Khảo sát tính chất vi nang Alginat-Tinh bột cố định enzym Nattokinase

Khóa luận dược sĩ khảo sát tính chất vi nang alginat-tinh bột cố định enzym nattokinase, đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng enzym.

• Tác giả: Trịnh Thị Thùy
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Ngọc Khánh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Khảo sát một số tính chất của vi nang Alginat – Tinh bột cố định enzym Nattokinase
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và Cấu trúc Vi Nang Alginat Tinh Bột Cố Định Nattokinase

Vi nang alginat-tinh bột cố định nattokinase là một hệ thống phân phối dược phẩm tiên tiến được phát triển để bảo vệ và tối ưu hóa hiệu quả của enzyme nattokinase. Nattokinase là một enzyme tuyến tinh được chiết xuất từ natto (thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản) với khả năng hỗ trợ huyết khối hiệu quả. Cấu trúc vi nang alginat được tạo thành từ natri alginat - một polysaccharide thiên nhiên từ tảo nâu, kết hợp với tinh bột để tăng cường tính chất bảo vệ enzyme. Phương pháp cố định này sử dụng các chất mang có khả năng hình thành gel, tạo ra các hạt vi mô có kích thước kiểm soát. Việc áp dụng công nghệ cố định enzyme này giúp nattokinase duy trì hoạt tính sinh học cao hơn, chống lại môi trường acidic của dạ dày và giải phóng từng bước trong ruột non, nơi hấp thu được tối ưu.

1.1. Thành phần Chính của Vi Nang

Natri alginat là thành phần cơ bản tạo nên khung vi nang, có đặc tính hình thành gel khi gặp các ion divalent như calcium. Tinh bột được bổ sung vào để cải thiện tính ổn định cơ học và khả năng bảo vệ enzyme trong điều kiện pH thấp. Nattokinase được phân tán đều trong ma trận alginat-tinh bột, đảm bảo hoạt tính enzyme được bảo tồn. Sự kết hợp các thành phần này tạo nên một hệ thống cố định enzyme hiệu quả, cho phép kiểm soát sự giải phóng dần dần của hoạt chất.

1.2. Quá Trình Hình Thành Vi Nang

Quá trình tạo vi nang alginat-tinh bột bao gồm pha pha trộn dung dịch natri alginat với tinh bột và nattokinase, sau đó nhỏ từng giọt vào dung dịch calcium chloride (CaCl₂). Phản ứng hóa học này dẫn đến hình thành gel ở bề ngoài hạt, tạo một vỏ bảo vệ cứng. Kỹ thuật đông khô được áp dụng để loại bỏ nước và ổn định cấu trúc vi nang. Phương pháp này đảm bảo kích thước hạt đều đặn, điều kiện tối ưu cho cố định nattokinase và bảo vệ enzyme khỏi các yếu tố ngoài.

II. Tính Chất Vật Lý và Hóa Học của Vi Nang

Tính chất vi nang alginat-tinh bột được xác định thông qua các đặc tính vật lý quan trọng. Kích thước hạt vi nang thường nằm trong khoảng từ 50-500 micromet, phụ thuộc vào điều kiện tạo hạt. Độ hút nước của vi nang là một tính chất quan trọng, ảnh hưởng đến khả năng giải phóng enzyme. Khi tiếp xúc với môi trường dịch dạ dày mô phỏng (SGF), vi nang sẽ hút nước và phồng nở, nhưng nhờ vỏ gel alginat chắc chắn, enzyme nattokinase được bảo vệ khỏi sự inactivation do pH thấp. Độ cứng và tính chất cơ học của vi nang được cải thiện bởi sự kết hợp tinh bột, giúp duy trì hình dạng ổn định. Các tính chất này được đánh giá thông qua kính hiển vi điện tử và phương pháp phân tích hình ảnh, đảm bảo chất lượng sản phẩm cố định enzyme đạt tiêu chuẩn.

2.1. Đường Kính và Hình Thái Vi Nang

Đường kính vi nang được xác định bằng kính lúp soi nổi Leica EZ4 hoặc phương pháp phân tích hình ảnh. Vi nang alginat-tinh bột có hình dạng cầu hoặc hình elip đều đặn. Kích thước đồng nhất của hạt vi nang là yếu tố quan trọng trong cố định nattokinase, giúp đảm bảo sự giải phóng enzyme nhất quán. Mặt cắt vi nang quan sát dưới kính hiển vi cho thấy cấu trúc hai lớp rõ ràng: lớp vỏ gel dày và lõi chứa enzyme nattokinase phân tán đều.

