Luận án TS. Cao Ngọc Anh: Chiết xuất chất chuẩn từ cây Bảy lá một hoa

Luận án tiến sĩ Dược học nghiên cứu chiết xuất, tinh chế và thiết lập một số chất chuẩn từ cây Bảy lá một hoa ứng dụng trong kiểm nghiệm dược liệu.

• Tác giả: Cao Ngọc Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Đỗ Thị Hà
• Trường học: Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương
• Chuyên ngành: Dược Học
• Đề tài: Thiết Lập Một Số Chất Chuẩn Được Chiết Xuất, Tinh Chế Từ Cây Bảy Lá Một Hoa Ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây Bảy lá một hoa và chất chuẩn dược liệu

Cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla Sm.) là một dược liệu quý hiếm, phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao Việt Nam. Tên khoa học của cây là Paris polyphylla Sm., thuộc họ Trọng lâu (Trilliaceae). Trong y học cổ truyền, dược liệu này được biết đến với nhiều công dụng như thanh nhiệt giải độc, giảm đau và đặc biệt là hỗ trợ điều trị ung thư. Các nghiên cứu hiện đại đã xác định thành phần hóa học chính của cây là các saponin steroid, bao gồm các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh như polyphyllin D, paris saponin II, dioscin, và gracillin. Những hợp chất này chịu trách nhiệm cho các tác dụng dược lý quan trọng, đặc biệt là khả năng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư. Sự đa dạng về thành phần hóa học và tác dụng sinh học đã đưa Bảy lá một hoa trở thành đối tượng nghiên cứu quan trọng trong ngành dược. Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu quả và an toàn khi sử dụng, việc kiểm soát chất lượng dược liệu và các sản phẩm từ nó là yêu cầu bắt buộc. Đây là lúc vai trò của chất chuẩn trở nên thiết yếu. Chất chuẩn là những mẫu vật liệu có độ tinh khiết cao, được đặc trưng hóa đầy đủ và sử dụng làm chất đối chiếu trong các phép thử định tính và định lượng. Việc sử dụng chất chuẩn giúp xác định chính xác danh tính và hàm lượng hoạt chất trong dược liệu, từ đó đảm bảo các lô sản phẩm có chất lượng đồng nhất và đạt tiêu chuẩn. Trong bối cảnh ngành dược Việt Nam đang hướng tới việc tự chủ nguồn nguyên liệu và phát triển thuốc từ dược liệu, việc thiết lập chất chuẩn từ các cây thuốc bản địa như Bảy lá một hoa là một nhiệm vụ chiến lược, góp phần nâng cao giá trị và tiêu chuẩn hóa dược liệu Việt Nam.

1.1. Đặc điểm và tiềm năng dược học của cây Bảy lá một hoa

Cây Bảy lá một hoa là cây thân thảo, sống nhiều năm, có đặc điểm nhận dạng là vòng lá mọc ở giữa thân. Thành phần hóa học nổi bật nhất là nhóm saponin steroid với khung cấu trúc đa dạng như spirostan, furostan và pregnan. Theo các tài liệu nghiên cứu, hơn 150 hợp chất saponin đã được phân lập từ chi Paris, trong đó có nhiều chất thể hiện hoạt tính sinh học mạnh. Các nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết và các saponin tinh khiết từ Bảy lá một hoa có khả năng ức chế tế bào ung thư gan (HepG2), ung thư vú (MCF-7), và ung thư cổ tử cung (HeLa). Cơ chế chính được cho là kích thích quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Ngoài ra, dược liệu này còn có tác dụng cầm máu, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn, mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc và các sản phẩm bảo vệ sức khỏe.

