Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in vitro

Toàn văn luận án tiến sĩ nghiên cứu kỹ thuật in vitro tạo phôi lợn bản địa Việt Nam, một giải pháp quan trọng trong việc bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Nhung
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Xuân Nguyên
• Trường học: Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in vitro
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khám phá kỹ thuật tạo phôi lợn bản địa Việt Nam in vitro

Việt Nam sở hữu nhiều giống lợn bản địa Việt Nam quý hiếm như lợn Ỉ, lợn Móng Cái, và đặc biệt là lợn Bản. Các giống lợn này không chỉ là nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế cao mà còn là nguồn gen độc đáo, có khả năng kháng bệnh tốt và thích nghi với điều kiện chăn nuôi địa phương. Tuy nhiên, sự lai tạp không kiểm soát và nguy cơ dịch bệnh đang đe dọa sự tồn tại của chúng, dẫn đến nhu cầu cấp thiết về bảo tồn nguồn gen vật nuôi. Công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật tạo phôi trong ống nghiệm (in vitro), mở ra một hướng đi đột phá để giải quyết vấn đề này. Việc tạo phôi lợn bằng phương pháp in vitro cho phép nhân nhanh số lượng lớn phôi từ những cá thể ưu tú, tạo ra một ngân hàng gen lợn dưới dạng phôi đông lạnh. Đây là nền tảng vững chắc cho các chương trình phục tráng giống vật nuôi và cải thiện di truyền giống lợn trong tương lai. Kỹ thuật này không chỉ giúp bảo tồn đa dạng sinh học mà còn có tiềm năng ứng dụng to lớn trong y học, đặc biệt là lĩnh vực cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation), nơi các giống lợn bản địa như lợn Bản được đánh giá cao do có số lượng bản sao virus nội sinh (PERVs) thấp. Do đó, việc làm chủ quy trình tạo phôi in vitro từ các giống lợn bản địa là một mục tiêu chiến lược, kết hợp giữa bảo tồn và phát triển bền vững.

1.1. Tầm quan trọng của việc bảo tồn nguồn gen vật nuôi quý hiếm

Các giống lợn bản địa như lợn Ỉ, lợn Móng Cái và lợn Bản là di sản di truyền vô giá. Chúng mang trong mình những đặc tính thích nghi độc đáo mà các giống lợn công nghiệp không có được. Tuy nhiên, số lượng cá thể thuần chủng đang suy giảm nghiêm trọng do lai tạp và phương thức chăn nuôi truyền thống không đảm bảo an toàn dịch bệnh. Việc mất đi các nguồn gen này sẽ là một tổn thất không thể bù đắp cho ngành chăn nuôi và đa dạng sinh học. Do đó, bảo tồn nguồn gen vật nuôi không chỉ là lưu giữ các giống lợn mà còn là bảo vệ nền tảng cho an ninh lương thực và các nghiên cứu khoa học trong tương lai. Các phương pháp bảo tồn truyền thống gặp nhiều khó khăn về chi phí và không gian, trong khi công nghệ hiện đại như đông lạnh tinh, trứng và phôi cung cấp giải pháp hiệu quả và bền vững hơn.

1.2. Vai trò của công nghệ sinh học sinh sản trong chăn nuôi

Công nghệ sinh học sinh sản (CNSHSS) đóng vai trò then chốt trong việc nâng cao năng suất và hiệu quả ngành chăn nuôi. Các kỹ thuật tiên tiến như thụ tinh nhân tạo, cấy truyền phôi, và đặc biệt là sản xuất phôi trong ống nghiệm (In Vitro Production - IVP) cho phép khai thác tối đa tiềm năng di truyền từ những cá thể vật nuôi ưu tú. Thay vì chỉ sinh sản tự nhiên, CNSHSS giúp tạo ra hàng loạt con giống chất lượng cao trong thời gian ngắn, đẩy nhanh quá trình cải tạo đàn. Đối với các giống lợn bản địa đang bị đe dọa, việc ứng dụng các kỹ thuật này là giải pháp hữu hiệu để nhân giống và phục hồi quần thể, đảm bảo sự đa dạng di truyền và tránh giao phối cận huyết.