2.2. Khả Năng Hút Nước và Phồng Nở

Mức độ hút nước của vi nang trong môi trường SGF là chỉ số quan trọng đánh giá khả năng bảo vệ enzyme. Khi vi nang alginat-tinh bột tiếp xúc với dịch dạ dày, chúng hút nước và phồng nở dần dần. Tuy nhiên, nhờ vỏ alginat chắc chắn, sự thất thoát nattokinase ra ngoài môi trường acidic được ngăn ngừa hiệu quả. Tinh bột giúp giảm tốc độ hút nước và phồng nở, từ đó tối ưu hóa khả năng cố định enzyme trong dạ dày trước khi giải phóng ở ruột non.

III. Khả Năng Bảo Vệ và Giải Phóng Nattokinase

Khả năng bảo vệ nattokinase là mục tiêu chính của công nghệ vi nang alginat-tinh bột cố định. Trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng (SGF) có pH thấp (pH 1.2-3.0), enzyme nattokinase thông thường sẽ bị inactivation nhanh chóng. Tuy nhiên, vỏ gel alginat được tạo thành từ phản ứng giữa alginat và calcium ions tạo ra một rào cản hiệu quả. Kết quả thử nghiệm cho thấy vi nang alginat-tinh bột có thể giữ lại 70-85% hoạt tính nattokinase sau 2 giờ ủ trong SGF. Quá trình giải phóng controlled nattokinase xảy ra ở ruột non, nơi pH tăng lên và các enzyme tiêu hóa hòa tan ma trận alginat. Sự giải phóng dần dần này tối ưu hóa sự hấp thu của enzyme, tăng hiệu quả dược lý so với nattokinase không được bảo vệ. Phương pháp cố định enzyme này đã chứng minh khả năng tăng độ bioprecisely của nattokinase.

3.1. Bảo Vệ Enzyme Trong Môi Trường Dạ Dày

Vòng phân giải casein được sử dụng để đánh giá hoạt tính protease còn lại của nattokinase sau khi ủ trong SGF. Vi nang alginat-tinh bột cho thấy vòng phân giải lớn hơn đáng kể so với nattokinase tự do, chứng tỏ khả năng bảo vệ enzyme xuất sắc. Tinh bột bổ sung tăng cường hiệu quả bảo vệ bằng cách tạo thêm lớp buffer. Kết quả cho thấy sự kết hợp alginat-tinh bột hiệu quả hơn alginat đơn độc trong cố định nattokinase.

3.2. Giải Phóng Enzyme Trong Môi Trường Ruột

Khi vi nang alginat-tinh bột đến ruột non, sự tăng pH và hoạt động của các enzyme tuyến tụy làm phân hủy ma trận alginat, giải phóng nattokinase. Phần trăm giải phóng tăng theo thời gian, đạt 60-75% sau 6 giờ ủ trong dịch ruột mô phỏng (SIF). Sự giải phóng controlled này cho phép nattokinase có thời gian tiếp xúc lâu với vị trí hấp thu tối ưu, nâng cao hiệu quả của cố định enzyme và bioprecisely.

IV. Ứng Dụng Lâm Sàng và Triển Vọng Phát Triển

Vi nang alginat-tinh bột cố định nattokinase có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong phòng chống và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối. Nattokinase trong hệ thống vi nang có khả năng phân giải fibrin, một thành phần chính của cục máu đông, giúp cải thiện lưu thông máu. Công nghệ cố định enzyme này đặc biệt hữu ích cho các bệnh nhân mắc huyết khối tĩnh mạch, đột quỵ ischemic, và các vấn đề về tuần hoàn. So với nattokinase tự do, vi nang alginat-tinh bột giảm tần suất dùng liều và tối ưu hóa tuân thủ điều trị. Các nghiên cứu tiếp theo tập trung vào tối ưu hóa công thức, cải thiện bioavailability, và đánh giá an toàn lâu dài. Công nghệ cố định enzyme này có triển vọng phát triển thành sản phẩm dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

4.1. Ứng Dụng Trong Phòng Chống Huyết Khối

Nattokinase cố định trong vi nang alginat-tinh bột có tác dụng thrombolytic vượt trội nhờ bảo vệ enzyme và giải phóng controlled. Enzyme này có khả năng phân hủy fibrin và tăng hoạt tính plasmin, cơ chế chính giải tán cục máu đông. Ứng dụng lâm sàng bao gồm phòng chống đột quỵ, nhồi máu cơ tim, và huyết khối tĩnh mạch sâu. Hệ thống vi nang giảm tác dụng phụ tiêu hóa so với nattokinase không được bảo vệ.

