Báo cáo đề tài: Tạo dòng và biểu hiện gen protease trong vi khuẩn Bacillus subtilis

Nghiên cứu chi tiết về tạo dòng và biểu hiện gen protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis, ứng dụng trong công nghiệp, thực phẩm và y học.

• Tác giả: Nguyễn Văn Song
• Người hướng dẫn: Pgs. Nguyễn Hoàng Lộc
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tạo dòng và biểu hiện gen protease trong vi khuẩn Bacillus subtilis
• Loại tài liệu: Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài
• Năm xuất bản: 2009
• Địa điểm: Huế

Tóm tắt

I. Tổng quan về Protease và Vi khuẩn Bacillus subtilis

Protease là một loại enzyme quan trọng trong công nghệ sinh học hiện đại, có khả năng phân hủy các liên kết peptide trong các protein. Vi khuẩn Bacillus subtilis được biết đến như một tổ chức sản xuất protease ngoại bào hiệu quả cao. Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen protease trong Bacillus subtilis đã mở ra những cơ hội mới trong sản xuất enzyme công nghiệp. Các protease từ Bacillus subtilis có đặc tính ổn định, dễ kiểm soát và an toàn cho các ứng dụng công nghiệp và y tế.

1.1. Đặc điểm của Protease

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, chuyên phân hủy các liên kết peptide. Các protease có khả năng hoạt động ở nhiều điều kiện pH khác nhau, đặc biệt là protease trung tính. Chúng có độ ổn định cao, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 37-50°C. Khả năng biểu hiện gen protease trong Bacillus subtilis cho phép sản xuất lượng lớn enzyme với chi phí thấp hơn so với các nguồn khác.

1.2. Tầm quan trọng của Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là một vi khuẩn Gram-dương được sử dụng rộng rãi trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Ưu điểm chính là khả năng tiết các protein ngoại bào cao và an toàn sinh học. Sử dụng Bacillus subtilis để tạo dòng gen mã hóa protease giúp tăng năng suất sản xuất enzyme trong điều kiện nuôi cấy công nghiệp.

II. Quy trình Tạo dòng và Biểu hiện Gen Protease

Quá trình tạo dòng gen protease trong Bacillus subtilis bao gồm nhiều bước kỹ thuật phức tạp. Đầu tiên, DNA tổng số được tách chiết từ các chủng Bacillus chứa gen nprE (gen mã hóa protease trung tính). Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại phần gen quan tâm với các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được chèn vào plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp vào các tế bào Bacillus subtilis. Cuối cùng, thực hiện cảm ứng biểu hiện gen bằng IPTG để phát sinh protease ngoại bào có hoạt tính cao.

2.1. Tách chiết DNA và Khuếch đại PCR

Tách chiết DNA tổng số từ chủng Bacillus subtilis hoang dã được thực hiện bằng phương pháp enzyme lytic. Gen nprE được khuếch đại sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu NPF và NPC. Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1566 bp, được kiểm tra bằng điện di agarose. Trình tự nucleotide của sản phẩm được xác định và so sánh với cơ sở dữ liệu để đảm bảo độ chính xác của gen protease.

2.2. Tạo Plasmid tái tổ hợp và Biểu hiện

Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn SacI và chèn vào vector plasmid. Plasmid tái tổ hợp được chuyển nạp vào Bacillus subtilis bằng phương pháp electroporation. Cảm ứng biểu hiện gen protease được thực hiện bằng IPTG ở nồng độ tối ưu. Protease ngoại bào được tiết ra môi trường nuôi cấy có thể tách chiết và sử dụng cho các ứng dụng công nghiệp.

III. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất Protease ngoại bào

Khả năng sản xuất protease ngoại bào bị ảnh hưởng bởi nhiều điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nhiệt độ cảm ứng là một trong những nhân tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động của RNA polymerase và sự biểu hiện gen. Thời gian cảm ứng quyết định mức độ tích lũy của protease trong tế bào và môi trường ngoài. Nồng độ IPTG kiểm soát mức độ kích hoạt của promoter T7 trong vector biểu hiện. Ngoài ra, mật độ tế bào ban đầu, nồng độ Ca²⁺ và thành phần môi trường nuôi cấy cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tối ưu hóa sản xuất protease trung tính.

3.1. Ảnh hưởng của Nhiệt độ và Thời gian Cảm ứng

Nhiệt độ cảm ứng tối ưu thường nằm trong khoảng 37-42°C để đạt hoạt tính protease cao nhất. Khi nhiệt độ quá thấp, sự biểu hiện gen diễn ra chậm; khi quá cao, protein có thể biến tính. Thời gian cảm ứng từ 4-16 giờ cho phép tích lũy lượng protease đáng kể. Kết hợp tối ưu hai yếu tố này giúp sản xuất protease ngoại bào đạt hiệu quả tối đa trong điều kiện công nghiệp.

3.2. Nồng độ IPTG Mật độ tế bào và Ca²

Nồng độ IPTG tối ưu thường ở mức 0,1-1,0 mM để cảm ứng biểu hiện gen protease mà không gây độc tính cho tế bào. Mật độ tế bào cao (OD600 = 0,6-0,8) cung cấp đủ machinery sinh học cho sản xuất protease. Ion Ca²⁺ ổn định cấu trúc 3D của protease trung tính và tăng cường hoạt tính enzyme. Việc kiểm soát các yếu tố này đảm bảo sản xuất protease ngoại bào ổn định và hiệu quả cao.

IV. Ứng dụng và Triển vọng của Protease từ Bacillus subtilis

Protease sản xuất từ Bacillus subtilis có nhiều ứng dụng thực tiễn quan trọng trong các ngành công nghiệp. Trong công nghiệp xà phòng, enzyme này giúp loại bỏ vết bẩn protein trên quần áo. Công nghiệp thuộc da sử dụng protease để xử lý và mềm da. Lĩnh vực chế biến thủy sản áp dụng enzyme để tách chiết collagen và gelatin. Trong công nghiệp thực phẩm, protease trung tính được dùng để làm mềm thịt, sản xuất các sản phẩm thủy phân protein. Các ứng dụng y học bao gồm điều trị viêm, hỗ trợ tiêu hóa và tái tạo mô. Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen protease mở ra triển vọng sản xuất enzyme với chi phí thấp hơn, hiệu suất cao hơn.

4.1. Ứng dụng công nghiệp của Protease

Protease ngoại bào từ Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong xà phòng để cải thiện hiệu quả giặt giũ. Công nghiệp thuộc da sử dụng protease để xử lý lông và mô liên kết. Chế biến thủy sản tận dụng enzyme để sản xuất cơm, gelatin chất lượng cao. Công nghiệp thực phẩm dùng protease để tạo protein thủy phân, cải thiện độ tiêu hóa. Với khả năng sản xuất protease hiệu quả từ Bacillus subtilis, chi phí sản xuất giảm đáng kể so với enzyme tự nhiên.

4.2. Triển vọng y tế và phát triển công nghệ

Protease trung tính có tiềm năng trong điều trị viêm, hỗ trợ tiêu hóa protein phức tạp. Nghiên cứu biểu hiện gen protease trong Bacillus subtilis cho phép sản xuất enzyme an toàn sinh học phù hợp cho ứng dụng y tế. Công nghệ DNA tái tổ hợp tiếp tục được phát triển để tạo các chủng Bacillus subtilis siêu sản xuất protease. Triển vọng sử dụng biểu hiện gen protease với các hệ thống bioreactor hiện đại hứa hẹn sản xuất enzyme giá rẻ, hiệu quả phục vụ nhu cầu công nghiệp toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực. Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD [15]; protease (proteinase) là một trong ba nhóm lớn của enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 60% tổng số enzyme thương mại trên thế giới [40], [54]. Protease là enzyme phân giải protein được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, dệt, thuộc da, y tế, nông nghiệp…[7]. Protease có thể là chìa khóa mở ra hướng phát triển mới cho các ngành sản xuất trên.