II. Thách thức khi tạo phôi lợn bản địa bằng thụ tinh ống nghiệm

Quá trình tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in vitro đối mặt với nhiều thách thức đáng kể, khiến hiệu suất thấp hơn so với các giống lợn ngoại. Một trong những rào cản lớn nhất là chất lượng của noãn bào (tế bào trứng). Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhung (2021), các yếu tố như mùa vụ có ảnh hưởng trực tiếp đến đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng. Sự thay đổi về nhiệt độ và quang kỳ trong năm tác động đến hoạt động nội tiết, dẫn đến sự không đồng đều về chất lượng trứng thu nhận được. Một vấn đề nghiêm trọng khác là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (polyspermy), vốn có tỷ lệ cao ở lợn. Trong điều kiện in vitro, cơ chế ngăn chặn đa tinh trùng của trứng thường hoạt động kém hiệu quả hơn so với trong cơ thể, dẫn đến sự hình thành các phôi bất thường về bộ nhiễm sắc thể và không có khả năng phát triển. Hơn nữa, môi trường nuôi cấy phôi và các điều kiện kỹ thuật chưa được tối ưu hóa hoàn toàn cho đặc điểm sinh học của các giống lợn bản địa cũng là nguyên nhân làm giảm tỷ lệ phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang, một giai đoạn quan trọng trước khi cấy truyền.

2.1. Ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng tế bào trứng lợn noãn bào

Mùa vụ là yếu tố ngoại cảnh có tác động rõ rệt đến sinh lý sinh sản của lợn. Nghiên cứu chỉ ra rằng, buồng trứng lợn Bản thu vào mùa thu và mùa đông thường có số lượng nang trứng chất lượng tốt (kích thước >3mm) cao hơn so với mùa xuân và mùa hè. Sốc nhiệt trong những tháng mùa hè có thể làm giảm quá trình phát triển của tế bào cận noãn, làm chậm quá trình giảm phân và giảm tỷ lệ sống của trứng. Điều này trực tiếp ảnh hưởng đến nguồn nguyên liệu đầu vào cho quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở lợn. Tế bào trứng lợn (noãn bào) thu trong điều kiện thời tiết bất lợi thường có tỷ lệ trưởng thành và phát triển thành phôi sau thụ tinh thấp hơn đáng kể, đòi hỏi phải có sự điều chỉnh quy trình cho phù hợp.

2.2. Vấn đề thụ tinh đa tinh trùng polyspermy phổ biến ở lợn

Thụ tinh đa tinh trùng là hiện tượng nhiều hơn một tinh trùng xâm nhập vào một tế bào trứng, gây ra sự bất thường về di truyền và làm phôi chết sớm. Ở lợn, tỷ lệ này đặc biệt cao, có thể lên đến 30-40% ngay cả trong điều kiện thụ tinh tự nhiên và còn cao hơn trong môi trường in vitro. Nguyên nhân được cho là do cơ chế phong tỏa màng sáng (zona pellucida) của trứng lợn sau khi tinh trùng đầu tiên xâm nhập không hoàn thiện. Chất lượng trứng trưởng thành trong ống nghiệm chưa đạt mức tối ưu như trong cơ thể cũng góp phần làm tăng tỷ lệ này. Việc kiểm soát nồng độ tinh trùng, thời gian thụ tinh và bổ sung các yếu tố đặc hiệu vào môi trường là những giải pháp đang được nghiên cứu để giảm thiểu hiện tượng này.