1.2. Vai trò quan trọng của chất chuẩn trong kiểm nghiệm thuốc

Chất chuẩn đóng vai trò là "thước đo" không thể thiếu trong ngành kiểm nghiệm thuốc. Chúng được sử dụng để định danh (định tính) và xác định hàm lượng (định lượng) các hoạt chất trong nguyên liệu và thành phẩm. Theo Dược điển Việt Nam V, có 117 chuyên luận về dược liệu yêu cầu sử dụng chất chuẩn để kiểm tra chất lượng. Thiếu chất chuẩn, các phương pháp phân tích sẽ thiếu tính đặc hiệu và độ chính xác, dẫn đến việc đánh giá sai lệch chất lượng sản phẩm. Một dược liệu có chất lượng tốt phải chứa hàm lượng hoạt chất nằm trong giới hạn quy định. Việc thiết lập chất chuẩn từ nguồn dược liệu trong nước không chỉ giúp chủ động trong công tác kiểm nghiệm mà còn đảm bảo chất lượng thuốc từ dược liệu được kiểm soát một cách chặt chẽ, từ khâu nguyên liệu đầu vào đến sản phẩm lưu hành trên thị trường, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

II. Thách thức trong kiểm soát chất lượng dược liệu Việt Nam

Công tác kiểm soát chất lượng dược liệu tại Việt Nam đối mặt với nhiều thách thức, trong đó nổi bật là sự thiếu hụt và phụ thuộc vào nguồn chất chuẩn nhập khẩu. Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược đã nhấn mạnh mục tiêu tự chủ sản xuất nguyên liệu làm thuốc, nhưng thực tế, phần lớn chất chuẩn sử dụng trong kiểm nghiệm thuốc vẫn phải nhập từ nước ngoài. Quá trình này không chỉ tốn kém chi phí mà còn mất nhiều thời gian và gặp rào cản về thủ tục nhập khẩu phức tạp. Sự phụ thuộc này làm chậm tiến độ nghiên cứu, xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng thuốc, đặc biệt là các sản phẩm từ dược liệu. Một vấn đề khác là nhiều tiêu chuẩn chất lượng cho thuốc dược liệu hiện nay chưa có phương pháp định lượng đặc hiệu cho từng hoạt chất chính. Thay vào đó, các phương pháp cũ thường chỉ định tính so sánh với dược liệu chuẩn hoặc định lượng tổng hàm lượng bằng các kỹ thuật không đặc hiệu. Điều này dẫn đến việc không thể kiểm soát chính xác nồng độ của các hợp chất có hoạt tính sinh học, gây ra sự không đồng đều về chất lượng giữa các lô sản xuất. Cây Bảy lá một hoa là một ví dụ điển hình. Mặc dù Dược điển Trung Quốc đã quy định sử dụng bốn saponin làm chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng, Việt Nam vẫn chưa có bộ chất chuẩn tương ứng cho nguồn dược liệu trong nước. Việc thiết lập chất chuẩn từ chính cây Bảy lá một hoa Việt Nam là giải pháp cấp thiết để giải quyết những thách thức này, tạo tiền đề cho việc xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng riêng, đảm bảo hiệu quả và an toàn cho người sử dụng.

2.1. Sự phụ thuộc vào nguồn chất chuẩn nhập khẩu đắt đỏ

Hiện tại, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh mới chỉ thiết lập được khoảng 50 chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu. Con số này là rất nhỏ so với nhu cầu thực tế. Do đó, phần lớn các phòng thí nghiệm phải nhập khẩu chất chuẩn từ các nhà cung cấp quốc tế như USP, EP. Chi phí cho các chất chuẩn này rất cao, thủ tục nhập khẩu lại phức tạp, kéo dài thời gian cung ứng. Sự bị động về nguồn cung này gây ảnh hưởng lớn đến công tác đảm bảo chất lượng thuốc, từ khâu nghiên cứu phát triển đến kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc trên thị trường. Việc tự chủ nguồn chất đối chiếu là một bước đi chiến lược để giảm chi phí và nâng cao năng lực ngành kiểm nghiệm trong nước.

2.2. Nhu cầu cấp thiết về tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu

Việc thiếu các chất chuẩn đặc trưng cho dược liệu Bảy lá một hoa của Việt Nam dẫn đến khoảng trống trong việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng. Một tiêu chuẩn chất lượng hiệu quả phải dựa trên việc định lượng các chất đánh dấu hoặc các hoạt chất chính. Nếu không có chất chuẩn, không thể phát triển và thẩm định các phương pháp phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Điều này khiến cho việc đánh giá chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ Bảy lá một hoa chỉ dừng lại ở mức định tính hoặc bán định lượng, không đảm bảo được tính đồng nhất và hiệu quả điều trị của sản phẩm. Do đó, việc nghiên cứu thiết lập chất chuẩn là nhiệm vụ tiên quyết để xây dựng bộ tiêu chuẩn hoàn chỉnh.

