Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất Alcaloid từ Hoàng Bá - Thái Doãn Hoàng Anh

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất các alcaloid giá trị từ vỏ thân Hoàng Bá (Phellodendron amurense), ứng dụng trong ngành dược.

• Tác giả: Thái Doãn Hoàng Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thu Hằng
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Tối ưu hóa chiết xuất Alcaloid từ vỏ thân Hoàng Bá (Phellodendron amurense Rupr.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Hoàng Bá và Thành phần Alcaloid

Hoàng Bá (Phellodendron amurense Rupr.) là một loài thực vật quý có giá trị cao trong dược liệu truyền thống. Vỏ cây Hoàng Bá chứa nhiều hoạt chất sinh học quan trọng, đặc biệt là các alcaloid như jatrorrhizin, palmatin và berberin. Những alcaloid trong vỏ cây Hoàng Bá được biết đến với tác dụng kháng khuẩn, chống viêm và hỗ trợ tiêu hóa. Việc tối ưu hóa chiết xuất alcaloid từ vỏ cây Hoàng Bá là một vấn đề trọng tâm trong nghiên cứu dược liệu hiện đại. Qua các nghiên cứu khoa học, các nhà dược học đã xác định rõ thành phần và tác dụng của những alcaloid này, tạo nền tảng cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm chất lượng cao từ Hoàng Bá.

1.1. Đặc điểm thực vật và bộ phận dùng

Hoàng Bá là một loài cây gỗ thuộc họ Rutaceae, phân bố chủ yếu ở các vùng ôn đới. Bộ phận được khai thác chủ yếu là vỏ thân Hoàng Bá, có màu vàng nâu đặc trưng. Vỏ cây Hoàng Bá được thu hoạch vào mùa xuân hoặc mùa thu, sau đó được phơi khô để sử dụng. Chất lượng vỏ Hoàng Bá phụ thuộc vào độ tuổi của cây và điều kiện sinh trưởng.

1.2. Thành phần hoạt chất chính

Alcaloid trong Hoàng Bá bao gồm ba hợp chất chính: berberin, jatrorrhizin và palmatin. Những alcaloid này chiếm khoảng 1-5% khối lượng khô của vỏ cây. Berberin được xem là alcaloid quan trọng nhất với hàm lượng cao nhất. Các alcaloid trong vỏ Hoàng Bá có cấu trúc protoberberine điển hình, quyết định tác dụng sinh học của chúng.

II. Phương pháp Chiết xuất Alcaloid Tối ưu

Tối ưu hóa chiết xuất alcaloid từ vỏ cây Hoàng Bá đòi hỏi sự kiểm soát chặt chẽ nhiều thông số kỹ thuật. Phương pháp chiết xuất alcaloid phổ biến nhất sử dụng dung môi ethanol với nồng độ 50-70%. Quá trình chiết xuất bao gồm nhiều bước: chuẩn bị mẫu, chiết xuất, nước và làm khô cao chiết. Các yếu tố ảnh hưởng chính bao gồm nồng độ ethanol, nhiệt độ, thời gian chiết xuất và số lần chiết. Việc lựa chọn đúng các thông số này sẽ quyết định hàm lượng alcaloid trong dịch chiết. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được ứng dụng để tối ưu hóa đồng thời tất cả các biến số, giúp đạt hiệu suất cao nhất.

2.1. Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

Nhiệt độ chiết xuất là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hàm lượng alcaloid trong vỏ Hoàng Bá. Thường nhiệt độ tối ưu dao động từ 50-80°C. Nồng độ ethanol cũng quyết định khả năng hòa tan của alcaloid như berberin và palmatin. Thời gian chiết xuất càng dài, hàm lượng alcaloid trích ly càng cao, nhưng không nên quá dài để tránh phân hủy.

2.2. Phương pháp định lượng alcaloid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chuẩn để định lượng alcaloid trong vỏ Hoàng Bá. Phương pháp sử dụng chất chuẩn ngoại (ESM) hoặc một chất chuẩn (QAMS) đều có thể áp dụng. Jatrorrhizin, palmatin và berberin được tách riêng biệt và đo đạc với độ chính xác cao, giúp xác định chính xác hàm lượng alcaloid trong mỗi mẫu.