III. Hướng dẫn quy trình trưởng thành noãn trong ống nghiệm IVM

Quy trình trưởng thành noãn trong ống nghiệm (In Vitro Maturation - IVM) là bước đầu tiên và mang tính quyết định trong toàn bộ hệ thống tạo phôi. Đây là quá trình nuôi cấy các noãn bào chưa trưởng thành, được thu nhận từ buồng trứng của lợn, trong một môi trường nhân tạo để chúng hoàn tất quá trình giảm phân và đạt đến giai đoạn Kỳ giữa II (MII), sẵn sàng cho việc thụ tinh. Chất lượng của giai đoạn IVM ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ thụ tinh và chất lượng phôi nang sau này. Quy trình bắt đầu bằng việc thu thập buồng trứng từ các cơ sở giết mổ, sau đó chọc hút các nang trứng có kích thước phù hợp (thường là 3-6mm) để thu nhận các phức hợp noãn-tế bào cumulus (COCs). Các COCs chất lượng tốt (loại A và B) sẽ được lựa chọn và đưa vào môi trường nuôi cấy chuyên biệt. Môi trường nuôi cấy phôi cho IVM thường là TCM-199 hoặc NCSU-37, được bổ sung các hormone như FSH, LH, EGF và các chất hỗ trợ như dịch nang trứng (pFF) hoặc huyết thanh để thúc đẩy sự trưởng thành đồng bộ của cả nhân và tế bào chất. Quá trình nuôi cấy kéo dài khoảng 42-44 giờ trong tủ cấy CO2 ở 38.5°C.

3.1. Kỹ thuật thu nhận và đánh giá chất lượng noãn bào từ buồng trứng

Chất lượng noãn bào ban đầu là yếu tố tiên quyết. Buồng trứng sau khi thu về cần được bảo quản và vận chuyển trong dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung kháng sinh ở nhiệt độ 25-30°C. Tại phòng thí nghiệm, các nang trứng trên bề mặt buồng trứng được chọc hút bằng kim tiêm để thu dịch nang chứa noãn. Dịch nang sau đó được kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi để tìm và lựa chọn các phức hợp noãn-tế bào cumulus (COCs). Các COCs được phân loại dựa trên hình thái học: loại A và B có lớp tế bào cumulus dày, đều và tế bào chất đồng nhất được xem là có chất lượng tốt nhất và được ưu tiên sử dụng cho các bước tiếp theo của quy trình phôi học động vật.

3.2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để tăng tỷ lệ trưởng thành

Thành phần của môi trường nuôi cấy phôi đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Các nghiên cứu từ Viện Chăn nuôi và các trung tâm quốc tế đã chỉ ra rằng, việc bổ sung dịch nang trứng lợn (pFF) hoặc các yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) vào môi trường nền (như TCM-199) giúp cải thiện đáng kể sự giãn nở của tế bào cumulus và sự trưởng thành của tế bào chất. Bên cạnh đó, việc sử dụng các chất ức chế tạm thời quá trình giảm phân như dbcAMP trong 20-22 giờ đầu của quá trình nuôi cấy giúp đồng bộ hóa sự trưởng thành giữa nhân và tế bào chất, từ đó nâng cao khả năng phát triển của phôi sau này. Việc tối ưu hóa các thành phần này cho từng giống lợn bản địa là một hướng nghiên cứu cần thiết.