III. Hướng dẫn chiết xuất và phân lập saponin từ dược liệu

Quy trình thiết lập chất chuẩn từ dược liệu là một quá trình khoa học đòi hỏi sự chính xác và nghiêm ngặt, bắt đầu từ khâu chiết xuất và phân lập hợp chất. Đối với cây Bảy lá một hoa, mục tiêu là thu được các saponin steroid mục tiêu như polyphyllin D, paris saponin H, paris saponin II, dioscin, và gracillin với độ tinh khiết cao. Quá trình này khởi đầu bằng việc lựa chọn nguyên liệu dược liệu chất lượng, sau đó tiến hành chiết xuất bằng dung môi phù hợp, thường là cồn có nồng độ khác nhau. Dịch chiết thô sau đó được phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, ethyl acetat, và n-butanol để loại bỏ tạp chất và làm giàu phân đoạn chứa saponin. Phân đoạn n-butanol, nơi tập trung nhiều saponin nhất, sẽ được đưa vào các công đoạn sắc ký tiếp theo. Các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển sử dụng silica gel hoặc pha đảo C18 là phương pháp phổ biến để tách sơ bộ các nhóm hợp chất. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột tiếp tục được tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký hiện đại hơn như sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (preparative HPLC). Mục tiêu của giai đoạn này là tách riêng từng saponin ra khỏi hỗn hợp và đạt độ tinh khiết trên 95%, một yêu cầu cơ bản đối với nguyên liệu dùng để thiết lập chất chuẩn. Mỗi bước trong quy trình đều cần được kiểm soát và tối ưu hóa cẩn thận để đảm bảo hiệu suất thu hồi và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng.

3.1. Quy trình chiết xuất các hợp chất saponin tiềm năng

Quy trình chiết xuất bắt đầu với việc xử lý dược liệu thô (thân rễ hoặc phần trên mặt đất của cây Bảy lá một hoa). Dược liệu được sấy khô, xay thành bột mịn và chiết bằng phương pháp ngâm lạnh hoặc chiết nóng với methanol hoặc ethanol. Dịch chiết tổng sau đó được cô đặc dưới áp suất giảm để loại bỏ dung môi. Cắn chiết tổng được phân tán trong nước và phân đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ. Phân đoạn n-butanol thường chứa hàm lượng saponin cao nhất và được lựa chọn để tiến hành các bước phân lập tiếp theo. Sơ đồ chiết xuất được thiết kế để tối đa hóa việc thu nhận các saponin mục tiêu đồng thời loại bỏ các nhóm chất không mong muốn như chất béo hay diệp lục.

3.2. Kỹ thuật phân lập và tinh chế để đạt độ tinh khiết cao

Sau khi thu được cao giàu saponin từ phân đoạn n-butanol, quá trình phân lập và tinh chế được thực hiện qua nhiều bước sắc ký. Ban đầu, sắc ký cột cổ điển với chất nhồi silica gel hoặc Sephadex LH-20 được sử dụng để phân tách hỗn hợp thành các phân đoạn nhỏ hơn. Các phân đoạn này được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) để gộp những phân đoạn có thành phần tương tự nhau. Cuối cùng, để đạt được độ tinh khiết yêu cầu cho một chất chuẩn, các phân đoạn hứa hẹn nhất được tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế. Kỹ thuật này cho phép tách các hợp chất có cấu trúc rất gần nhau, đảm bảo thu được các saponin riêng lẻ với độ tinh khiết cao, sẵn sàng cho các bước xác định cấu trúc và xây dựng tiêu chuẩn.