III. Quy trình Tối ưu hóa bằng Phương pháp RSM

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là công cụ mạnh mẽ để tối ưu hóa chiết xuất alcaloid đồng thời. Quy trình tối ưu hóa bắt đầu bằng thiết kế thí nghiệm có hệ thống, trong đó các biến số được thay đổi theo kế hoạch thống kê. Mô hình toán học được xây dựng dựa trên dữ liệu thực nghiệm, cho phép dự đoán hàm lượng alcaloid tại bất kỳ tổ hợp thông số nào. Sau khi có mô hình, điều kiện tối ưu được xác định bằng cách tìm điểm cực đại của hàm đáp ứng. Các thông số tối ưu cho chiết xuất alcaloid sau đó được kiểm chứng lại bằng thực nghiệm để đảm bảo độ tin cậy. Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian, nguyên liệu và đạt hiệu quả cao nhất.

3.1. Thiết kế thí nghiệm và xây dựng mô hình

Thiết kế thí nghiệm RSM thường sử dụng thiết kế tâm trực giao (CCD) hoặc thiết kế Box-Behnken. Mỗi biến số như nồng độ ethanol, nhiệt độ, thời gian chiết xuất được thiết lập ở các mức tối thiểu, cơ sở và tối đa. Mô hình đáp ứng bậc hai được sử dụng để mô tả mối quan hệ giữa các biến đầu vào và hàm lượng alcaloid.

3.2. Kiểm chứng và nâng cấp quy mô

Sau khi tìm được điều kiện tối ưu chiết xuất alcaloid, kết quả phải được kiểm chứng bằng thực nghiệm độc lập. Hàm lượng alcaloid trong các mẫu kiểm chứng phải phù hợp với dự đoán của mô hình. Khi quy mô được nâng cấp từ phòng thí nghiệm lên sản xuất, cần điều chỉnh các tham số để bảo đảm hàm lượng alcaloid ổn định.

IV. Ứng dụng và Hướng phát triển Tương lai

Tối ưu hóa chiết xuất alcaloid từ vỏ cây Hoàng Bá có ý nghĩa thực tiễn to lớn trong ngành dược phẩm. Với các điều kiện chiết xuất tối ưu được xác định, các nhà sản xuất có thể tạo ra cao chiết Hoàng Bá có hàm lượng alcaloid cao và ổn định. Điều này mở đường cho phát triển các sản phẩm dược phẩm chất lượng cao từ Hoàng Bá. Ngoài ra, phương pháp tối ưu hóa có thể áp dụng cho các loài dược liệu khác. Hướng phát triển tương lai bao gồm việc sử dụng công nghệ tách chiết tiên tiến hơn, tìm hiểu sâu hơn về cơ chế tác dụng của alcaloid, và phát triển các chế剂mới từ alcaloid trong vỏ Hoàng Bá để tăng hiệu quả điều trị.

4.1. Ứng dụng trong phát triển sản phẩm dược phẩm

Cao chiết Hoàng Bá có hàm lượng alcaloid cao được sử dụng làm nguyên liệu chính trong các thuốc hỗ trợ tiêu hóa, kháng khuẩn. Berberin, jatrorrhizin và palmatin từ vỏ Hoàng Bá được tích hợp vào các chế剂như viên nén, viên capsule hoặc dung dịch. Chất lượng ổn định của hàm lượng alcaloid đảm bảo tính nhất quán và hiệu quả của sản phẩm cuối cùng.

