Tổng quan luận án

Sự phát triển của ngành công nghiệp dược phẩm Việt Nam gắn liền với mạng lưới khoảng 200 nhà máy sản xuất thuốc đạt tiêu chuẩn GMP-WHO. Phần lớn các cơ sở này tập trung sản xuất các dạng thuốc generic, đặc biệt là nhóm kháng sinh và nhóm thuốc điều trị bệnh tim mạch. Tuy nhiên, ngành dược trong nước vẫn phụ thuộc đáng kể vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu từ nước ngoài. Tạp chất phát sinh trong quá trình tổng hợp, bảo quản hoặc lưu thông phân phối có thể làm suy giảm chất lượng thành phẩm, thay đổi đặc tính an toàn, giảm hiệu quả điều trị hoặc gây ra các tác dụng không mong muốn cho người bệnh. Điển hình, tạp chất captopril disulfid có LD50 là 4,245 g/kg, gây vị kim loại, hạ huyết áp, tăng nhịp tim, suy thận hồi phục và độc tính trên sự phát triển của thai nhi; các tạp chất 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A (LD50 trên chuột là 1022 mg/kg) và tạp B của nifedipin đều tiềm ẩn nguy cơ gây độc tế bào hoặc dị ứng.

Các dược điển tham chiếu như Dược điển Anh (BP), Dược điển Mỹ (USP), Dược điển Châu Âu (EP) và Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) đều bắt buộc kiểm soát chỉ tiêu tạp chất liên quan trong nguyên liệu và thành phẩm chứa cephalexin, amlodipin, captopril và nifedipin. Mặc dù vậy, nguồn tạp chuẩn thương mại hiện phải nhập khẩu với chi phí cao, thời gian đặt hàng kéo dài và nguồn cung không phải lúc nào cũng sẵn có. Tính đến tháng 08/2020, quỹ chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh chỉ có khoảng 35 tạp chuẩn trong tổng số 643 chất chuẩn hóa dược. Khoảng trống thực tiễn này đòi hỏi việc chủ động nghiên cứu quy trình tổng hợp, tiêu chuẩn hóa và thiết lập các tạp chuẩn đối chiếu trong nước.

Đề tài luận án: "Tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và B của nifedipin dùng trong kiểm nghiệm thuốc" được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể sau:

  1. Xây dựng qui trình tổng hợp 6 tạp chất captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và tạp B của nifedipin ở qui mô phòng thí nghiệm.
  2. Xây dựng và thẩm định qui trình xác định độ tinh khiết các tạp tổng hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
  3. Thiết lập được các tạp chuẩn captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và tạp B của nifedipin đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia.
  4. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng tạp chất captopril disulfid trong nguyên liệu và thành phẩm captopril bằng phương pháp sắc ký lỏng.
  5. Ứng dụng các tạp chuẩn đã thiết lập trong kiểm nghiệm tạp captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và tạp B của nifedipin trong một số nguyên liệu và thành phẩm tương ứng đang lưu hành trên thị trường.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là 6 tạp chất liên quan:

  • Captopril disulfid: acid (2S,2'S)-1,1'-[disulphanediylbis[(2S)-2-methyl-1-oxopropan-3,1-diyl]-bis[pyrrolidin-2-carboxylic]] ($C_{18}H_{28}N_2O_6S_2$, $M = 432,6\text{ g/mol}$).
  • 7-ADCA: acid (6R,7R)-7-amino-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.0]oct-2-ene-2-carboxylic ($C_8H_{10}N_2O_3S$, $M = 214,24\text{ g/mol}$).
  • D-phenylglycin: acid (2R)-2-amino-2-phenylacetic ($C_8H_9NO_2$, $M = 151,16\text{ g/mol}$).
  • Tạp D của amlodipin: 3-ethyl 5-methyl 2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-clorophenyl)-6-methylpyridin-3,5-dicarboxylat ($C_{20}H_{23}ClN_2O_5$, $M = 406,86\text{ g/mol}$).
  • Tạp A của nifedipin (dehydronifedipin): dimethyl 2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-pyridin-3,5-dicarboxylat ($C_{17}H_{16}N_2O_6$, $M = 344,32\text{ g/mol}$).
  • Tạp B của nifedipin (dehydronitrosonifedipin): dimethyl 2,6-dimethyl-4-(2-nitrosophenyl)-pyridin-3,5-dicarboxylat ($C_{17}H_{16}N_2O_5$, $M = 328,32\text{ g/mol}$).