IV. Phương pháp xác định cấu trúc và xây dựng tiêu chuẩn

Sau khi thu được các hợp chất tinh khiết từ quá trình phân lập, bước tiếp theo và cũng là bước quyết định trong việc thiết lập chất chuẩn là xác định chính xác cấu trúc hóa học và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng. Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng cách kết hợp các phương pháp phân tích phổ hiện đại. Phổ khối (MS) cung cấp thông tin về khối lượng phân tử, trong khi phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), bao gồm phổ ¹H-NMR và ¹³C-NMR, giúp xác định cấu trúc chi tiết của khung aglycon và chuỗi đường của các saponin. So sánh dữ liệu phổ thu được với các tài liệu đã công bố là phương pháp hiệu quả để khẳng định danh tính của các hợp chất như polyphyllin D hay dioscin. Khi cấu trúc đã được xác nhận, bước tiếp theo là xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho từng nguyên liệu. Tiêu chuẩn này bao gồm các chỉ tiêu về định tính (so sánh phổ hồng ngoại - IR, thời gian lưu trên sắc ký đồ HPLC), độ tinh khiết (xác định tạp chất liên quan), và định lượng hàm lượng. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV hoặc ELSD được xây dựng và thẩm định theo các hướng dẫn của ICH hoặc WHO. Quy trình thẩm định bao gồm các chỉ tiêu như tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng và giới hạn phát hiện, đảm bảo phương pháp phân tích đủ độ tin cậy để sử dụng trong công tác kiểm nghiệm thuốc.

4.1. Phân tích cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ

Để xác nhận danh tính của một hợp chất được phân lập từ Bảy lá một hoa, không thể thiếu các kỹ thuật phân tích phổ. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là công cụ mạnh mẽ nhất, cho phép xác định vị trí của từng nguyên tử carbon và hydro trong phân tử, từ đó làm sáng tỏ cấu trúc không gian ba chiều. Phổ khối lượng (MS) giúp xác định chính xác khối lượng phân tử, hỗ trợ việc dự đoán công thức phân tử của hợp chất. Phổ hồng ngoại (IR) và phổ tử ngoại (UV) cung cấp thêm thông tin về các nhóm chức đặc trưng có trong cấu trúc. Dữ liệu từ các phương pháp này được tổng hợp và so sánh với dữ liệu của các chất chuẩn đã biết để đi đến kết luận cuối cùng về cấu trúc hóa học.

4.2. Xây dựng phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng HPLC

Phương pháp HPLC là kỹ thuật được lựa chọn hàng đầu để định lượng các saponin trong Bảy lá một hoa do tính đặc hiệu, độ nhạy và độ chính xác cao. Một quy trình HPLC hoàn chỉnh cần được xây dựng, bao gồm việc lựa chọn cột sắc ký, thành phần pha động, tốc độ dòng, và bước sóng phát hiện tối ưu (thường là 203 nm đối với saponin). Sau khi xây dựng, phương pháp phải được thẩm định nghiêm ngặt để chứng minh sự phù hợp với mục đích sử dụng. Việc thẩm định đảm bảo rằng kết quả định lượng hàm lượng chất chuẩn là đáng tin cậy. Phương pháp này sau đó sẽ được sử dụng để xác định giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích của chất chuẩn và ứng dụng trong kiểm nghiệm dược liệu.

V. Kết quả thiết lập 5 chất chuẩn saponin từ cây Bảy lá

Nghiên cứu đã thiết lập thành công 5 chất chuẩn phòng thí nghiệm từ cây Bảy lá một hoa Việt Nam, bao gồm: paris saponin H (PS-H), paris saponin II (PS-II), gracillin, polyphyllin D, và dioscin. Các hợp chất này được phân lập và tinh chế đến độ tinh khiết cao, đáp ứng yêu cầu của một nguyên liệu thiết lập chuẩn. Mỗi chất chuẩn đều được xây dựng bộ tiêu chuẩn chất lượng riêng, bao gồm các phép thử định tính, xác định độ tinh khiết và định lượng hàm lượng. Độ tinh khiết và hàm lượng của các chất chuẩn được xác định bằng phương pháp HPLC đã được thẩm định, cho kết quả tin cậy. Sau khi đóng gói, độ đồng nhất của lô chất chuẩn được đánh giá để đảm bảo mỗi đơn vị đóng gói (lọ, ống) có hàm lượng như nhau. Thử nghiệm liên phòng cũng được tiến hành để xác nhận tính chính xác và độ lặp lại của phương pháp phân tích. Giá trị hàm lượng công bố trên chứng chỉ phân tích (CoA) được tính toán dựa trên kết quả tổng hợp từ các phép thử. Ngoài ra, độ ổn định của các chất chuẩn cũng được theo dõi trong điều kiện bảo quản xác định để thiết lập hạn sử dụng. Các chất chuẩn này đã được ứng dụng thử nghiệm để định lượng đồng thời các saponin tương ứng trong một số mẫu dược liệu Bảy lá một hoa và chế phẩm, cho thấy khả năng ứng dụng thực tiễn cao trong công tác kiểm nghiệm thuốc.