4.2. Nghiên cứu và phát triển tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc sử dụng công nghệ tách chiết xanh để giảm tác động môi trường. Tối ưu hóa chiết xuất alcaloid với các dung môi thay thế, sinh học phân hủy được là hướng đi tiến tiến. Ngoài ra, khám phá tác dụng sinh học của alcaloid trong các bệnh lý mới sẽ mở rộng ứng dụng của Hoàng Bá.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hoàng bá được khai thác từ vỏ thân và vỏ cành cây Quan Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.) hoặc cây Xuyên Hoàng bá (Phellodendron chinense Schneid. Các nghiên cứu hiện đại đã làm sáng tỏ nhiều tác dụng sinh học đa dạng của Hoàng bá, nổi bật như: chống viêm [7-9], kháng khuẩn [7, 10], kháng nấm [7, 11], kháng virus [7, 12], chống khối u trên thực nghiệm [7, 13], chống oxy hóa [7] và bảo vệ gan [14]. Đặc biệt, cả Quan Hoàng bá và Xuyên Hoàng bá đều cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh [15-17], tuy nhiên Quan Hoàng bá được chứng minh có hiệu quả tốt đối với bệnh Alzheimer nhờ tác dụng chống lại độc tính thần kinh do beta-amyloid vượt trội hơn Xuyên Hoàng bá [17] cũng như tác dụng hiệp đồng của các alcaloid trong dược liệu như berberin-palmatin và berberin-jatrorrhizin đối với enzym acetyl cholinesterase [16]. Một yếu tố góp phần vào sự khác biệt về hoạt tính sinh học giữa hai loài chính là sự khác biệt về thành phần hóa học: hàm lượng berberin trong Xuyên Hoàng bá cao gấp 2,5 – 4,0 lần Quan Hoàng bá, trong khi hàm lượng palmatin, jatrorrhizin và các alcaloid khác trong dược liệu này lại rất thấp [1, 2, 17].

Điều này cho thấy, tác dụng dược lý không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng của từng hợp chất riêng lẻ mà còn liên quan đến tác dụng hiệp đồng của các alcaloid trong Quan Hoàng bá như jatrorrhizin, palmatin và berberin [16, 17]. Vì vậy, việc tối ưu hóa quá trình chiết xuất đồng thời ba alcaloid jatrorrhizin, palmatin và berberin trở thành mục tiêu quan trọng, nhằm khai thác tối đa tác dụng tiềm năng của Quan Hoàng bá, đặc biệt trong bối cảnh gia tăng các bệnh lý thần kinh như bệnh Alzheimer. Để xác định hàm lượng các alcaloid trong Quan Hoàng bá, nhiều nghiên cứu đã được quan tâm và triển khai với quy mô ngày càng rộng rãi. Trong số đó, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phổ biến, hiệu quả và có độ chính xác cao được ứng dụng để định lượng các hoạt chất trong Quan Hoàng bá [7, 18, 19].

Phương pháp sử dụng chất chuẩn ngoại (External Standards Method – ESM) là phương pháp định lượng thường được sử dụng trong HPLC. Tuy nhiên, việc yêu cầu sử dụng nhiều chất chuẩn khác nhau để phân tích nhiều hợp chất trong dược liệu đã làm gia tăng chi phí và gặp khó khăn do nguồn cung cấp chất chuẩn hạn chế [20-22], đặc biệt trong nghiên cứu phân tích dược liệu có nhiều thành phần hóa học phức tạp như Quan Hoàng bá. Nhằm khắc phục những hạn chế trên, phương pháp định lượng đa thành phần thông qua một chất chuẩn (Quantitative Analysis of Multi-Components by Single Marker – QAMS) đã được phát triển. Phương pháp sử dụng duy nhất một chất chuẩn để định lượng đồng thời nhiều hợp chất trong cùng một mẫu dược liệu dựa trên hệ số hiệu chỉnh tương đối [22].

Phương pháp này đã được đưa vào áp dụng trong chuyên luận Hoàng 1 liên (Coptidis Rhizoma) của các ấn phẩm lớn như Dược điển Hoa Kỳ (USP 43-NF 38) [23] và Dược điển Trung Quốc 2020 [2], mở ra hướng đi mới cho việc kiểm soát chất lượng dược liệu một cách tiết kiệm và hiệu quả hơn. Đồng thời, đây cũng là một giải pháp nhằm khắc phục tình trạng khan hiếm các chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm, tiêu chuẩn hóa dược liệu và chế phẩm từ dược liệu. Do đó, nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng các alcaloid thông qua một chất chuẩn (QAMS) trong Quan Hoàng bá là cần thiết, góp phần nâng cao hiệu quả phân tích, tiết kiệm chi phí và chất chuẩn, có khả năng ứng dụng thực tiễn trong phân tích, kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu. Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất alcaloid từ vỏ thân Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.)” được thực hiện, là cơ sở để phát triển các sản phẩm từ dược liệu Quan Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.