Phạm vi nghiên cứu bao gồm thực nghiệm tổng hợp hóa học, xúc tác sinh học enzym ở quy mô phòng thí nghiệm; xác định cấu trúc và độ tinh khiết; thẩm định liên phòng theo tiêu chuẩn chất đối chiếu thứ cấp (SCRS); và kiểm nghiệm các lô mẫu nguyên liệu, thành phẩm lưu hành trên thị trường Việt Nam.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng hợp hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến 6 tạp chất mục tiêu:

  • Đối với captopril disulfid: Hellen Karine Stulzer (2008) và Julia Aparecida L. Souza (2012) chứng minh captopril bị phân hủy thành captopril disulfid ở điều kiện 40 ± 2 °C và độ ẩm tương đối 75 ± 5%. Waleed M. Mahmoud và Klaus Kümmerer khảo sát quá trình phân hủy trong môi trường vi sinh, ánh sáng và nước. Tak Yee Lee và Robert E. Notari nghiên cứu độ ổn định dung dịch captopril ở pH 6,6–8,0, nhiệt độ 32 °C và áp suất oxy 90–760 mmHg. Torreggiani A. và cộng sự khảo sát phản ứng tạo phức và kết tủa của captopril với ion $Cu^{2+}$. Seema S. Badi và Suresh M. Tuwar nghiên cứu động học oxy hóa captopril bằng $[Fe(CN)_6]^{3-}$ trong môi trường acid. Singh D. và cộng sự (2010) dùng chất lỏng ion $[BMIM]-BF_4$, $Na_2CO_3$ và oxy không khí. Schaefer J. khảo sát tương tác in vitro giữa captopril và $FeSO_4$. Casy và Dewar sử dụng phổ $^1H-NMR$ (400 MHz, $DMSO-d_6$) và MS để phân tích đồng phân và sản phẩm oxy hóa. Nafisur Rahman và Nishat Anwar định lượng gián tiếp qua phản ứng với $Fe^{3+}$. Takashi Nishikawa (2004) thiết lập điều kiện HPLC phân tách 3 cặp đồng phân cis-trans, cis-cis, trans-trans ở nhiệt độ dưới 12 °C. Raquel Nogueira (2011) khảo sát sự tạo thành tạp disulfid trong $HCl\text{ 1 M}$, $NaOH\text{ 1 M}$ và $H_2O_2\text{ 3%}$.
  • Đối với 7-ADCA và D-phenylglycin: Janssen H. (2006) tổng quan về enzym Penicillin G acylase (PGA) và 5 phương pháp cố định hóa enzym. Fred G. Schreiber điều chế cephalexin bằng phản ứng hóa học đa bước với các chất bảo vệ nhóm chức. Schroën C. (2001) nghiên cứu tổng hợp và thủy phân cephalexin xúc tác bởi enzym PGA cố định hóa. Jan Verweij tổng hợp 7-ADCA từ 6-aminopenicillanic-sulfoxyd qua phản ứng mở rộng vòng ở 160 °C. Thủy phân cephalosporin G bằng PGA tự do đạt độ tinh khiết 95,40%, trong khi dùng PGA cố định đạt 98,5%. Bovenberg và cộng sự ứng dụng enzym từ Penicillium chrysogenum tái tổ hợp. Yeh và cộng sự (1994) mở vòng penicillin sulfoxyd bằng TCMS/urê và HDMS/toluen. Về D-phenylglycin, Machado George D. và cộng sự (2005) tổng hợp DL-phenylglycin từ benzaldehyd, acyl hóa rồi dùng enzym acylase I tách chọn lọc quang học. Alonso Fábio O. dùng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 10145 cố định trong hạt gel calci alginat chuyển hóa 2-phenyl-2-aminoacetonitril. Phản ứng Strecker từ benzaldehyd với $NaCN$ và $NH_4Cl$ đạt hiệu suất 66,23%.
  • Đối với tạp D của amlodipin: Quy trình tổng hợp 6 giai đoạn từ anhydrid phthalic và monoethanolamin qua các chất trung gian N-(2-hydroxyethyl)phthalimid, ethyl-4-[2-phthalimidoethoxy]acetoacetat, ethyl-2-(clorobenzylidin)-4-[2-(phthalimido)ethoxy]acetoacetat, phthaloyl amlodipin, oxy hóa bằng $SiO_2-HNO_3$ và thủy phân loại nhóm phthaloyl bằng methylamin hoặc hydrazin. Nghiên cứu trong nước chuyển hóa từ amlodipin besilat qua 4 bước và thẩm định tại 3 phòng thí nghiệm độc lập.
  • Đối với tạp A và B của nifedipin: Al-Turk và cộng sự (1988) nghiên cứu quang phân nifedipin trong ethanol 95% theo động học bậc 0. Ali S. (1989) khảo sát độ ổn định trong chai thủy tinh màu và dung môi hữu cơ. Henk De Vries và cộng sự (1995) tổng hợp dehydronitroso nifedipin (tạp B) bằng tia UV trong dung dịch đệm pH 7,4. Satoshi Ogawa và cộng sự (1990) đánh giá tốc độ phân hủy quang học dưới các loại bao bì. Về phản ứng oxy hóa hóa học vòng 1,4-dihydropyridin: Nagarajan và cộng sự (2006) dùng N-bromosuccinimid trong methanol (hiệu suất ~85%); Satya Paul (2007) dùng $SeO_2/SiO_2-P_2O_5$ trong dicloromethan (hiệu suất 82–85%); Arash Ghorbani-Choghamarani (2009) dùng $HNO_3$ kết hợp PVP hoặc $SiO_2$ (hiệu suất 93–99%); Fatemeh Tamaddon và Zahra Razmi (2011) dùng $Ca(OCl)_2$ trong dicloromethan (hiệu suất 95%); Nguyễn Thị Kim Thanh và cộng sự (2007) khảo sát sự tạo thành tạp A và B bằng quang hóa và nhiệt trong methanol.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Xây dựng các quy trình điều chế thực nghiệm hoàn chỉnh, tối ưu hóa các thông số phản ứng, tinh chế đạt độ tinh khiết cao, thiết lập hồ sơ dữ liệu phân tích liên phòng đạt tiêu chuẩn chất chuẩn đối chiếu thứ cấp (SCRS) theo hướng dẫn của WHO/ASEAN, và xây dựng quy trình HPLC ứng dụng định lượng các tạp chất này trong kiểm nghiệm thực tế tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và nguyên tắc chuẩn hóa

