tinh khiết (TCCS) | Trung Quốc | Pha chế thuốc thử Tollens và thử nghiệm tính kiềm |
| Thuốc thử Mayer, Wagner, Bortrager | Chuẩn phân tích | Phòng thí nghiệm | Định tính alkaloid, hợp chất phenol và sesquiterpen lacton |
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương này tổng hợp các tư liệu về thực vật học, dược lý học và hóa học của cây Lông cu li (Cibotium barometz):
- Đặc điểm thực vật và sinh thái: Mô tả thân, cuống lá lớn dài 1-2 m màu nâu phủ đầy lông vàng bóng, phiến lá dài tới 3 m; đặc điểm túi bào tử có 2 môi không đều; phân bố sinh thái tại các vùng đất ẩm gần khe suối, rừng núi từ Bắc vào Nam (Lào Cai, Hà Giang, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng, Tây Ninh, Phú Quốc).
- Dược tính cổ truyền và ứng dụng dân gian: Vị đắng ngọt, tính ấm, công năng bổ can thận, mạnh gân cốt, trừ phong thấp. Thân rễ thái phiến tẩm rượu sao vàng dùng trong các bài thuốc trị đau lưng, mỏi gối, tiểu són, di tinh; lông vàng được dùng ngoài để dịt vết thương cầm máu.
- Tổng quan hoạt tính sinh học từ các công bố quốc tế: Dẫn xuất onitin có tác dụng chống co thắt và diệt ký sinh trùng Leishmania; hợp chất ức chế tế bào hủy xương giúp phòng chống loãng xương; axit protocatechuic có khả năng chống oxy hóa vượt trội so với trolox; các hợp chất nhóm perosin có tác dụng chống béo phì và hỗ trợ điều trị đái tháo đường; hoạt chất ức chế protease 3CL của virus SARS-CoV với giá trị $IC_{50}$ từ 39 đến 44 mg/ml.
- Cấu trúc hóa học đã công bố: Liệt kê các công thức cấu tạo của axit béo, dẫn xuất phenolic (axit 3,4-dihydroxybenzoic, axit caffeic), sesquiterpenoid (ptaquiloside, isohistopterosin A, pterosin Y, pterosin Z), glycosid phức tạp (shinbarometin, cerebrosid) và đường sucrose.
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương này trình bày chi tiết quy trình xử lý nguyên liệu, bố trí hệ thống thiết bị và các bước thực nghiệm:
- Xử lý nguyên liệu: Mẫu lông cây cu li thu hái tại Đà Lạt (tháng 8/2017) được làm sạch tạp chất, phơi sấy khô và bảo quản ở điều kiện tiêu chuẩn trước khi tiến hành chiết.
- Quy trình chưng ninh trực tiếp: Mô tả thông số thể tích dung môi (150 ml cho 4 g nguyên liệu mỗi bình), nhiệt độ hồi lưu của từng dung môi (Hexane 70°C, Benzene 80°C, Dichloromethane 40°C, Ethyl acetate 80°C) và kỹ thuật cô đuổi dung môi để thu cao rắn.
- Quy trình chiết phân bố lỏng - lỏng: Chiết hồi lưu 21 g nguyên liệu bằng cồn 96% ở 85°C (3 lần x 4 giờ), cô thu dịch chiết cồn tổng, hòa tan lại trong nước và tiến hành phân đoạn lỏng - lỏng lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần.
- Chi tiết quy trình thử nghiệm định tính hóa học cho 7 nhóm chất hữu cơ đặc trưng (Alkaloid, Flavonoid, Steroid, Glycosid, Chất béo, Phenol, Sesquiterpen lacton).
- Quy trình đo quang phổ UV-VIS và điều kiện chạy sắc ký khí khối phổ GC-MS trên hệ thống Shimadzu 2010 QP PLUS.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương này công bố và phân tích các số liệu thực nghiệm thu được:
- Kết quả chiết chưng ninh trực tiếp: Đánh giá tổng thể tích dịch chiết và khối lượng cao rắn thu được từ 4 dung môi đơn lẻ. Tổng thể tích dịch chiết qua 3 lần chiết lần lượt là n-Hexane (220 ml), Benzene (204 ml), Dichloromethane (193 ml), Ethyl acetate (237 ml). Kết quả cho thấy tỷ lệ phân bố khối lượng các cấu tử tương đối đồng đều giữa các nhóm độ phân cực.