IV. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm ở lợn IVF hiệu quả

Sau khi noãn bào đã trưởng thành qua giai đoạn IVM, bước tiếp theo là thụ tinh trong ống nghiệm ở lợn (In Vitro Fertilization - IVF). Đây là quá trình cho tinh trùng và trứng kết hợp trong một đĩa nuôi cấy để tạo ra hợp tử. Để đạt hiệu quả cao, cả tinh trùng và môi trường thụ tinh đều cần được chuẩn bị kỹ lưỡng. Tinh trùng, có thể là tinh tươi hoặc tinh đã qua đông lạnh, phải được xử lý để loại bỏ tinh tương và kích hoạt khả năng thụ tinh (capacitation). Quá trình này thường bao gồm các bước ly tâm, rửa và ủ trong môi trường chuyên biệt. Nồng độ tinh trùng sử dụng trong IVF là một yếu tố then chốt; nồng độ quá cao sẽ làm tăng nguy cơ đa thụ tinh, trong khi quá thấp sẽ làm giảm tỷ lệ thụ tinh. Môi trường thụ tinh thường là môi trường Pig-FM hoặc TALP, được bổ sung các chất như caffeine và BSA để tăng cường hoạt động của tinh trùng và hỗ trợ quá trình xâm nhập vào trứng. Sau khi cho trứng và tinh trùng tiếp xúc trong khoảng 5-6 giờ, các trứng sẽ được chuyển sang môi trường nuôi cấy phôi (IVC) để tiếp tục phát triển. Toàn bộ quy trình này được gọi là kỹ thuật IVM-IVF-IVC.

4.1. Kỹ thuật xử lý và đông lạnh tinh trùng phôi lợn

Bảo quản vật liệu di truyền là một phần không thể thiếu của CNSHSS. Kỹ thuật đông lạnh phôi lợn và tinh trùng giúp lưu trữ nguồn gen quý trong thời gian dài. Tinh trùng lợn rất nhạy cảm với sốc lạnh, do đó quy trình đông lạnh đòi hỏi các chất bảo quản lạnh (cryoprotectant) và quy trình hạ nhiệt độ được kiểm soát chặt chẽ. Tinh trùng thu từ mào tinh hoàn thường có khả năng chịu lạnh tốt hơn. Đối với phôi, phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) đang được áp dụng phổ biến do tỷ lệ sống sau rã đông cao. Kỹ thuật này sử dụng nồng độ chất bảo quản lạnh cao và tốc độ làm lạnh cực nhanh để ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá gây hại cho tế bào.

4.2. Quy trình nuôi cấy phôi lợn IVC đến giai đoạn phôi nang

Sau khi thụ tinh, các hợp tử được chuyển sang giai đoạn nuôi cấy phôi lợn (In Vitro Culture - IVC). Giai đoạn này mô phỏng môi trường trong ống dẫn trứng và tử cung của lợn mẹ để phôi có thể phân chia và phát triển. Môi trường nuôi cấy thường dùng là PZM-3 hoặc NCSU-23, chứa các axit amin, vitamin và nguồn năng lượng cần thiết. Phôi được nuôi trong tủ cấy với điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và thành phần khí quyển (5% CO2, 5% O2, 90% N2) được kiểm soát nghiêm ngặt. Sau khoảng 6-7 ngày nuôi cấy, phôi sẽ phát triển đến giai đoạn phôi nang (blastocyst), có cấu trúc rõ ràng với khối tế bào bên trong (ICM) và lớp dưỡng bào (trophectoderm). Phôi đạt đến giai đoạn này được xem là có chất lượng phôi nang tốt và sẵn sàng cho việc cấy truyền phôi hoặc đông lạnh.

V. Ứng dụng công nghệ nhân bản vô tính để nhân giống lợn quý hiếm

Bên cạnh thụ tinh trong ống nghiệm, nhân bản vô tính (NBVT) hay kỹ thuật chuyển nhân tế bào soma (SCNT) là một công cụ công nghệ sinh học sinh sản mạnh mẽ, đặc biệt có ý nghĩa trong việc nhân giống lợn quý hiếm. Kỹ thuật này cho phép tạo ra một cá thể mới có bộ gen gần như giống hệt cá thể cho nhân mà không cần qua sinh sản hữu tính. Quy trình NBVT bao gồm việc lấy một tế bào trứng đã trưởng thành (tế bào nhận), loại bỏ vật chất di truyền (nhân) của nó. Sau đó, một tế bào soma (ví dụ như tế bào da, tế bào tai) từ cá thể lợn cần nhân bản (cá thể cho nhân) được đưa vào bên trong tế bào trứng đã loại nhân. Một xung điện nhẹ được sử dụng để dung hợp hai tế bào và kích hoạt phôi tái tổ hợp bắt đầu phân chia, phát triển giống như một phôi bình thường. Phôi nhân bản sau đó được nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang và cấy vào tử cung của lợn mẹ mang thai hộ. Kỹ thuật này mở ra cơ hội phục hồi các giống đã tuyệt chủng hoặc có số lượng rất ít, miễn là còn mẫu tế bào soma được lưu trữ.