4.2. Triển Vọng Phát Triển Công Nghệ

Nghiên cứu tương lai tập trung vào tối ưu hóa cô độ tinh bột, cải thiện độ ổn định bảo quản, và phát triển các dạng bào chế khác nhau của vi nang alginat-tinh bột cố định nattokinase. Công nghệ cố định enzyme này có thể được áp dụng cho các enzyme khác, mở rộng khả năng ứng dụng dược phẩm. Phát triển các sản phẩm kết hợp nattokinase với các hoạt chất khác có thể tăng hiệu quả điều trị.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Cấu trúc Nattokinase Nattokinase là enzym làm tan huyết khối, được phát hiện trong Natto (đậu nành lên men – một trong những món ăn truyền thống của Nhật Bản) vào năm 1980 [5]. Nattokinase là một serine protease thuộc họ enzym subtilisin bao gồm một chuỗi polypeptide sợi đơn chứa 275 acid amin (trọng lượng phân tử 27,7 kDa và pI 8,6) và cấu trúc tương đồng với subtilisin [13], [5] Cấu trúc NK không chứa cystein do đó không có liên kết disulfua nội phân tử [43]. Trình tự bảo tồn trong trung tâm hoạt động của nattokinase bao gồm các gốc acid amin aspartate (D32), histidine (H64), serine (S221) và asparagine (N155) [6].

1: Hình ảnh cấu trúc không gian 3 chiều của NK [43] 1. Nguồn thu nhận Enzym Nattokinase Nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống là nguồn giống quan trọng có khả năng sản xuất các enzym làm tan huyết khối, như B. natto phân lập từ thực phẩm Natto, Nhật [6], Bacillus amyloliquefaciens DC-4 từ Douchi, Trung Quốc [28], Bacillus sp. CK 11-4 từ Chungkook-Jang và Bacillus sp.

DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [28]. 3 Nattokinase được tinh sạch từ dịch nuôi cấy B. Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới dạng viên nang cứng nhập khẩu từ Nhật Bản, Hoa Kỳ như Nattospes  (3000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g), Dosaka (300 FU/g). Dạng thực phẩm truyền thống của Nhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng không được dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khó ăn, không phù hợp với khẩu vị người Việt Nam, hoạt tính nattokinase cũng thấp [5].

Tác dụng và cơ chế tác dụng Nattokinase được coi là một chất hoàn toàn tự nhiên, hiệu quả cao, chi phí thấp để điều trị các bệnh tim mạch. Cơ chế chống đông máu và tan cục máu đông của NK được mô tả tóm tắt ở hình 1. NK làm tan cục máu đông bằng cách trực tiếp phân cắt fibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng cách hoạt hoá sự sản xuất urokinase và plasmin trong. NK có vai trò chuyển đổi pro-urokinase nội sinh thành urokinase (uPA), đồng thời cũng làm suy giảm chất ức chế của t-PA (PAI-1) và tăng chất hoạt hóa plasminogen mô (t-PA) [39].

Ngoài ra, NK còn là chất chống hình thành cục máu đông do làm giảm nồng độ của các yếu tố đông máu như yếu tố VIII [12]. 2: Sơ đồ mô tả cơ chế làm tan cục máu đông của NK [39] 4 NK cũng có tác dụng hạ huyết áp, chống xơ vữa động mạch, hạ lipid máu, chống kết tập tiểu cầu / chống đông máu, các hoạt động hỗ trợ thần kinh [12]. Những tác dụng này đã được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu trên người và động vật. 3: Sơ đồ mô tả tác dụng dược lý của NK [12] Gần đây, Nattokinase cũng được nghiên cứu trong việc làm tan huyết khối liên quan đến ung thư tăng khả năng tiếp cận khối u của các hạt nano và tế bào miễn dịch [19].

Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định  Nhiệt độ Enzym tương đối ổn định trong khoảng từ 30oC đến 40oC, và hoạt tính của enzym giảm chậm theo thời gian. Nhiệt độ tối ưu của NK là 40oC [29]. Khi nhiệt độ được nâng lên 50oC, hoạt tính NK suy giảm nhanh chóng và mất hoàn toàn hoạt tính ở 60oC sau 30 phút [29], [38].  PH NK ổn định trong phạm vi pH 6,0-9,0 và hoạt lực của enzym đạt tối ưu ở pH 8,0 [29].

Ngoài ra, trong điều kiện MT acid, hoạt động của enzym NK giảm nhanh hơn ở MT kiềm. Enzym mất hoàn toàn hoạt tính ở pH nhỏ hơn 5,0 trong 1 giờ và ở pH 12 chỉ còn 20% NK giữ được hoạt tính [29], [38]. 5  Các ion kim loại và chất ức chế Hoạt động của enzym được kích hoạt bởi Zn2+ và bị ức chế bởi Fe3+ và Al3+. NK bị bất hoạt toàn bởi PMSF (phenylmethylsulfonyl florid) [24], [29].

Cố định Enzym 1. Định nghĩa Cố định enzym là phương pháp giữ hoặc cố định enzym ở những vị trí xác định về mặt không gian mà không thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng. Các ưu điểm của enzym cố định:  Enzym cố định tách biệt dễ dàng khỏi sản phẩm, do đó giảm thiểu hoặc loại bỏ sự ô nhiễm protein của sản phẩm.  Enzym cố định không thể dễ dàng xâm nhập vào da và do đó, khả năng gây dị ứng thấp hoặc không có.

 Việc cố định cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tái sử dụng hiệu quả enzym  Nâng cao độ ổn định, trong cả lưu trữ và điều kiện hoạt động, ví dụ: biến tính bằng nhiệt, dung môi hữu cơ hoặc bằng cách tự phân.  Cải thiện hiệu suất sử dụng và tái sử dụng enzym do đó hiệu suất xúc tác cao hơn (kg sản phẩm trên mỗi kg enzym). Các phương pháp cố định Enzym Về cơ bản, có thể chia các phương pháp cố định enzym thành ba loại: liên kết với chất mang, bẫy (vi nang hoá) và liên kết ngang [32]. 4: Các phương pháp cố định enzym cơ bản [32] 6  Liên kết với chất mang Các liên kết của enzym với chất mang có thể là lực van der Waals, liên kết hydro, liên kết ion, cộng hoá trị.

Tuy nhiên trong các liên kết trên lực van der Waals và liên kết hydro là quá yếu để giữ cho enzym cố định với chất mang trong các điều kiện thực hiện thí nghiệm với nồng độ chất phản ứng, sản phẩm và nồng độ ion cao. Liên kết ion và liên kết cộng hóa trị của enzym với chất mang nói chung thường mạnh hơn, do đó sẽ ngăn enzym rửa trôi khỏi bề mặt. Mặt khác, liên kết cộng hóa trị với enzym có nhược điểm là nếu enzym bị vô hiệu hóa không thể đảo ngược được thì cả enzym và chất hỗ trợ (thường tốn kém) đều không sử dụng lại được. Các chất mang điển hình được sử dụng là nhựa tổng hợp, chất tạo màng sinh học, chẳng hạn như polysaccharid hoặc chất rắn vô cơ như silicas (trung tính) hoặc zeolit [4].

 Liên kết ngang Phương pháp liên kết ngang là phương pháp tạo ra các liên kết giữa các enzym. Phương pháp này không cần sử dụng các chất mang mà chỉ cần các tác nhân để gắn các enzym lại với nhau thành một đại phân tử không tan [32]. Tác nhân hay sử dụng là glutaraldehyde. Tác nhân này có 2 nhóm aldehyd, mỗi nhóm liên kết với amin của một enzym.