- Kết quả định tính các nhóm chức hóa học trong các phân đoạn:
- Dịch chiết n-Hexane: Dương tính với Steroid, Phenol và Sesquiterpen lacton; âm tính với Alkaloid, Flavonoid, Glycosid và Chất béo.
- Dịch chiết Dichloromethane: Dương tính với Steroid và Sesquiterpen lacton; âm tính với Alkaloid, Flavonoid, Glycosid, Chất béo và Phenol.
- Dịch chiết Benzene: Dương tính với Alkaloid (thuốc thử Wagner cho kết tủa nâu đỏ tan sau 2 phút), Steroid và Glycosid; âm tính với Flavonoid.
- Dịch chiết Ethyl acetate: Khảo sát sự hiện diện của các nhóm chức có độ phân cực trung bình và cao.
- Kết quả khảo sát phổ UV-VIS: Phổ quét UV-VIS của dịch chiết Ethanol tổng trong vùng bước sóng 200–800 nm cho thấy các đỉnh hấp thụ đặc trưng, trong đó bước sóng 425 nm được chọn để đo mật độ quang học so sánh giữa 4 phân đoạn dung môi.
- Kết quả phân tích thành phần bằng GC-MS: Nhận diện và định danh các cấu tử hydrocarbon và hợp chất hữu cơ bay hơi có trong các phân đoạn dịch chiết, trong đó phổ khối đã xác nhận sự hiện diện của các ankan mạch dài như n-Dodecane, Tetradecane và các dẫn xuất liên quan.
| Phân đoạn dịch chiết | Alkaloid | Flavonoid | Steroid | Glycosid | Chất béo | Phenol | Sesquiterpen lacton |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| n-Hexane | (-) | (-) | (+) | (-) | (-) | (+) | (+++) |
| Dichloromethane | (-) | (-) | (+) | (-) | (-) | (-) | (+++) |
| Benzene | (++) | (-) | (+) | (+) | Chưa rõ | Chưa rõ | Chưa rõ |
| Ethyl acetate | Khảo sát | (-) | Khảo sát | Khảo sát | Khảo sát | Khảo sát | Khảo sát |
(Ghi chú: (+) Dương tính; (++) Dương tính rõ; (+++) Dương tính mạnh; (-) Âm tính)
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
- Khảo sát thành công quy trình chiết tách phân đoạn từ lông cây cu li Đà Lạt bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (n-Hexane, Benzene, Dichloromethane, Ethyl acetate) từ dịch chiết cồn tổng.
- Xác định được sự hiện diện của các nhóm hoạt chất sinh học quan trọng trong các phân đoạn thông qua phản ứng hóa học định tính:
- Nhóm Sesquiterpen lacton và Steroid phân bố chủ yếu ở các phân đoạn kém phân cực và phân cực trung bình (n-Hexane, Dichloromethane).
- Nhóm Alkaloid và Glycosid được phát hiện trong phân đoạn Benzene.
- Nhóm Phenol được ghi nhận phản ứng dương tính trong phân đoạn n-Hexane.
- Nhóm Flavonoid không cho phản ứng dương tính rõ rệt trong các phân đoạn khảo sát với các thuốc thử thông thường.
- Thu được dữ liệu phổ hấp thụ phân tử UV-VIS của dịch chiết Ethanol tổng trong khoảng 200–800 nm và mật độ quang tại 425 nm của các phân đoạn; bước đầu định danh một số hợp chất hydrocarbon mạch thẳng (n-Dodecane, Tetradecane) trên phổ đồ GC-MS.
Đóng góp của đề tài
- Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về quy trình chiết tách và định tính hóa thực vật đối với phần lông của cây Lông cu li (Cibotium barometz L.) thu hái tại khu vực Đà Lạt, Lâm Đồng.