5.1. Ứng dụng chất chuẩn trong định lượng dược liệu và chế phẩm

Bộ 5 chất chuẩn mới được thiết lập đã chứng tỏ vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất lượng công tác kiểm nghiệm. Bằng cách sử dụng các chất chuẩn này, một phương pháp HPLC đã được phát triển để phân tích đồng thời nhiều saponin trong các mẫu dược liệu Bảy lá một hoa và các sản phẩm như cao khô, viên nang. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng các saponin có sự khác biệt đáng kể giữa các mẫu thu hái ở các vùng địa lý khác nhau và giữa các bộ phận dùng (thân rễ và phần trên mặt đất). Điều này khẳng định sự cần thiết của việc định lượng các chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào, góp phần tạo ra các sản phẩm có tác dụng ổn định.

5.2. Đánh giá độ ổn định và đồng nhất của lô chất chuẩn

Một chất chuẩn chỉ có giá trị khi nó ổn định theo thời gian và đồng nhất trong toàn bộ lô sản xuất. Quá trình đánh giá độ ổn định được thực hiện bằng cách theo dõi hàm lượng của chất chuẩn trong điều kiện lão hóa cấp tốc và điều kiện bảo quản dài hạn. Kết quả cho phép xác định tuổi thọ và điều kiện bảo quản tối ưu cho chất chuẩn. Đồng thời, việc đánh giá độ đồng nhất trong quá trình đóng gói đảm bảo rằng mọi lọ chuẩn được phân phối đến người dùng đều có chất lượng tương đương. Các kết quả này là cơ sở pháp lý và khoa học để công bố một chất chuẩn đạt yêu cầu và đưa vào sử dụng rộng rãi trong hệ thống kiểm nghiệm.

VI. Triển vọng phát triển quỹ chất chuẩn dược liệu quốc gia

Việc thiết lập thành công 5 chất chuẩn saponin từ cây Bảy lá một hoa không chỉ là một thành tựu nghiên cứu khoa học mà còn mở ra triển vọng to lớn cho ngành dược Việt Nam. Thành công này chứng tỏ năng lực của các nhà khoa học trong nước trong việc tự chủ nghiên cứu và sản xuất chất chuẩn, một lĩnh vực đòi hỏi công nghệ cao và sự đầu tư bài bản. Đây là một đóng góp quan trọng, góp phần làm phong phú thêm quỹ chất chuẩn dược liệu quốc gia, giảm sự phụ thuộc vào nguồn cung nhập khẩu và tiết kiệm chi phí đáng kể cho công tác kiểm nghiệm thuốc. Từ nền tảng này, có thể mở rộng nghiên cứu sang các dược liệu quý hiếm khác của Việt Nam, xây dựng một hệ thống chất chuẩn toàn diện và đặc thù cho nguồn tài nguyên cây thuốc bản địa. Việc phát triển quỹ chất chuẩn quốc gia sẽ là đòn bẩy để nâng cao chất lượng và uy tín của các sản phẩm thuốc từ dược liệu Việt Nam trên thị trường trong nước và quốc tế. Hơn nữa, nó còn thúc đẩy các nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học, tác dụng dược lý và tiêu chuẩn hóa dược liệu, đưa ngành công nghiệp dược Việt Nam phát triển theo hướng hiện đại, bền vững và dựa trên thế mạnh của y học cổ truyền. Tương lai của ngành kiểm nghiệm dược liệu Việt Nam gắn liền với khả năng tự chủ và phát triển nguồn chất đối chiếu chất lượng cao.