 Ưu điểm: Enzym được tạo thành một khối nên ít bị rửa trôi; tăng tính chống chịu của enzym với các tác nhân gây biến tính như nhiệt độ, muối, pH…  Nhược điểm: lượng enzym cố định được ít hơn các phương pháp khác; giảm hoạt tính của enzym (tương tự với phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị); giá thành cao [10], [32].  Phương pháp bẫy Bẫy là quá trình giữ enzym trong một mạng lưới polyme, có thể là polyme hữu cơ hoặc vô cơ, chẳng hạn như polyacrylamid và silica sol – gel tương ứng, hoặc các thiết bị màng như sợi rỗng hoặc vi nang [37], [32]. 7 Cấu trúc ba chiều của một enzym có ảnh hưởng lớn đến hoạt động xúc tác của nó. Do đó khi thực hiện cố định một enzym, các phương pháp và hóa chất sử dụng phải được cân nhắc để cấu trúc bậc ba không bị ảnh hưởng.

Phương pháp bẫy vật lý một enzym trong mạng tinh thể gel là một phương pháp cố định trong đó không cần thay đổi các gốc acid amin, do đó điều kiện phản ứng thường rất nhẹ nhàng và có rất ít thay đổi đáng kể trong cấu trúc enzym. Bên cạnh đó, phương pháp này có khả năng ứng dụng rộng rãi đối với hầu hết các enzym, dịch chiết tinh khiết cũng như dịch chiết thô và tất cả tế bào (ví dụ: vi sinh vật). Phương pháp bẫy Enzym chia thành 2 loại:  Bẫy kiểu mạng lưới là phương pháp bẫy Enzym trong những khoảng không gian xem kẽ của một polyme không tan trong nước được liên kết chéo. Một số polyme như Canci-alginat, agar, κ-carrageenin, polyacrylamid và collagen đã được sử dụng.

Khi cố định trong mạng lưới polyme, dung dịch enzym được trộn lẫn với dung dịch polyme trước khi xảy ra quá trình gel hóa. Sau đó, hỗn hợp polyme-enzym lỏng được ép đùn hoặc sử dụng khuôn để định hình các hạt.  Bẫy dạng màng là việc giữ các enzym trong màng polyme bán thấm. Màng nylon, cellulose, polysulfone và polyacrylat thường được sử dụng.

Các phân tử lớn như enzym không thể khuếch tán qua màng tổng hợp, trong khi đó các phân tử nhỏ ví dụ như cơ chất và sản phẩm có thể đi qua. Mặc dù có những ưu điểm đã được đề cập ở trên, phương pháp bẫy enzym vẫn tồn tại những nhược điểm như: rò rỉ enzym vào trong dung dịch, quá trình khuếch tán hạn chế, giảm hoạt tính enzym. Rò rỉ enzym có thể khắc phục bằng cách giảm trọng lượng phân tử màng hoặc kích thước lỗ xốp của mạng lưới rắn. Hạn chế khuếch tán có thể loại bỏ bằng cách giảm kích thước hạt.

Vấn đề giảm hoạt tính và độ ổn định của enzym nguyên nhân là do điều kiện MT không thuận lợi do đó khó để kiểm soát. Tuy nhiên bằng việc sử dụng các thành phần công 8 thức khác nhau, bằng cách thay đổi điều kiện môi trường và giảm kích thước hạt có thể cải thiện vấn đề này [23], [21]. Chất mang Natri Alginat 1. Nguồn gốc Alginat Alginat có khá nhiều trong tự nhiên và có thể xuất phát từ 2 nguồn gốc khác nhau: - Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng chất khô.

- Là polysaccharid màng bao trong các loại vi khuẩn đất. Tuy nhiên tất cả các alginat thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo [28]. Cấu tạo Natri alginat là muối natri của acid alginic (NaC6H7O6), có trọng lượng phân tử từ 32. Alginat là một copolyme không phân nhánh, bao gồm các monome D-Mannuroic acid (Gọi tắt là M) và L-Guluronic acid (Gọi tắt là G) liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4 – glucosid.

Các monome này phân bố trong mạch alginat theo các khối: - Khối M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau - Khối G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau - Khối MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau [28], [31], [36]. Alginat không độc hại, có khả năng phân hủy sinh học, giá thành thấp, và được coi là chất kết dính niêm mạc, tương hợp sinh học và không gây miễn dịch [28], [31], [7]. 5: Đặc điểm cấu trúc của alginat: (a) monome alginat, (b) cấu trúc chuỗi, (c) phân bố khối [3], [28] 1. Sự tạo gel Sự gel hoá alginat được thực hiện thông qua việc hình thành các liên kết chéo giữa các chuỗi polyme.