Luận án áp dụng hệ thống lý thuyết về chất chuẩn đối chiếu theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á (ASEAN) và tiêu chuẩn ISO:

  • Phân loại chất chuẩn: Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (PCRS), Chất chuẩn đối chiếu hóa học quốc tế (ICRS), Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (SCRS) chính thức và chuẩn làm việc.
  • Quy trình thiết lập SCRS: Đánh giá nhu cầu, lựa chọn nguyên liệu có độ tinh khiết cao, phân tích cấu trúc bằng các phương pháp phổ, xác định độ tinh khiết bằng phương pháp độc lập (HPLC, DSC, TGA), đánh giá độ đồng nhất đóng lọ, kiểm tra tính ổn định, và xác định giá trị ấn định (GTAĐ) thông qua thử nghiệm liên phòng giữa ít nhất 3 phòng thí nghiệm độc lập sử dụng thuật toán thống kê Robust Algorithm A theo tiêu chuẩn ISO 13528 / ISO 5725-5.
  • Tiêu chuẩn Dược điển: Đối chiếu yêu cầu kỹ thuật và giới hạn cho phép của DĐVN V, BP 2019, USP 43, EP 9.
Hoạt chất / Dạng bào chế Tạp chất kiểm soát DĐVN V BP 2019 USP 43 EP 9
Nguyên liệu captopril Captopril disulfid $\le 1,0%$ $\le 1,0%$ $\le 1,0%$ $\le 1,0%$
Viên nén captopril Captopril disulfid $\le 3,0%$ $\le 3,0%$ $\le 3,0%$ Không quy định
Nguyên liệu cephalexin 7-ADCA
D-phenylglycin		 $\le 1,0%$
$\le 1,0%$		 $\le 1,0%$
$\le 1,0%$		 $\le 1,0%$
$\le 1,0%$		 $\le 1,0%$
$\le 1,0%$
Viên nang cephalexin 7-ADCA
D-phenylglycin		 Không quy định $\le 1,0%$ (SKLM)
$\le 1,0%$ (SKLM)		 Không quy định Không quy định
Viên nén cephalexin 7-ADCA
D-phenylglycin		 Không quy định $\le 1,0%$ (SKLM)
$\le 1,0%$ (SKLM)		 Không quy định Không quy định
Nguyên liệu amlodipin besilat Tạp D amlodipin $\le 0,3%$ $\le 0,3%$ $\le 0,3%$ $\le 0,3%$
Viên nén amlodipin Tạp D amlodipin $\le 0,25%$ $\le 0,5%$ $\le 1,0%$ Không quy định
Nguyên liệu nifedipin Tạp A nifedipin
Tạp B nifedipin		 $\le 0,5%$
$\le 0,5%$		 $\le 0,5%$
$\le 0,5%$		 $\le 0,5%$
$\le 0,5%$		 $\le 0,5%$
$\le 0,5%$
Viên nang nifedipin Tạp A nifedipin
Tạp B nifedipin		 Không quy định $\le 1,0%$
$\le 0,5%$		 $\le 2,0%$
$\le 0,5%$		 Không quy định