6.1. Ý nghĩa của việc tự chủ nguồn cung cấp chất đối chiếu

Tự chủ nguồn cung chất đối chiếu mang lại nhiều lợi ích chiến lược. Về kinh tế, nó giúp giảm chi phí nhập khẩu, tiết kiệm ngoại tệ. Về khoa học, nó thúc đẩy hoạt động nghiên cứu và phát triển trong nước, tạo điều kiện cho việc xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng phù hợp với đặc điểm dược liệu Việt Nam. Về quản lý, nó giúp các cơ quan chức năng chủ động hơn trong việc giám sát, kiểm tra chất lượng dược liệu và thuốc lưu hành trên thị trường. Việc làm chủ công nghệ phân lập, tinh chế và thiết lập chuẩn là một bước tiến quan trọng, khẳng định vị thế của ngành dược Việt Nam trong bối cảnh hội nhập quốc tế.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo cho các dược liệu quý khác

Thành công từ dự án thiết lập chất chuẩn cho cây Bảy lá một hoa là mô hình mẫu để áp dụng cho các dược liệu khác. Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào các cây thuốc quý có tiềm năng kinh tế cao và nhu cầu kiểm soát chất lượng cấp thiết như Sâm Ngọc Linh, trinh nữ hoàng cung, hay các dược liệu trong các bài thuốc cổ phương. Việc xây dựng một lộ trình bài bản để thiết lập chất chuẩn cho các dược liệu trọng điểm sẽ góp phần tạo ra một hệ thống tiêu chuẩn quốc gia vững mạnh, đảm bảo người dân được sử dụng các sản phẩm thuốc từ dược liệu an toàn, hiệu quả và có chất lượng được kiểm soát chặt chẽ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong “Chiến lƣợc quốc gia phát triển ngành Dƣợc Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (đƣợc ban hành theo Quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tƣớng Chính phủ) có nêu rõ phát huy thế mạnh, tiềm năng của Việt Nam để phát triển sản xuất thuốc từ dƣợc liệu. Trong chiến lƣợc này, mục tiêu cụ thể đến năm 2020 là phấn đấu sản xuất đƣợc 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nƣớc, thuốc sản xuất trong nƣớc chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dƣợc liệu chiếm 30%. Đồng thời, các sản phẩm từ dƣợc liệu (cao chuẩn, bột nguyên liệu, chiết xuất các loại tinh dầu, các hoạt chất tinh khiết) là một trong 5 nhóm sản phẩm chủ lực cũng đƣợc đề cập trong chiến lƣợc này. Dƣợc điển Việt Nam xuất bản lần thứ năm (năm 2017) có 372 chuyên luận về dƣợc liệu và thuốc từ dƣợc liệu, trong đó có 117 chuyên luận dùng chất chuẩn để định tính, định lƣợng thành phần hoạt chất có trong dƣợc liệu và các sản phẩm có chứa nó.

Bên cạnh đó, tiêu chuẩn chất lƣợng của nhiều sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu chƣa xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng các thành phần hoạt chất hoặc các chất đánh dấu, mà mới định tính so sánh với dƣợc liệu chuẩn và định lƣợng hỗn hợp toàn phần bằng các phƣơng pháp kém hoặc không đặc hiệu và không định lƣợng đƣợc các hợp chất chính, đặc trƣng, đƣợc coi là các hợp chất có hoạt tính sinh học do thiếu chất chuẩn đối chiếu. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu đƣợc chiết xuất từ dƣợc liệu ngày càng trở nên cần thiết đối với công tác đảm bảo chất lƣợng thuốc, từ giai đoạn lựa chọn nguyên liệu đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng, cũng nhƣ việc kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc lƣu hành trên thị trƣờng của cơ quan quản lý. Trƣớc yêu cầu ngày càng cao của công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng và Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh hàng năm vẫn từng bƣớc thiết lập, mở rộng quỹ chất chuẩn (bao gồm cả dƣợc liệu chuẩn và chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dƣợc liệu). Tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại, cả hai Viện mới thiết lập đƣợc khoảng 200 dƣợc liệu chuẩn và 50 chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập từ dƣợc liệu.