5.1. Quy trình cấy chuyển nhân tế bào soma vào noãn đã loại nhân

Quy trình NBVT đòi hỏi sự chính xác và tinh vi cao. Noãn bào lợn sau khi trưởng thành trong ống nghiệm (IVM) được xử lý để loại bỏ thể cực và bộ nhiễm sắc thể. Việc loại nhân được thực hiện dưới kính hiển vi vi phẫu với sự hỗ trợ của các dụng cụ vi thao tác. Cùng lúc đó, tế bào soma từ cá thể cần nhân bản được nuôi cấy và đưa về giai đoạn G0/G1 của chu kỳ tế bào để đảm bảo sự tương thích với tế bào chất của trứng. Tế bào soma sau đó được tiêm vào khoang quanh noãn hoàng của trứng đã loại nhân. Quá trình dung hợp và kích hoạt bằng xung điện là bước cuối cùng để khởi động sự phát triển của phôi nhân bản.

5.2. Tiềm năng phục tráng giống vật nuôi và tạo ngân hàng gen lợn

Ứng dụng lớn nhất của NBVT là khả năng phục tráng giống vật nuôi. Khi một giống lợn quý hiếm chỉ còn lại vài cá thể, NBVT có thể tạo ra các bản sao di truyền, làm tăng nhanh số lượng cá thể thuần chủng và duy trì nguồn gen. Hơn nữa, kết hợp với công nghệ đông lạnh, các tế bào soma từ những cá thể lợn ưu tú hoặc các giống đang bị đe dọa có thể được lưu trữ vô thời hạn. Khi cần, những tế bào này có thể được sử dụng để tái tạo lại cá thể sống thông qua NBVT. Điều này hình thành nên một ngân hàng gen lợn toàn diện, không chỉ lưu trữ tinh trùng hay phôi mà còn cả tế bào soma, mang lại sự linh hoạt và an toàn tối đa cho công tác bảo tồn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn 1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào trứng (giao tử cái-noãn bào). Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu.

Buồng trứng ở các loài gia súc là một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tử cung (buồng trứng phải và buồng trứng trái). Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài. Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có chức năng tạo tế bào trứng, tổng hợp các hormone progesterone và estrogen.

Phía ngoài cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lập phương tạo thành lớp biểu mô bao phủ toàn bộ bề mặt buồng trứng. Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô kiên kết. Phía dưới lớp này là nhu mô chứa các nang trứng và các tế bào chức năng khác [3]. Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.

Nang trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi của chúng [3]. Trong quá trình phát triển nang (folliculogenesis), nang không có xoang di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, tạo thành nang có xoang, phát triển tiếp thành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng. Tế bào cận noãn của trứng trong các nang thứ cấp tiết ra dịch, phát triển và tách rời, từ đó hình thành nang có xoang. Tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng).

Các hoạt động tổng hợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắc thể liên kết chặt chẽ với nhau trong quá trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời sự thành thục nhân và thành thục tế bào chất [4]. 5 Trứng sơ cấp Nang sơ cấp Nang phát triển Trứng thứ cấp Mạch Nang Nang máu nguyên thủy thành thục Bạch thể Nang vỡ Thể vàng Giải phóng trứng Thể vàng giai đoạn sớm Hình 1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú [5]. Ở lợn, các tế bào mầm nguyên thủy xuất hiện vào ngày 18 sau thụ tinh và tuyến sinh dục bắt đầu hình thành vào giai đoạn phôi 24-26 ngày tuổi.