Phương pháp thực nghiệm

  • Phương pháp tổng hợp và điều chế:
    • Captopril disulfid: Oxy hóa captopril bằng hydrogen peroxyd ($H_2O_2$ 30%), khảo sát và tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng bằng mô hình bề mặt đáp ứng Box-Behnken.
    • 7-ADCA và D-phenylglycin: Thủy phân cephalexin bằng enzym Penicillin G acylase (PGA) cố định hóa trên chất nền polymer (hoạt tính 265 unit/g) trong môi trường dung dịch đệm phosphat pH 8,0; tinh chế phân đoạn bằng sắc ký cột.
    • Tạp D của amlodipin: Oxy hóa chất trung gian phthaloyl amlodipin bằng tác nhân $SiO_2 - HNO_3$ trong dicloromethan (DCM), sau đó thủy phân loại bỏ nhóm phthaloyl bằng dung dịch hydrazin trong methanol hoặc dung dịch methylamin.
    • Tạp A của nifedipin: Oxy hóa nifedipin bằng acid nitric ($HNO_3$) kết hợp chất mang $SiO_2$.
    • Tạp B của nifedipin: Quang oxy hóa dung dịch nifedipin dưới bức xạ tử ngoại (UVA).
  • Phương pháp xác định cấu trúc và tính chất hóa lý:
    • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): Đo trên máy Shimadzu Prestige-21 và Thermo Scientific iS50 FT-IR.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$): Đo trên máy Bruker Z115310/MSC10195.
    • Phổ khối lượng (LC-MS IT-TOF): Đo trên hệ thống Shimadzu LC-MS IT-TOF.
    • Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC): Xác định độ tinh khiết trên máy DSC Q20 (TA Instruments).
    • Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA): Xác định hàm ẩm và dung môi tồn dư.
    • Đo năng suất quay cực: Máy Kruss Optronic.
  • Phương pháp sắc ký và thẩm định:
    • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-PDA, HPLC-UV-Vis): Hệ thống Shimadzu LC-2030C3D, CBM-20A/SPD-M20A; cột Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).
    • Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn ICH: Tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính (miền giá trị), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng (tỷ lệ phục hồi), độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian).

Nguồn nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu và chất chuẩn sử dụng gồm: Captopril (chuẩn Viện KN thuốc TP.HCM 99,09%; nguyên liệu Ch.Pharmaceutical 100,65%), 7-ADCA (chuẩn EP 99,5%), D-phenylglycin (chuẩn Sigma 99%), Dehydronifedipin (chuẩn USP 99,5%), Dehydronitrosonifedipin (chuẩn USP 99,5%), Amlodipin (chuẩn Viện KN thuốc TP.HCM 100%; nguyên liệu Ercros 99,5%), D-amlodipin (chuẩn LGC 91,5%), Nifedipin (chuẩn Viện KN thuốc TP.HCM 99,5%; nguyên liệu Moehs 99%), Cephalexin (nguyên liệu Lupin 99,5%), Phthaloyl amlodipin (nguyên liệu Changzhou Ruiming 99,79%).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp cơ sở lý thuyết về 6 tạp chất liên quan, enzym Penicillin G acylase (PGA) và kỹ thuật cố định hóa enzym trên chất nền polymer. Phân tích chi tiết quy định và phương pháp kiểm nghiệm tạp chất theo DĐVN V, BP 2019, USP 43, EP 9. Đồng thời, chương này trình bày hệ thống nguyên tắc thiết lập, quản lý, phân phối và đánh giá lại chất chuẩn đối chiếu gốc (PCRS) và thứ cấp (SCRS) theo quy định của WHO và ASEAN, làm căn cứ khoa học cho các nội dung thực nghiệm của đề tài.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết thông số kỹ thuật của các đối tượng nghiên cứu, hóa chất, dung môi, chất chuẩn tham chiếu và hệ thống trang thiết bị phân tích (HPLC-PDA, LC-MS IT-TOF, NMR, FT-IR, DSC, TGA, Phân cực kế). Trình bày chi tiết thiết kế thí nghiệm Box-Behnken phục vụ tối ưu hóa điều kiện tổng hợp captopril disulfid; quy trình thủy phân sinh học bằng enzym PGA; quy trình tổng hợp hóa học và quang hóa các tạp chất của amlodipin và nifedipin; quy trình đóng lọ và đánh giá độ đồng nhất lọ; phương pháp thống kê Robust Algorithm A; cùng phương pháp thẩm định đầy đủ quy trình kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn chất lượng.