Phần lớn những chất chuẩn khác cần thiết cho công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng dƣợc liệu, thuốc từ dƣợc liệu vẫn phải nhập từ nƣớc ngoài với chi phí cao, thời gian cung cấp tƣơng đối lâu và thủ tục nhập khẩu còn phức tạp. -1- Bảy lá một hoa (Paris polyphylla Sm.) là cây thuốc quý và hiếm ở Việt Nam. Với thành phần hóa học chính là saponin, Bảy lá một hoa đã đƣợc chứng minh có các tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thƣ [27],[49],[110], kích thích miễn dịch [83], cầm máu [103], giảm đau, chống viêm [36], chữa rắn độc cắn [1]. Với những tác dụng và công dụng quý nhƣ trên, Dƣợc điển Trung Quốc năm 2015 đã sử dụng 4 chất là chonglou saponin I (polyphyllin D), chonglou saponin II (paris saponin II), chonglou saponin VI (paris saponin VI) và chonglou saponin VII (paris saponin VII) làm 4 chất đánh dấu để kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này.

Tổng hàm lƣợng của 4 chất trên không đƣợc ít hơn 0,60% tính theo dƣợc liệu khô kiệt [82]. Ở Việt Nam, Bảy lá một hoa mới chỉ đƣợc dùng trong trong các bài thuốc dân gian mà chƣa đƣợc nghiên cứu một cách có hệ thống và bài bản cũng nhƣ chƣa xây dựng, thiết lập đƣợc các chất đánh dấu, các chất chuẩn để kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này và các sản phẩm có chứa nó. Vì vậy việc thiết lập các chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập và tinh chế từ cây Bảy lá một hoa là nhiệm vụ cần thiết để góp phần chủ động nguồn cung cấp chất đối chiếu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này và những sản phẩm có chứa nó, góp phần mở rộng quỹ chất chuẩn dùng trong ngành Kiểm nghiệm thuốc ở Việt Nam. Xuất phát từ những lý do nêu trên, đề tài “Thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất, tinh chế từ cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam” đƣợc thực hiện với các mục tiêu là: 1.

Phân lập và tinh chế một số hợp chất trong các bộ phận của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam đủ tinh khiết để làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Xây dựng phương pháp phân tích một số saponin phục vụ cho việc thiết lập các chất chuẩn và khảo sát hàm lượng của các hợp chất nghiên cứu có trong một số mẫu cây Bảy lá một hoa. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu và thiết lập chuẩn phòng thí nghiệm cho các nguyên liệu đã phân lập, tinh chế được. -2- Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.

CÂY BẢY LÁ MỘT HOA 1. Đặc điểm thực vật và phân bố Bảy lá một hoa còn có các tên gọi khác là thất diệp nhất chi hoa, tảo hƣu, cúa dô (H’Mông). Tên khoa học là Paris polyphylla Sm. thuộc họ Trọng lâu (Trilliaceae), chi Paris [1].

Cây Bảy lá một hoa a) Phần trên mặt đất b,c) Lá và hoa d) Thân rễ Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris là: Phân giới thực vật bậc cao Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) -3- Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Loa kèn (Lilidae) Bộ củ nâu (Dioscoreales) Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae) Chi Bảy lá một hoa, Tảo hƣu (Paris) [2],[6]. Trên thế giới, đến nay ngƣời ta đã biết khoảng 22 loài [7] thuộc chi Paris, phân bố ở vùng nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Butan, Nepal, Pakistan, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam), châu Âu và châu Mỹ; trong đó có hai loài đƣợc quan tâm nhất là Paris yunnanensis Franch và Paris chinensis Franch [1], [5], [6]. Theo thông tin cập nhật trên trang “The Plant List”, đến năm 2020 đã có 128 loài thuộc chi Paris đã đƣợc chấp nhận tên khoa học. Ở Việt Nam, theo tài liệu tham khảo [5] thì chi Paris có 6 loài gồm: (1) Paris delavayi Franch.

(Trọng lâu kim tiền); (2) Paris polyphylla Sm. (Trọng lâu nhiều lá); (3) Paris hainanensis Merr. (Trọng lâu hải nam); (4) Paris yunnanensis Franch. (Trọng lâu vân nam); (5) Paris chinensis Franch.

