CHƯƠNG 1 MỞ DAU 1. Đặt van dé Bacteriocin là những hợp chất có bản chat protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất. Bacteriocin được tìm thay trong hau hết các loại vi khuẩn nhưng chỉ có một số loài trong chúng được nghiên cứu ki¡ Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tong hợp gây tử vong, phô hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất Nisin, bacteriocin đầu tiên của vi khuẩn Gram dương được phát hiện vào năm 1928, được tách và xác định tính chất vào năm 1971. Mặc dù nisin đã được sử dụng như một hợp chất kháng khuẩn trong thực phẩm ở các nước khác kế từ năm 1950 nhưng đến năm 1988 FDA chấp thuận cho sử dung nisin trong quá trình khử trùng Pasteur cho phô mai, tạo thành sự kiện chính thức hợp pháp ở ML trong ứng dung bacteriocin như là chất phụ gia thực phẩm.
Từ đó đến nay, nisin đã được sử dụng như chất bảo quản thực phẩm trong hơn 50 uốc gia, đặc biệt với các sản phẩm từ sữa. Hiện nay các bacteriocin sản sinh bởi Lactic Acid Bacteria (LAB) được quan tâm nhiều nhất vì LAB được coi là vi khuẩn an toàn khi được sử dụng trong các thực phẩm lên men. Các bacteriocin san sinh bởi LAB có những ứng dụng quan trọng trong bao quản thực phẩm, bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được nghiên cứu nhiều nhất trên thế giới. Việc thương mại hóa các sản phẩm bacteriocin là rất cần thiết.
Dé có thé đưa vào sản xuất công nghiệp và có thể ứng dụng rộng rãi cần tạo chế phẩm. Hiện tại ở Việt Nam các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập giống có hoạt tính, thu nhận dịch bacteriocin, xác định hoạt tính chứ chưa tối ưu hóa phân tạo chế phẩm để đưa vào sản xuât và thương mại. Luận văn thạc sĩ Tổng quan Từ thực tế trên chúng tôi chọn thực hiện đề tài “Tối ưu hóa các điều kiện say phun tao chế phẩm dang bột bacteriocin có nguồn gốc từ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus”. Day cũng là nghiên cứu tiếp nối các nghiên cứu đã công bố trước đây của nhóm.
Mục tiêu nghiên cứu: Đề tài thực hiện nhằm 2 mục đích chính - Ti ưu hóa điều kiện thu nhận chế phẩm bacteriocin bằng phương pháp sấy phun. - _ Kiểm tra hoạt tính và theo dõi thời gian bảo quản chế phẩm. Noi dung nghiên cứu - Khao sát một số đặc tính của dich bacteriocin Khảo sát khả năng chịu nhiệt Khao sát khả năng chịu NaCl Khảo sát khả năng chịu pH - Khao sát các yếu tổ ảnh hưởng đến hoạt tính bacteriocin trong quá trình say phun Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sây đến hoạt tính bacteriocin Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin đến tỷ lệ thu hồi và hoạt tính bacteriocin. Khao sat anh huong cua tốc độ bom nhập liệu đến hoạt tính bacteriocin - _ Tối ưu hóa các điều kiện say phun bằng quy hoạch thực nghiệm - Theo dõi thời gian bảo quản chế phẩm bacteriocin.
Luận văn thạc sĩ Tổng quan CHƯƠNG 2 TONG QUAN 217Tn uanvé a e io in 2. Gidi hiệu Bacteriocin là những hop chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tong hợp va có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất [27], [35]. Bacteriocin được tong hop bởi vi khuan Gram âm va vi khuân Gram dương với những đặc điêm: - Bacteriocin do vi khuẩn Gram âm tong hợp: gồm nhiều loại protein khác nhau về kích thước, nguồn gốc vi sinh vật, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu nhiều nhất là Colicin do vi khuẩn Escherichia coli tông hợp.
ha năng ức chế của bacteriocin do vi khuẩn Gram âm tong hợp yếu hơn bacteriocin do vi khuẩn Gram dương. - Bacteriocin do vi khuẩn Gram dương tong hợp: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm. Chúng khác với bacteriocin của vi khuẩn Gram âm ở những điểm sau: việc tao bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tong hop bacteriocin của vi khuẩn Gram dương can nhiều gen hơn ở vi khuân Gram âm. Bacteriocin khác với kháng sinh ở những điêm sau: * Được tong hợp nhờ ribosome Y Tế bao chủ miễn dịch với chúng Y Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh * Pho kháng khuẩn hẹp [27].
Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, LAB được uan tâm nhiều do bacteriocin của LAB có phố kháng khuẩn rộng. Luận văn thạc sĩ Tổng quan 2. Phân loại Bacteriocin do LAB sản xuất được chia thành lớp: Lop I: (Lantibiotic) những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chịu nhiệt, hoạt động trên câu trúc màng. Lantibiotic chứa những acid amin hiêm (lanthionine, 3 — methyllanthionine) và một số acid amin khử nước.
Lantibiotic có thé được chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm cấu trúc và chức năng: v Lớp Ia: là những peptide tích điện dương, gồm từ 21-38 acid amin. Những peptide này hoạt động chủ yếu do sự phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào đích. Có thé chia Lantibiotic thành hai phân nhóm dựa trên kích thước, điện tích và trình tự leader peptide. Lớp Ib: là những phân tử peptide hình cau, có thé chứa đến 19 acid amin.