Đề tài được thực hiện với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng jatrorrhizin, palmatin và berberin trong Quan Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.) bằng phương pháp sử dụng chất chuẩn ngoại (ESM) và phương pháp định lượng đa thành phần thông qua một chất chuẩn (QAMS) dựa trên kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tối ưu hóa chiết xuất ba alcaloid jatrorrhizin, palmatin và berberin trong Quan Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr. Tổng quan về Quan Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.) Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [24, 25] vị trí phân loại của loài Phellodendron amurense Rupr.

là: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Phân lớp: Rosidae Bộ: Rutales Họ: Rutaceae Chi: Phellodendron Trên thế giới, chi Phellodendron đã được ghi nhận gồm 13 loài [26], bao gồm: Phellodendron amurense Rupr., Phellodendron chinense Schneid., Phellodendron sachalinense Sarg., Phellodendron insulare Nakai, Phellodendron amurense f.Zhu, Phellodendron piriforme E.Wolf, Phellodendron kodamanum Makino, Phellodendron nikkomontanum Makino, Phellodendron fargesii Dode, Phellodendron macrophyllum Dode, Phellodendron sinense Dode, Phellodendron sinii Y.Wu, Phellodendron sachalinense f. Trong đó, hai loài được khai thác sử dụng phổ biến là Phellodendron amurense Rupr. (Quan Hoàng bá) và Phellodendron chinense Schneid. Theo Dược điển Việt Nam V [1] và Dược điển Trung Quốc 2020 [2], dược liệu Hoàng bá có tên khoa học là Cortex Phellodendri, được khai thác từ vỏ thân và vỏ cành của cây Quan Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.) hoặc cây Xuyên Hoàng bá (Phellodendron chinense Schneid.

Quan hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.): Trong phép định lượng bằng phương pháp HPLC, sắc ký đồ của dung dịch thử xuất hiện hai pic có thời gian lưu tương ứng với các pic của berberin clorid và palmatin clorid trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Theo Dược điển Việt Nam V, hàm lượng berberin clorid không được ít hơn 0,33% tính theo dược liệu khô kiệt [1]. Hàm lượng berberin clorid không ít hơn 0,60% và hàm lượng palmatin clorid không ít hơn 0,30% tính theo dược liệu khô kiệt theo Dược điển Trung Quốc 2020 [2]. Xuyên Hoàng bá (Phellodendron chinense Schneid.): Trong phép định lượng bằng phương pháp HPLC, sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic của berberin clorid và không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic palmatin clorid.

Hàm lượng berberin clorid tính theo dược liệu khô kiệt không ít hơn 2,5% theo Dược điển Việt Nam V [1] và không ít hơn 3,0% theo Dược điển Trung Quốc 2020 [2]. Đặc điểm thực vật Quan Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.) là loại cây thân gỗ, to cao, sống nhiều năm. Cây có chiều cao từ 20 – 30 m, đường kính thân có thể đạt tới 70 cm. Toàn thân và cành bao bọc một lớp vỏ dày màu xám, mặt trong vỏ có màu vàng.

Lá mọc đối, kép gồm có 5 – 13 lá chét hình trứng, dài 6 – 12 cm, rộng 2,5 – 4,5 cm, mép nguyên. Hoa mọc thành cụm, hoa nhỏ màu vàng. Quả mọng, hình cầu, khi chín có màu tím, bên trong chứa từ 2 – 5 hạt có kích thước 6 x 3 mm [3, 27]. Phân bố Cây Quan Hoàng bá mọc tự nhiên nhiều trong các khu rừng rậm tập trung ở các khu vực Châu Á như Trung Quốc, Nga, Đài Loan, Triều Tiên và Nhật Bản.

Ở Việt Nam, dược liệu Quan Hoàng bá chủ yếu nhập từ Trung Quốc (vùng Hắc Long Giang, Hà Bắc, Tứ Xuyên, Vân Nam, Quý Châu) và Nga (vùng Siberi) [3, 27]. Tuy nhiên những năm gần đây, cây Quan Hoàng bá đã được trồng ở Việt Nam để thu hái làm thuốc chữa bệnh tại các vùng như: Lào Cai, Lai Châu, Vĩnh Phúc, Lâm Đồng. Bộ phận dùng, chế biến Bộ phận dùng: Vỏ thân và vỏ cành [1-3]. Chế biến: Cạo sạch vỏ ngoài, chỉ còn một lớp trong dày khoảng 1 cm, sau đó cắt thành từng miếng dài 9 cm, rộng 6 cm, phơi khô dưới ánh nắng hoặc sấy khô [3].