Sau khi sinh, mỗi cá thể lợn cái có khoảng 500.000 nang nguyên thủy gồm một tế bào trứng được bao quanh bởi một lớp tế bào cận noãn [6]. Ước tính thời gian để nang nguyên thủy phát triển thành nang thứ cấp là 84 ngày và sau đó cần thêm 19 ngày để đạt được đến giai đoạn nang thành thục [7]; [8]. Các giai đoạn phát triển của nang liên quan chặt chẽ với sự gia tăng kích thước và sự thành thục của trứng (Hình 1. Trong giai đoạn đầu, kích thước của nang và của tế bào trứng có sự biến đổi song song và tuyến tính.

Ở các giai đoạn tiếp sau, tế bào trứng bước vào quá trình phân chia giảm phân và đạt kích thước gần như tối đa, kích thước của trứng không đổi nhưng kích thước nang tiếp tục tăng trưởng [9]. Đường kính tế bào trứng tăng từ khoảng 30 µm đến 120 µm và trứng hoàn thành quá trình tăng trưởng trong các nang 1,8 mm. Trứng lợn ở giai đoạn này có hình cầu, đường kính trứng không màng sáng dao động trong khoảng 120-170 µm [10]. 6 84 ngày 14 ngày 19 ngày Nang nguyên Sự hình thành Trước khi thủy khoang rụng trứng Đường kính trứng Đường kính Nang hình nang và sự Trước rụng 8-10mm thành phát triển trứng rụng trứng Hình 1.

Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân [8]. Quá trình phát triển của trứng (oogeneisis) từ khi hình thành đến khi thành thục, có khả năng thụ tinh trải qua các giai đoạn biến đổi về hình thái và chức năng, phân chia giảm nhiễm đặc trưng cho các loài động vật có vú [11]. Giai đoạn tăng số lượng noãn nguyên thủy diễn ra khi cá thể cái chưa thành thục về tính, bắt đầu từ ngày thứ 13 sau thụ tinh cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh. Noãn nguyên thủy gồm một tế bào trứng (ovocyt I) được bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng, dẹt được sinh ra từ biểu mô mầm của bào thai.

Số lượng noãn nguyên thủy được tăng lên do quá trình phân chia nguyên phân lặp lại liên tiếp nhiều lần, các noãn bào được hình thành ở giai đoạn này đều mang bộ nhiễm sắc thể 2n. Giai đoạn sinh trưởng với đặc điểm các noãn nguyên thủy tích lũy chất dinh dưỡng, tăng kích thước và khối lượng, phát triển thành các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I. Tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n. Noãn sơ cấp của lợn bao gồm một ovocyt I có đường kính khoảng 30-60 µm, nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng.

Noãn thứ cấp gồm một ovocyt I đã phát triển lớn hơn và chứa nhiều noãn hoàng. Vỏ của ovocyt I dày lên tạo thành màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh. Ovocyt I có đường kính khoảng 120- 150 µm [12]. Giai đoạn hình thành trứng khi noãn bào cấp I trải qua hai lần phân bào giảm phân liên tiếp để tạo một trứng và ba cực cầu đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội 1n.

Ở 7 lần phân bào I, noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (noãn bào thứ cấp) có khối lượng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàng của noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thước bé (cực cầu thứ nhất). Ở lần phân bào II, noãn bào cấp II phân chia hình thành tế bào trứng có kích thước lớn và cực cầu bé thứ hai, cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia thành hai cực cầu bé. Giai đoạn thành thục trứng xảy ra sau khi các quá trình phân chia giảm phân kết thúc. Quá trình thành thục của trứng lợn.

a: Phức hợp tế bào cận noãn và noãn chưa thành thục, b: Tế bào cận noãn đang phát triển xung quanh, c: Tế bào cận noãn đang giãn nở, d: Trứng thành thục có thể cực (mũi tên) (100X) [13]. Trứng lợn thành thục khoảng 38-42 giờ sau khi xuất hiện đỉnh LH (luteinizing hormone). Trứng chứa nhiều noãn hoàng hơn, nhân to, tròn và rõ (Hình 1. Bao quanh tế bào trứng là màng trong suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ.