Hoạt động chủ yếu của chúng là phá vỡ chức năng của các enzyme như ức chế việc sinh tong hợp vách tế bao của tế bao đích. Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong ua trình trưởng thành để phóng thích peptide hoạt hóa. Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) gồm những phân tử peptide hoạt động ở mang tế bao, không chứa lanthionine và bền nhiệt, gồm 30-60 acid amin. Bacteriocin lớp II có phố kháng khuẩn hẹp.
Lớp II có thé chia thành 3 phân lớp: v Lop Ha: rat da dang, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu N và hoạt tính khang Listeria. v Lớp IIb: những bacteriocin lớp nay cần có sự kết hop của hai peptide trong hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoan chỉnh. Trong hầu hết các trường hop, các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tinh bacteriocin nhưng hoạt tính sẽ cao hơn khi có sự diện cua peptide thứ hai. Lop IIc: bacteriocin phụ thuộc nhân tô sec-.
Phân tử bacteriocin lớp IIc được đưa ra ngoai tế bào xuyên ua mang tế bao chất bang con đường tiết phụ thuộc nhân tô sec-. Luận văn thạc sĩ Tổng quan Bacteriocin lớp Ha có tiềm năng ứng dung trong uy mô công nghiệp nhờ khả năng kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được uan tâm nhiều hơn các bacteriocin lớp I (Nisin) do chúng có phố kháng khuẩn không rộng, không tiêu diệt những chủng khởi động. Pediocin PA-1 là một vi dụ điển hình và được nghiên cứu phô biến nhất trong số các bacteriocin lớp Ila. Lớp IHII: là những phân tử protein lớn (>30kDa), bền nhiệt.
Lớp này gồm những enzyme ngoại bao (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh | cua bacteriocin. Bacteriocin thuộc lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus. Lop IV: là những bacteriocin phức hop, ngoài protein còn có thêm lipid va cacbohydrate. Hiện nay van còn nhiều điều chưa biết về cau trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nao được tinh sạch.
Bacteriocin lớp IV là kết ua của sự tương tác đặc tính ky nước và tích điện dương của bacterocin với các phân tử khác trong dịch thô. Lớp nay bao gồm ca glycoprotein hoặc lipoprotein. Vi dụ như leuconocin S và lactocin 27. Trong 4 lớp trên thi bacteriocin của lớp I và lớp II rất phong phú và có tiềm năng thương mại.
Trong các ching LAB thi Lactococcus lactis được uan tâm nghiên cứu rat nhiều, một số chủng Lc.lactis có khả năng sinh tổng hop bacteriocin. Bacteriocin do Lc.lactis gồm hai loại: lantibiotic và các bacteriocin kích thước nhỏ, bền nhiệt không phải lantibiotic. Lactococcus có kha năng sinh tông hop nisin — bacteriocin duy nhất được TỔ chức nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm. Nisin sẽ phá vỡ chức năng vận chuyển của mảng tế bảo và tế bao chất thoát ra ngoài, nó có khả năng chống cả vi khuân Gram âm lẫn vi khuẩn Gram dương.
ức chế sự hình thành bảo tử. Nisin có phố kháng khuẩn rộng đối với hầu hết các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, té bào dinh dưỡng của Bacillus spp. va Clostridium spp. cũng như ức chế nảy chổi của bào tử các loài Bacillus va Clostridium [35].
Luận văn thạc sĩ Tổng quan Ngoài lantibiotic, Lactococcus lactis con có khả năng sinh tổng hợp những phân tử bacteriocin kích thước nhỏ và bền nhiệt, điển hình là lactococin A, lactococin B va lactococin M. Lactococin có phố kháng khuẩn hep hon nisin, chúng chỉ có thé ức chế những chủng Lactococcus khác với chủng sản xuất. Đặ điểm sinh lý, sinh hóa ta a e io indoLABsinh n hợp Đề thực hiện hoạt tinh gây chết, các bacteriocin thuộc lớp I và II phải thỏa mãn hai yêu câu: tích điện dương va ky nước. Hau hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3-9.
Thậm chí acidocin B có thé hoạt động ở pH 11. Ở điểm đăng điện cao cho phép chúng tương tác với bề mặt tích điện âm của tế bào vi khuẩn. Đối với các bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, các hợp chất cần thé nhận sẽ gắn phan ky nước vào mảng vi khuẩn. Sự liên kết các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng làm mất gradient và gây chết tế bào.
Tính chịu nhiệt cũng là những đặc điểm chính của bacteriocin trong lượng thấp. Các liên kết monosulfit và disulfit trong phân tử cảng nhiều thì phân tử peptide càng 6n định. Hầu hết dịch nỗi tế bào của chủng sinh bacteriocin van còn hoạt tính khi xử | nhiệt hoặc hấp khử trùng bang nồi hấp áp lực. Tuy nhiên, một vai loại bacteriocin tao bởi một số chủng Lactobacillus như helvetiein bị bất hoạt khi xử l nhiệt 60-100°C trong 10 - 15 phút.
Quá inhsinh n hợp a e io in * Cum ensinh n hợp bacteriocin Sự sinh tổng hop bacteriocin nhờ vào một cau trúc gen bao gồm bốn gen khác nhau mã hóa chức năng cơ bản cho việc sản xuất chất kháng khuẩn ngoại bảo. Bốn gen đó bao gồm: (1) Gen cấu trúc mã hóa các prebacteriocin (2) Gen miễn dịch luôn luôn năm kế gen bacteriocin và trên cùng đơn vị transcription. (3) Gen mã hóa ABC-transporter có chức năng vận chuyên bacteriocin ra ngoài.