Chương 3. Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được trên từng nội dung:

  • Tổng hợp và tối ưu hóa quy trình điều chế 6 tạp chất:
    • Captopril disulfid: Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân oxy hóa gồm $FeCl_3$, $I_2$, $KI$, $KMnO_4$, $K_2Cr_2O_7$ và $H_2O_2$. Bố trí thí nghiệm Box-Behnken bậc hai với các biến số nồng độ và thể tích $H_2O_2$, thời gian phản ứng để tối ưu hóa hiệu suất toàn quy trình.
    • 7-ADCA và D-phenylglycin: Đánh giá quá trình thủy phân cephalexin bằng acid, kiềm và enzym PGA cố định hóa trong môi trường đệm phosphat pH 8,0. Tách chiết và tinh chế hai sản phẩm bằng kỹ thuật sắc ký cột, thu được 7-ADCA và D-phenylglycin riêng biệt.
    • Tạp D của amlodipin: Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng hỗn hợp $SiO_2 - HNO_3$ và thời gian phản ứng oxy hóa phthaloyl amlodipin; so sánh hiệu quả thủy phân loại nhóm bảo vệ giữa xúc tác methylamin và hydrazin để thu sản phẩm tinh chế D amlodipin.
    • Tạp A và Tạp B của nifedipin: Xác định hiệu suất tổng hợp tạp A bằng phản ứng oxy hóa với $SiO_2 - HNO_3$ và tạp B bằng phản ứng quang hóa dưới đèn UVA.
  • Xác định cấu trúc và đánh giá độ tinh khiết:
    • Cấu trúc của cả 6 tạp chất được xác nhận phù hợp bằng phổ $^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$, FT-IR và LC-MS IT-TOF.
    • Thẩm định tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác của quy trình HPLC xác định độ tinh khiết.
    • Kết hợp xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) và xác định hàm ẩm/dung môi tồn dư bằng phương pháp nhiệt trọng lượng (TGA).
  • Thiết lập chất chuẩn đối chiếu và xử lý thống kê liên phòng:
    • Đóng gói mẫu vào các lọ đơn liều, đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ sau đóng gói.
    • Phân tích thống kê kết quả thử nghiệm liên phòng giữa các phòng thí nghiệm độc lập theo thuật toán Robust Algorithm A để tính độ không đảm bảo đo ($U_{bb}$) và xác định giá trị ấn định (GTAĐ) cho từng tạp chuẩn.
  • Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng kiểm nghiệm:
    • Xây dựng và thẩm định quy trình HPLC định lượng tạp captopril disulfid trong nguyên liệu và viên nén captopril (tính phù hợp hệ thống, LOD, LOQ, độ đúng, độ lặp lại).
    • Kiểm tra tính phù hợp hệ thống của các quy trình phân tích 7-ADCA, D-phenylglycin trong nguyên liệu và thành phẩm cephalexin; tạp D trong nguyên liệu và viên nén amlodipin; tạp A và B trong nguyên liệu và viên nang nifedipin.