- Thiết lập quy trình phân tách lỏng - lỏng tuần tự giúp sơ bộ làm giàu các nhóm hoạt chất (steroid, alkaloid, sesquiterpen lacton) theo từng khoảng độ phân cực của dung môi, phục vụ làm tiền đề cho các nghiên cứu tinh sạch hợp chất.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Nghiên cứu mới dừng lại ở mức độ định tính hóa học và phân tích sắc ký khí khối phổ (GC-MS) đối với các cấu tử dễ bay hơi/có khối lượng phân tử nhỏ (< 500 amu). Chưa tiến hành phân lập sắc ký cột để thu nhận từng đơn chất tinh khiết và chưa thực hiện các phép đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$) để xác định cấu trúc lập thể của các chất phức tạp.
- Hướng mở rộng:
- Mở rộng quy mô chiết tách, sử dụng sắc ký cột pha thường và pha đảo để tinh chế các hợp chất sesquiterpenoid, steroid và alkaloid đã được phát hiện sơ bộ.
- Thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (như hoạt tính kháng viêm, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định) trên các phân đoạn dịch chiết thu được từ nguyên liệu Đà Lạt.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho:
- Sinh viên, học viên cao học ngành Hóa học (Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược), Dược học, Công nghệ sinh học và Sinh học thực vật.
- Các nghiên cứu viên thực hiện đề tài về chiết tách, sàng lọc hóa thực vật và định danh thành phần dược liệu từ các loài dương xỉ hoặc các cây thuốc y học cổ truyền Việt Nam.
- Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình chiết phân bố lỏng - lỏng tuần tự qua 4 cấp dung môi (Chương 2) và hệ thống thuốc thử, hiện tượng phản ứng định tính 7 nhóm hợp chất tự nhiên (Chương 2 và Chương 3).
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu nguyên liệu lông cây cu li được thu hái ở đâu và vào thời gian nào?
Mẫu tươi lông cây cu li (Cibotium barometz L.) được thu hái thực tế tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 8 năm 2017, sau đó được phơi khô và bảo quản để làm nguyên liệu nghiên cứu.
2. Độ phân cực của 4 dung môi hữu cơ dùng trong chiết lỏng - lỏng phân đoạn được sắp xếp như thế nào?
Theo quy trình thực nghiệm tại Chương 2, chỉ số phân cực của 4 dung môi được sử dụng lần lượt là: n-Hexane (0), Benzene (2,7), Dichloromethane (3,1) và Ethyl acetate (4,4).
3. Kết quả định tính nhóm chất Alkaloid trong dịch chiết Benzene diễn ra như thế nào?
Khi thực hiện phản ứng định tính với thuốc thử Wagner trên dịch chiết Benzene, dung dịch xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ, sau 2 phút kết tủa tan dần tạo thành dung dịch có màu nâu đỏ đặc trưng, xác nhận phản ứng dương tính.
4. Dịch chiết n-Hexane cho phản ứng dương tính với những nhóm hợp chất nào?
Dịch chiết n-Hexane cho phản ứng dương tính với 3 nhóm hợp chất: Steroid (xuất hiện màu nâu đỏ với $H_2SO_4$ đặc), Phenol (tạo trầm hiện đỏ với thuốc thử Bortrager) và Sesquiterpen lacton (tạo kết tủa đen bền với thuốc thử Tollens và màu đỏ nâu với $H_2SO_4$ đặc).
5. Thiết bị và bước sóng nào được sử dụng để khảo sát phổ hấp thụ phân tử trong đề tài?
Nghiên cứu sử dụng máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS Lambda 25, thực hiện quét phổ phân đoạn cồn tổng từ 200 nm đến 800 nm và tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dịch chiết phân đoạn tại bước sóng cố định 425 nm.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Như Thủy đã hoàn thành việc khảo sát điều kiện chiết tách hồi lưu và phân đoạn lỏng - lỏng bằng 4 dung môi có độ phân cực khác nhau trên đối tượng lông cây cu li (Cibotium barometz L.) thu hái tại Đà Lạt. Nghiên cứu đã xác định sơ bộ sự hiện diện của các nhóm hoạt chất sinh học tự nhiên bao gồm steroid, sesquiterpen lacton, phenol, alkaloid và glycosid qua hệ thống phản ứng định tính hóa học. Các dữ liệu phổ UV-VIS và sắc ký khí khối phổ GC-MS thu được đóng vai trò là cơ sở khoa học thực nghiệm ban đầu cho các nghiên cứu chuyên sâu về chiết tách và ứng dụng dược liệu cây Lông cu li tại Việt Nam.