MỞ ĐẦU Máu đƣợc xem là một loại thuốc đặc biệt đƣợc sử dụng trong điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa và triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp nhƣ ghép tạng, mổ tim, lọc máu ngoài thận. Tuy nhiên, có rất nhiều tai biến nguy hiểm xảy ra khi sử dụng máu trong điều trị bệnh do có sự ngƣng kết giữa kháng nguyên trên màng hồng cầu ngƣời cho với kháng thể trong huyết thanh của ngƣời nhận. Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế đã thống kê có 35 hệ nhóm máu với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau. Hầu hết các kháng nguyên trên màng hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu đƣợc dùng để nghiên cứu di truyền và quan hệ huyết thống, chỉ có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây ra phản ứng ngƣng kết khi truyền máu dẫn đến tai biến đó là kháng nguyên A, B của hệ nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ nhóm máu Rh.
Để truyền máu thành công phải có sự tƣơng thích giữa máu ngƣời cho và ngƣời nhận. Do đó, trƣớc khi truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu. Nhóm máu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ngƣng kết sử dụng hồng cầu mẫu hoặc huyết thanh mẫu. Huyết thanh mẫu chính là các kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB đƣợc sử dụng trong xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ Rh.
Nhiều phƣơng pháp đƣợc phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng nhƣ công nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp. Phƣơng pháp lai tế bào đã đƣợc đƣợc ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO. Hiện nay, thuốc thử xác định nhóm máu có bản chất là các kháng thể đơn dòng đã đƣợc sản xuất thành công nhƣ Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti – A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad)…. Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy nhu cầu sử dụng huyết thanh mẫu ngày càng gia tăng.
Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chƣa sản xuất đƣợc kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu mẫu thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại. Việc sử dụng thuốc thử xác định nhóm máu là hồng cầu mẫu tốn ít chi phí nhƣng lại mất rất nhiều Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : skknchat@gmail.com 2 máu thu đƣợc từ tình nguyện viên. Còn việc sử dụng huyết thanh mẫu nhập ngoại lại có giá thành cao nhƣ vậy chi phí để mua huyết thanh mẫu dùng trong xác định nhóm máu cho số lƣợng máu thu gom hàng năm lên đến hàng trăm tỷ đồng sẽ làm tăng gánh nặng kinh tế đối với bệnh nhân. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài“Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người” với mục tiêu tạo ra dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A sử dụng nhƣ thuốc thử xác định nhóm máu A ở ngƣời.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : skknchat@gmail.com 3 NỘI DUNG Chƣơng 1. Tổng quan về miễn dịch 1. Hệ miễn dịch Hệ thống miễn dịch là một tập hợp của các tế bào, các mô và các phân tử có vai trò bảo vệ cơ thể chống lại một lƣợng lớn các tác nhân gây bệnh (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng), sự sinh trƣởng của các tế bào ung thƣ và các độc tố của môi trƣờng [35]. Lớp phòng thủ thứ nhất giúp cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh là hàng rào vật lý (da và màng nhày).
Lớp phòng thủ này bao gồm các enzyme và dịch nhày có thể tấn công trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc ức chế tác nhân gây bệnh để ngăn chặn sự xâm nhập của chúng. Tuy nhiên, bề mặt keratine của da hoặc khoang cơ thể chứa dịch nhày là môi trƣờng lý tƣởng cho hầu hết sinh vật do đó tác nhân gây bệnh có thể vƣợt qua hàng rào vật lý này. Khi tác nhân gây bệnh vƣợt qua lớp phòng thủ thứ nhất đi vào cơ thể, nó sẽ chạm trán với hệ thống miễn dịch của cơ thể. Thành phần của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu [36] Hệ thống này đƣợc chia thành hai loại: 1) hệ thống miễn dịch bẩm sinh đáp ứng nhanh và không đặc hiệu, 2) hệ thống miễn dịch thích ứng đáp ứng chậm và đặc hiệu với từng tác nhân gây bệnh.
Mỗi loại khác nhau về cách nó đáp ứng với tác nhân gây Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : skknchat@gmail. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm các hàng rào (vật lý, hóa học, sinh học), thành phần tế bào (các tế bào thực bào, tế bào giết tự nhiên, tế bào tua) và thành phần hóa học (protein bổ thể, các cytokine và protein cấp). Đặc điểm nổi bật của hệ thống miễn dịch bẩm sinh là thiếu trí nhớ miễn dịch do vậy các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh duy trì không thay đổi mặc dù tiếp xúc với kháng nguyên nhiều lần. Tế bào thực bào gồm đại thực bào (macrophage) và tế bào bạch cầu trung tính (neutrophil).
Tế bào đại thực bào có các thụ thể carbohydrate cho phép nó phân biệt các tế bào của cơ thể và các tế bào lạ. Các tế bào thực bào nuốt tác nhân gây bệnh vào trong phagosome. Sau đó, phagosome dung hợp với lysosome chứa các enzyme và các chất hóa học để phân giải tác nhân gây bệnh bằng cách giải phóng lƣợng lớn gốc oxy tự do. Tế bào đại thực bào không chỉ tiêu diệt tác nhân gây bệnh mà nó còn tiêu diệt các tế bào già, tế bào chết hoặc các tế bào bị tổn thƣơng của cơ thể.