Protease được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nh ư động vật, thực vật và vi sinh vật. Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đ ã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng r ãi trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme cũng ch ưa có độ tinh sạch cao [15].

Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu về protease từ vi sinh vật bằng con đ ường truyền thống không đáp ứng được việc mở rộng quy mô sản xuất v à ứng dụng của nhóm enzyme n ày trong đời sống. Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) là một bộ phận quan trọng và là công nghệ chìa khóa của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác.

Cải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang đ ược ứng dụng rộng rãi, trong đó có tạo dòng và sản xuất enzyme protease. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen protease trong tế bào Escherichia coli đã được công bố như biểu hiện protease nội bào (PfpI) của Pyrococcus furiosus (Halio và cs. 1996) [37], cysteine protease từ Streptococcus pyogenes (Gubba và cs. 1998) [35], endoprotease của Aeromonas caviae T-64 (Nirasawa và cs.

1999) [50], cysteine protease t ừ Porphyromonas gingivalis (Margetts và cs. 2000) [45], protease ki ềm chịu nhiệt từ Bacillus stearothermophilus F1 (Fu và cs. nematocida (Niu và cs. 2006) [51], và zinc-metalloprotease từ chủng Salinivibrio sp.

AF-2004 (Karbalaei-Heidari và cs. Gen mã hóa enzyme protease trung tính c ủa B. subtilis cũng đã được tạo dòng và biểu hiện trong Lactococcus lacfis spp. lactis JF254 (Riepe và cs.

1994) [61]… Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm tạo dòng gen sản xuất protease trung tính từ vi khuẩn B. subtilis C10 và biểu hiện chúng trong tế bào E. coli để sản xuất enzyme protease tái tổ hợp. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.

Tổng quan về protease 2. Đặc điểm của protease 2. Giới thiệu chung Theo tiêu chuẩn Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế, protease là enzyme xúc tác thủy phân mối liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide [8]. H H H H C C N C + H 2O C C OH + H N C R O H R’ R O H R’ Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp tr ên toàn thế giới đạt trên 500 triệu USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (chiếm khoảng 75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp, chiếm khoảng 60% lượng enzyme được bán trên thế giới (Nguyễn Thị Thảo và cs, 2004) [16].

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, phân bố rất rộng r ãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa, sung vả.) và động vật (gan, dạ dày. Phân loại protease Hội Hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemistry) đ ã thành lập Tiểu ban Enzyme (The Enzyme Commission) vi ết tắt là EC, tiểu ban này đã đưa ra cách phân loại thống nhất dựa trên các loại phản ứng. Theo cách phân loại n ày thì enzyme được chia ra làm sáu lớp lớn đánh số từ 1 đến 6, các số thứ tự n ày cố định cho mỗi lớp. Mỗi enzyme trong hệ thống đ ã được phân loại và đặt tên theo mã bốn chữ số biểu thị phản ứng x úc tác, trong đó con số đầu chỉ lớp, số thứ hai chỉ lớp phụ, số thứ ba chỉ phân lớp phụ v à số thứ tư chỉ rõ số bậc thứ tự của enzyme [7].

Theo cách phân loại của Tiểu ban enzyme th ì protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.21-99) Serine proteinase Aminopeptidase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Metallo proteinase Hình 2. Sơ đồ phân loại protease Sơ đồ trên cho thấy protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. * Exopeptidase: dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác th ủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide v à giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

* Endopeptidase: dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đ ược chia thành bốn nhóm: + Serine: là những enzyme chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm n ày bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao g ồm các enzyme động vật nh ư chymotrypsin, trypsin và elastase. Nhóm subtilisin bao g ồm hai loại enzyme là như subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN.