    • Ứng dụng các tạp chuẩn đã thiết lập để kiểm tra hàm lượng tạp chất liên quan trên các mẫu nguyên liệu và chế phẩm thương mại đang lưu hành trên thị trường.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Về phương pháp tổng hợp và điều chế: Đã xây dựng hoàn chỉnh 6 quy trình tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm cho các tạp chất: captopril disulfid (ứng dụng mô hình tối ưu hóa Box-Behnken), 7-ADCA và D-phenylglycin (ứng dụng xúc tác sinh học enzym Penicillin G acylase cố định hóa), tạp D của amlodipin (qua phản ứng oxy hóa và khử nhóm bảo vệ phthaloyl), tạp A của nifedipin (oxy hóa hóa học với $SiO_2 - HNO_3$) và tạp B của nifedipin (quang phân tử ngoại UVA).
  2. Về tiêu chuẩn hóa và thiết lập chất chuẩn: Đã xây dựng bộ dữ liệu phân tích hóa lý toàn diện (phổ FT-IR, $^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$, MS, sắc ký HPLC-PDA, nhiệt phân tích DSC, TGA) để xác định cấu trúc và độ tinh khiết cho 6 tạp chất. Đã thực hiện đóng gói, kiểm tra độ đồng nhất lọ và tính toán giá trị ấn định kèm độ không đảm bảo đo bằng thuật toán Robust Algorithm A qua thử nghiệm liên phòng, thiết lập thành công 6 tạp chuẩn đạt yêu cầu chất đối chiếu thứ cấp (SCRS).
  3. Về phương pháp kiểm nghiệm và ứng dụng thực tiễn: Đã xây dựng và thẩm định đầy đủ quy trình HPLC định lượng tạp captopril disulfid trong nguyên liệu và thành phẩm. Đã ứng dụng bộ 6 tạp chuẩn tự thiết lập vào công tác kiểm tra, định lượng tạp chất liên quan trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm thương mại (captopril, cephalexin, amlodipin, nifedipin) đang lưu hành trên thị trường Việt Nam.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đề xuất đưa quy trình tổng hợp và bộ dữ liệu phân tích của 6 tạp chuẩn vào áp dụng tại các Viện Kiểm nghiệm thuốc nhằm chủ động nguồn tạp đối chiếu trong nước, giảm bớt chi phí nhập khẩu chất chuẩn từ nước ngoài.
  • Ứng dụng các quy trình HPLC đã thẩm định vào tiêu chuẩn cơ sở của các nhà máy sản xuất thuốc generic trong nước để kiểm soát chặt chẽ chỉ tiêu tạp chất liên quan trong nguyên liệu đầu vào và thành phẩm lưu hành.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của luận án: Quy trình tổng hợp các tạp chất mới được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm; đối tượng nghiên cứu tập trung vào 6 tạp chất đại diện của 4 hoạt chất (captopril, cephalexin, amlodipin, nifedipin); dữ liệu độ ổn định dài hạn của các lô chất chuẩn đóng lọ cần tiếp tục được theo dõi theo chu kỳ quy định.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Mở rộng quy mô tổng hợp (pilot) để nâng cao sản lượng điều chế các tạp chất đối chiếu.
    • Tiếp tục chương trình đánh giá lại độ ổn định định kỳ (chu kỳ 1–3 năm) của 6 tạp chuẩn đã thiết lập theo đúng hướng dẫn của ASEAN và WHO.
    • Nghiên cứu mở rộng tổng hợp và thiết lập thêm các tạp chất liên quan khác của các nhóm thuốc kháng sinh, tim mạch đang được sản xuất phổ biến tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