Quá trình thực bào [40] Tế bào tua (Dendritic Cell – DC) là thành phần tế bào chính của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh. Tế bào này có mặt trong nhiều mô khác nhau, ở da nó đƣợc gọi là tế bào Langerhans. Nó là tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen presenting cell – APC) có chức năng chính là xử lý kháng nguyên và trình diện kháng nguyên trên bề mặt tế bào T của hệ thống miễn dịch. Tế bào giết tự nhiên (natural killer cell - NK cell) không tấn công trực tiếp tác nhân gây bệnh mà chúng giết chết tế bào của cơ thể đã bị lây nhiễm tác nhân gây bệnh.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : skknchat@gmail.com 5 Tế bào giết tự nhiên giết tế bào bằng cách hình thành lỗ hổng trên màng tế bào. Perforin đƣợc giải phóng bởi tế bào giết tự nhiên và chèn vào màng tế bào của tế bào bị lây nhiễm để tạo thành lỗ trên màng. Lỗ này cho phép nƣớc đi vào làm tế bào căng lên sau đó vỡ ra. Tế bào giết tự nhiên cũng tấn công các tế bào ung thƣ trƣớc khi chúng có thể thay đổi để phát triển thành khối u.
Bổ thể gồm 20 loại protein khác nhau tuần hoàn tự do trong máu. Khi chúng tiếp xúc với vi khuẩn hoặc thành tế bào nấm, những protein này ngƣng kết lại tạo thành phức hợp tấn công màng và chèn vào màng tế bào của tế bào lạ sau đó hình thành lỗ tƣơng tự nhƣ tế bào NK. Một vài protein khác nhƣ interferon α, β, đóng vai trò nhƣ những phân tử tín hiệu bảo vệ các tế bào bình thƣờng khi tiếp xúc với các tế bào đã bị lây nhiễm. Cách tế bào NK và protein bổ thể tạo lỗ trên màng để tiêu diệt tế bào lây nhiễm tác nhân gây bệnh [26] Sự kết hợp của các tế bào thực bào, tế bào giết tự nhiên và hệ thống bổ thể một cách hiệu quả giúp loại bỏ hầu hết vi khuẩn và nấm.
Tuy nhiên, các tác nhân gây bệnh cụ thể có thể tiến hóa để ẩn nấp bên trong tế bào chủ khi các tế bào thực bào và bổ thể không thể bắt lấy chúng [26]. Hệ thống miễn dịch thích ứng Bề mặt của hầu hết tế bào động vật có xƣơng sống chứa glycoprotein đƣợc sản xuất bởi phức hợp tƣơng hợp mô chính (Major histocompatibility complex – MHC). Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : skknchat@gmail.com 6 Những glycoprotein này đƣợc gọi là protein MHC và ở ngƣời nó là protein HLA (human leukocyte antigen). Gen mã hóa protein MHC có độ đa hình cao do đó hiếm khi hai cá thể có cùng một MHC.
Chính vì vậy, MHC đƣợc sử dụng nhƣ một marker để phân biệt các tế bào của cơ thể và các tế bào lạ. Có 2 lớp protein MHC. MHC lớp I có mặt trên mọi tế bào có nhân của cơ thể. Tuy nhiên, MHC lớp II chỉ đƣợc tìm thấy trên tế bào đại thực bào, tế bào B và tế bào T CD4+.
Ba loại tế bào này làm việc với nhau trong một dạng của đáp ứng miễn dịch và maker protein MHC – II của chúng cho phép chúng nhận diện các tế bào khác. Tế bào T độc (phá hủy tế bào lây nhiễm) có đồng thụ thể CD8+ chỉ tƣơng tác với kháng nguyên hiện diện cùng với protein MHC – I của tế bào bị lây nhiễm. Tế bào T trợ giúp có thụ thể CD4+ chỉ có thể tƣơng tác với kháng nguyên hiện diện cùng với protein MHC – II của các tế bào lympho khác. Tế bào T bám vào kháng nguyên lạ liên kết với protein MHC [26] Khi các phân tử lạ xâm nhập vào cơ thể, nó có thể lây nhiễm vào các tế bào của cơ thể hoặc bị bắt bởi các tế bào APC.
Trong tế bào, kháng nguyên của phân tử lạ đƣợc xử lý và chuyển đến màng tế bào. Ở màng tế bào, kháng nguyên đã xử lý đƣợc kết hợp với protein MHC – I và điều này cho phép tế bào T độc (T CD8+) nhận diện sự có mặt của kháng nguyên khi chúng hiện diện cùng với protein MHC – I. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : skknchat@gmail. Kháng nguyên đƣợc hiện diện cùng protein MHC [26] (A.
Tế bào của cơ thể có protein MHC trên bề mặt để xác định chúng là các tế bào tự thân. Hệ thống miễn dịch không tấn công các tế bào này; B. Tế bào lạ hoặc vi sinh vật có kháng nguyên trên bề mặt.