Các serine protease thư ờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine: là các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các protease thực vật nh ư papain, bromelin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein protease thư ờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đ ặc hiệu cơ chất rộng.

+ Aspartic: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin và renin. Các aspartic protease có ch ứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo: là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nh ư các vi sinh vật bậc cao hơn.

Các metallo protease thư ờng hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid hoạt động ở pH 2-4. - Protease trung tính hoạt động ở pH 7-8. - Protease kiềm hoạt động ở pH 9-11 [16].

Ứng dụng của protease Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận cơ sở của công nghệ sinh học. Sự h ình thành và phát triển của ngành công nghệ enzyme ở nhiều nước thường được bắt đầu từ các enzyme thủy phân, đặc biệt là các enzyme xúc tác cho ph ản ứng thủy phân protein (protease) v à các enzyme phân giải polysaccharide kiểu tinh bột (amylase). L ượng protease được sử dụng trong thực tế chiếm tỷ lệ khá lớn, khoảng 50% to àn bộ chế phẩm enzyme được sử dụng. Các loại carbohydrase chỉ chiếm 28%, còn lại là các enzyme khác [3].

Protease được ứng dụng một cách rộng rãi chủ yếu trong sản xuất xà phòng và trong công nghiệp thực phẩm. Xu hướng gần đây là tập trung phát triển các kỹ thuật có lợi cho môi tr ường, vì vậy protease được dự kiến có ứng dụng rộng rãi để xử lý da (thuộc da) và trong một vài quá trình sinh học khác. Hơn nữa, nhu cầu enzyme trên thế giới đối với các ứng dụng đặc thù thay đổi một cách đáng kể; các protease còn được ứng dụng một cách rộng rãi trong y tế, công nghiệp dược phẩm để sản xuất thuốc. Ứng dụng protease trong công nghiệp sản xuất x à phòng Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, kem mỹ phẩm, thuốc đánh răng, bổ sung vào sản phẩm có tác dụng làm da mịn, làm sạch răng, tẩy mồ hôi, vết bẩn [10].

V ào những năm 60, một nửa số loại bột giặt ở châu Âu, châu Mỹ đều có chứa protease [4]. Việc sử dụng protease trong bột giặt chiếm khoảng 25% l ượng enzyme sử dụng trên thế giới. Tất cả protease để sản xuất bột giặt được sử dụng hiện nay trên thị trường là serine protease được sản xuất bởi các chủng Bacillus. Một protease kiềm tính được tìm thấy ở Conidiobolus coronatus phù hợp với bột giặt thương mại sử dụng ở Ấn Độ [29].

Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da Quá trình xử lý da qua các bước như sau: ngâm nước, tẩy lông, làm mềm và tẩy các loại vôi, nhuộm da. Hợp phần chính của da v à lông là protein. Các phương pháp thích h ợp trong quá trình xử lý da có liên quan đến các hóa chất nguy hiểm như Na2SO3 gây ô nhiễm môi trường nước. Việc sử dụng enzyme thay thế hóa chất để loại bỏ lông v à làm mềm da không những hạn chế ô nhiễm môi trường mà còn tiết kiệm được năng lượng.

Hiện nay, trypsin được sử dụng kết hợp với các protease của Bacillus và Aspergillus để làm mềm da [17]. Ứng dụng trong y học Protease làm thuốc chống tắc nghẽn tim mạch, ti êu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm làm tăng tiêu hóa protein, thành ph ần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm [7]. Các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Việc sử dụng các protease trong công nghiệp thực phẩm đ ã có từ lâu đời. Chúng được sử dụng một cách bình thường trong nhiều mục đích khác nhau nh ư sản xuất pho mát, làm bánh nướng, sản xuất bia, chế biến cá, sản xuất dịch thủy phân đậu v à làm mềm thịt [4].

* Công nghiệp sữa Ứng dụng chủ yếu của protease trong công nghiệp sữa l à sản xuất pho mát.