(Bảy lá một hoa, Tảo hƣu); (6) Paris fargesii Franch. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã bổ sung thêm thành phần loài thuộc chi Paris ở Việt Nam [10] gồm: (7) Paris vietnamensis (Takht.Li; (8) Paris caobangensis Y.Zhou; (9) Paris cronquistii (Takht.Li; (10) Paris xichouensis (H.Zhou; (11) Paris dunniana H. Đặc điểm thực vật Cây thảo nhiều năm, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Cây cao 40 - 170 cm.

Thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang, chia thành nhiều đốt, có những ngấn ngang và sẹo to, đƣờng kính khoảng 2- 8 cm; thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh. Lá 5 - 8, xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, thuôn hình trứng ngƣợc, kích thƣớc 20 - 25  5 - 7 cm ; có 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 cm. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lƣỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, -4- thẳng đứng. Đài 5 - 6, dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thƣớc 5 - 8 × 1,5 - 2,5 cm, màu lục.

Cánh hoa 5 - 6, màu vàng, dạng dải, kích thƣớc 4,5 - 6  0,1 cm, bằng nhau. Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm. Bầu thƣợng, hình trứng, 4 - 5 lá noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu nhuỵ 5 - 6. Quả nang, mở ở lƣng ô.

Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [1],[6],[9]. Phân bố Bảy lá một hoa mọc nơi đất ẩm, nhiều mùn, gần bờ nƣớc, khe suối hay hốc đá, dƣới tán rừng kín thƣờng xanh. Mùa ra hoa tháng 3-7, mùa quả tháng 8-12. Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Sơn La (Mộc Châu), Ninh Bình (Cúc Phƣơng), Kon Tum (Kon Plong), Lai Châu (Phong Thổ), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lƣơng Sơn, Mai Châu, Pà Cò).

Ngoài ra, Bảy lá một hoa còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [1], [4], [6]. Thành phần hóa học của cây Bảy lá một hoa Nghiên cứu về thành phần hóa học của Bảy lá một hoa cho thấy saponin là thành phần chính, ngoài ra còn có các nhóm chất khác nhƣ anthraquinon, flavonoid, sterol, polyacetylen và một số hợp chất phenolic. Trên thế giới  Các hợp chất saponin Từ năm 1973 đến nay đã có khoảng 150 hợp chất saponin đƣợc phân lập từ cây Bảy lá một hoa. Cấu trúc của các hợp chất này chủ yếu thuộc nhóm saponin steroid khung spirostan (diosgenin, pennogenin), pseudo-spirostan, furostan, pregnan và saponin triterpenoid.

 Các hợp chất saponin steroid - Các hợp chất saponin spirostan: Các saponin nhóm này thƣờng có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin hoặc là các dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C- 24 hoặc C-27. Các saponin này có từ 1 đến 4 đƣờng và thƣờng liên kết với phần aglycon tại C-3. Một số saponin pennogenin bị hydroxyl hóa tại vị trí C-23, C-24 và C-27 đƣợc phân lập bởi Chen và cộng sự [22],[23],[29] từ loài -5- Paris axialis H.Li và Paris polyphylla var. Theo thống kê đến thời điểm hiện tại có trên 60 hợp chất nhóm này đƣợc phân lập từ chi Paris, ký hiệu từ 1-63 (Hình 1.

Cấu trúc của các saponin spirostan (1-63) phân lập từ chi Paris. - Các saponin furostan: Các saponin furostan (Hình 1.3) có cấu trúc tƣơng tự nhƣ các saponin spirostan nhƣng bị phản ứng bởi enzym mở vòng ở vòng F và bị đƣờng hóa tại C-26. Cấu trúc dạng này lần đầu tiên phân lập từ chi Paris bởi Matsuda và cộng sự năm 2003 [74] là protogracillin. Ngoài ra một số saponin furostan có thể chứa C-20 không no tại khung E.

Cấu trúc của các saponin furostan (64-86) phân lập từ chi Paris - Các saponin pseudo-spirostanol và pregnan: Chen và cộng sự lần đầu tiên phân lập đƣợc hai nhóm saponin pseudo- spirostanol và pregnan từ Paris polyphylla var.