  • Cơ quan kiểm nghiệm thuốc (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, Trung tâm Kiểm nghiệm các tỉnh/thành phố): Tham khảo quy trình thiết lập chất chuẩn thứ cấp, phương pháp xử lý dữ liệu liên phòng bằng thuật toán Robust Algorithm A và quy trình phân tích HPLC xác định tạp chất liên quan.
  • Cơ sở sản xuất dược phẩm: Tham khảo quy trình tổng hợp, tinh chế và phương pháp kiểm soát tạp chất liên quan trong nguyên liệu và thành phẩm chứa captopril, cephalexin, amlodipin, nifedipin theo tiêu chuẩn Dược điển.
  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên chuyên ngành Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc: Sử dụng làm tài liệu tham khảo về mô hình tối ưu hóa Box-Behnken trong hóa dược, ứng dụng xúc tác sinh học enzym PGA cố định hóa, kỹ thuật phân tích cấu trúc phổ nghiệm ($^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$, MS, FT-IR) và các phương pháp phân tích nhiệt (DSC, TGA).

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp enzym PGA cố định hóa được ứng dụng như thế nào trong việc điều chế 7-ADCA và D-phenylglycin?
Trả lời: Luận án sử dụng enzym Penicillin G acylase (PGA) cố định hóa trên chất nền polymer (hoạt tính 265 unit/g) để xúc tác phản ứng thủy phân chọn lọc liên kết amid của cephalexin trong môi trường dung dịch đệm phosphat pH 8,0. Hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng được phân tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột để thu hồi đồng thời hai tạp chất tinh khiết là 7-ADCA và D-phenylglycin.

2. Mô hình thống kê Box-Behnken đóng vai trò gì trong quy trình tổng hợp captopril disulfid?
Trả lời: Mô hình Box-Behnken kiểu bề mặt đáp ứng được sử dụng để khảo sát và tối ưu hóa đồng thời các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng oxy hóa captopril bằng tác nhân hydrogen peroxyd ($H_2O_2$ 30%), giúp xác định điều kiện tối ưu để đạt hiệu suất phản ứng và hiệu suất toàn quy trình cao nhất theo mô hình toán học dự đoán.

3. Tạp D của amlodipin được tổng hợp và tinh chế qua các giai đoạn trung gian nào?
Trả lời: Tạp D của amlodipin được điều chế từ nguyên liệu phthaloyl amlodipin thông qua phản ứng oxy hóa vòng 1,4-dihydropyridin bằng hỗn hợp tác nhân $SiO_2 - HNO_3$ trong dung môi dicloromethan (DCM) để tạo sản phẩm trung gian 3-ethyl 5-methyl 2-[(2-(phthalimido)ethoxy)]-4-(2-clorophenyl)-6-methylpyridin-3,5-dicarboxylat. Sau đó, nhóm bảo vệ phthaloyl được loại bỏ bằng phản ứng thủy phân với dung dịch hydrazin trong methanol hoặc dung dịch methylamin để tạo thành tạp D amlodipin tự do.

4. Hai tạp chất A và B của nifedipin được tạo thành qua các cơ chế oxy hóa khác nhau như thế nào?
Trả lời: Tạp A của nifedipin (dehydronifedipin) được hình thành thông qua phản ứng oxy hóa hóa học vòng 1,4-dihydropyridin của nifedipin bằng tác nhân acid nitric trên chất mang silica gel ($SiO_2 - HNO_3$). Trong khi đó, tạp B của nifedipin (dehydronitrosonifedipin) được tạo thành thông qua phản ứng quang oxy hóa dung dịch nifedipin dưới tác động của bức xạ tử ngoại bước sóng dài (UVA), chuyển nhóm nitro ($-NO_2$) thành nhóm nitroso ($-NO$) gắn trên vòng pyridin.

5. Giá trị ấn định (GTAĐ) và độ không đảm bảo đo của các tạp chuẩn được xác định bằng phương pháp nào?
Trả lời: Các tạp chất sau khi tổng hợp, tinh chế và đóng lọ được gửi phân tích liên phòng tại các phòng thí nghiệm độc lập. Dữ liệu phân tích độ tinh khiết thu được từ các phòng thí nghiệm được xử lý thống kê bằng thuật toán Robust Algorithm A theo tiêu chuẩn ISO 13528 / ISO 5725-5 để loại trừ các giá trị ngoại lai, xác định giá trị trung bình ấn định và độ không đảm bảo đo ($U_{bb}$) trước khi công bố chứng chỉ phân tích cho tạp chuẩn đối chiếu thứ cấp (SCRS).

Kết luận

Luận án đã hoàn thành việc xây dựng quy trình tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm cho 6 tạp chất đối chiếu gồm captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và tạp B của nifedipin. Toàn bộ các sản phẩm điều chế đều được xác định cấu trúc bằng hệ thống phổ nghiệm FT-IR, NMR, LC-MS và đánh giá độ tinh khiết bằng các phương pháp độc lập HPLC-PDA, DSC, TGA. Kết quả thử nghiệm liên phòng và xử lý thống kê theo thuật toán Robust Algorithm A đã thiết lập thành công 6 tạp chuẩn đạt yêu cầu chất đối chiếu thứ cấp theo hướng dẫn của WHO và ASEAN. Các quy trình phân tích HPLC đã được thẩm định đầy đủ và ứng dụng hiệu quả trong việc kiểm tra, định lượng tạp chất liên quan trên các mẫu nguyên liệu và chế phẩm thương mại đang lưu hành trên thị trường.