Màng trong suốt bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dưỡng tế bào trứng. Màng tế bào chất là lớp màng mỏng bao bọc lấy tế bào chất và nhân, còn được gọi là màng noãn hoàng. Màng này có tác dụng nuôi dưỡng tế bào trứng đã thụ tinh. Đĩa trứng hình thành từ các tế bào cận noãn dày lên xung quanh hai bên ovocyt I.

Sự rụng trứng xảy ra khi trứng phân chia đến giai đoạn kỳ giữa II (Metaphase II-M. Sự thành thục của trứng bao gồm thành thục của nhân và thành thục tế bào chất là hai quá trình thành thục cần phải cùng được hoàn thành trước khi rụng trứng. Thông thường tế bào trứng được coi là thành thục khi xuất hiện thể cực thứ nhất (sự thành thục về nhân) và trứng đang ở giai đoạn M. Mặc dù tế bào trứng đã thành thục về 8 nhân có khả năng thụ tinh với tinh trùng, tuy nhiên sự thành thục về tế bào chất chưa được hoàn thiện có thể dẫn đến sự thiếu hụt một số chất có ảnh hưởng quan trọng lên sự phát triển của phôi [14].

Trạng thái nang có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn in vitro. Trứng được thu từ các nang có kích thước ≥ 3 mm có khả năng phát triển đến giai đoạn thành thục hoàn toàn trong điều kiện nuôi in vitro, trong khi trứng được thu từ nang có kích thước từ 0,8 mm đến 2,9 mm có tỷ lệ thành thục thấp sau khi nuôi cấy 48 giờ và trứng thu từ các nang có kích thước < 0,7 mm không có khả năng hoàn thành quá trình phân chia giảm nhiễm [15], [16]. Quá trình giảm phân của tế bào trứng được diễn ra dưới tác động của cyclin B p34cdc2 được coi là nhân tố kích thích thành thục (MPF) và mitogen-activated protein (MAP) kinase (một protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen, đặc trưng cho các axit amin serine và threonine). Đây là hai nhân tố đặc biệt quan trọng kiểm soát quá trình giảm phân.

MPF là một thành phần quan trọng liên quan hoạt động của nhân tố ức chế quá trình nhân lên của tế bào (CFS). Mức độ hoạt động của MPF được đánh giá thông qua phép đo hoạt tính của histone H1 kinase ( một loại enzyme xúc tác hoạt động của Histone H1-một trong năm họ protein histone chính là thành phần của chất nhiễm sắc trong các tế bào nhân chuẩn). Quá trình kích thích này gây ra một loạt các phản ứng và kết quả dẫn đến sự phá vỡ màng nhân, nhiễm sắc thể đóng xoắn và gắn vào các thoi vô sắc, trứng chuyển sang giai đoạn MII, sẵn sàng cho quá trình thụ tinh và tạo phôi. Hoạt động của MPF đạt mức cao nhất khi trứng ở giai đoạn MII và giảm xuống khi trứng được hoạt hóa [17].

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về sự thành thục tế bào chất của trứng động vật nói chung và trứng lợn nói riêng, nhưng cho đến nay quá trình này vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ. Bên cạnh đó, quá trình này được mô tả ở những thay đổi siêu cấu trúc diễn ra trong tế bào trứng từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII. Những thay đổi siêu cấu trúc trong tế bào chất bao gồm sự phân bố lại các bào quan, sắp xếp lại các vi ống, hệ phức hợp Golgi, các cơ quan bài tiết, quá trình vận chuyển mRNA đến tế bào chất [18]. Sự liên kết giữa tế bào cận noãn và tế bào trứng là yếu tố quan trọng điều hòa các hoạt động bên trong tế bào chất và qua đó ảnh hưởng đến sự thành thục của tế bào chất.