Thành phần hóa học Từ dược liệu Quan Hoàng bá, 105 hợp chất đã được xác định thuộc các nhóm chính là: alcaloid, flavonoid, limonoid, acid quinic [7]. Thông tin về 105 hợp chất trong Quan Hoàng bá được trình bày chi tiết ở Phụ lục 1. ❖ Alcaloid Alcaloid trong Quan Hoàng bá chủ yếu có khung cấu trúc isoquinolin. Trong số các alcaloid, berberin chiếm hàm lượng lớn nhất từ 4,15 – 28,42 mg/g, tiếp sau đó là magnoflorin có hàm lượng từ 3,19 – 16,92 mg/g, palmatin có hàm lượng từ 1,17 – 15,25 mg/g, phellodendrin có hàm lượng từ 0,56 – 5,09 mg/g, jatrorrhizin có hàm lượng trong khoảng 0,07 – 2,05 mg/g và các alcaloid khác [18, 28-30].

Dưới đây là cấu trúc hóa học một số alcaloid điển hình có trong Quan Hoàng bá. Berberin Palmatin Jatrorrhizin Columbamin 4 Phellodendrin Magnoflorin Menisperin Skimmianin Hình 1. Một số alcaloid điển hình trong Quan Hoàng bá Trong đó, ba alcaloid jatrorrhizin, palmatin và berberin được chứng minh có liên quan đến tác dụng bảo vệ và chống thoái hóa thần kinh của Quan Hoàng bá, là mục tiêu quan trọng của đề tài. Các đặc điểm liên quan đến công thức phân tử, trọng lượng phân tử và tính chất vật lý (độ tan) của từng hợp chất được trình bày như sau: • Jatrorrhizin [31, 32] Công thức phân tử: C20H20NO4 Trọng lượng phân tử: 338,38 g/mol Độ tan: tan tốt trong methanol, ethanol, ethanol-nước và nước acid hóa.

• Palmatin [31, 32] Công thức phân tử: C21H22NO4 Trọng lượng phân tử: 352,37 g/mol Độ tan: tan tốt trong methanol, ethanol, ethanol-nước và nước acid hóa. • Berberin [31, 32] Công thức phân tử: C20H18NO4 Trọng lượng phân tử: 336,37 g/mol Độ tan: tan tốt trong methanol, ethanol, ethanol-nước và nước acid hóa. ❖ Flavonoid Flavonoid là nhóm thành phần hóa học có số lượng hợp chất xếp thứ hai trong Quan Hoàng bá bao gồm 14 hợp chất, điển hình như: amurensin, phellamurin, quercetin, phellavin, phellatin và kaempferol. Amurensin Phellamurin Quercetin Hình 1.

Một số flavonoid điển hình trong Quan Hoàng bá ❖ Acid quinic Chín hợp chất của acid quinic đã được ghi nhận trong Quan Hoàng bá, tiêu biểu như: acid 3-O-feruloylquinic, acid chlorogenic và acid neo-chlorogenic. Hàm lượng một số hợp chất trong Quan Hoàng bá đã được nghiên cứu như sau: acid chlorogenic có hàm 5 lượng từ 0,77 – 6,01 mg/g [18], acid 3-O-feruloylquinic 1,14 – 16,23 mg/g [30, 33], acid neo-chlorogenic 0,66 – 5,58 mg/g [30]. Acid 3-O-feruloylquinic Acid neo-chlorogenic Acid chlorogenic Hình 1. Một số acid quinic điển hình trong Quan Hoàng bá ❖ Limonoid Chín hợp chất limonoid đã được xác định trong Quan Hoàng bá, đại diện như: obaculacton, obacunon, kihadanin b và niloticin.

Hai limonoid đã được nghiên cứu xác định hàm lượng trong Quan Hoàng bá là obaculacton có hàm lượng 2,35 – 13,04 mg/g và obacunon có hàm lượng 0,45 – 2,31 mg/g [33]. Obaculacton Obacunon Kihadanin B Niloticin Hình 1. Một số limonoid điển hình trong Quan Hoàng bá ❖ Hợp chất khác Một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong Quan Hoàng bá bao gồm: ba hợp chất glycosid, hai hợp chất lignan, hai hợp chất monosaccharid, herculin, acid ferulic, noricarisid, beta-sitosterol, v.