Thiết kế cấu trúc CRISPRa tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 ở lúa TBR225

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRa thiết kế cấu trúc tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 ở giống lúa TBR225 nhằm cải thiện hàm lượng vi chất.

• Tác giả: Lê Ngọc Diệp
• Người hướng dẫn: TS. Lê Quỳnh Mai
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết kế cấu trúc CRISPRa tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 ở lúa TBR225
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về công nghệ CRISPRa và gen OsYSL2

Công nghệ CRISPRa (CRISPR activation) là một hệ thống chỉnh sửa gen tiên tiến cho phép tăng cường biểu hiện gen mà không cần cắt DNA. Khác với CRISPR/Cas9 truyền thống, CRISPRa sử dụng dCas9 kết hợp với các protein kích hoạt như VP64 để tăng cường hoạt động của gen đích. Gen OsYSL2 ở lúa đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển sắt, một vi chất dinh dưỡng thiết yếu cho sức khỏe con người. Giả pháp tăng biểu hiện OsYSL2 có thể cải thiện hàm lượng sắt trong hạt gạo, giúp giải quyết vấn đề thiếu sắt toàn cầu. Nghiên cứu này tập trung vào thiết kế và ứng dụng công nghệ CRISPRa trên giống lúa TBR225, mang lại tiềm năng lớn cho cải tiến giống lúa.

1.1. Vai trò của sắt và vận chuyển sắt ở lúa

Sắt là chất dinh dưỡng quan trọng liên quan đến sốc miễn dịch, tăng trưởng và phát triển ở con người. Ở lúa, protein họ YSL (Yellow Stripe-Like) có trách nhiệm vận chuyển sắt từ nguồn đến đích. Gen OsYSL2 mã hóa protein vận chuyển sắt, giúp hấp thu và tích lũy sắt trong hạt. Việc tăng cường biểu hiện OsYSL2 sẽ nâng cao khả năng vận chuyển sắt, từ đó cải thiện chất lượng dinh dưỡng của gạo.

1.2. Nguyên lý hoạt động của hệ thống CRISPRa

Hệ thống CRISPRa hoạt động thông qua gRNA (guide RNA) định hướng dCas9 đến vùng promoter của gen OsYSL2. Các protein kích hoạt VP64 được gắn kết với dCas9 sẽ tuyển tập các yếu tố phiên mã, từ đó kích hoạt và tăng cường biểu hiện gen mục tiêu mà không gây đột biến DNA. Phương pháp này an toàn, chính xác và có khả năng ứng dụng cao trong cải thiến cây trồng.

II. Thiết kế cấu trúc CRISPRa cho gen OsYSL2

Thiết kế cấu trúc CRISPRa tăng cường biểu hiện OsYSL2 yêu cầu các bước nghiên cứu chi tiết và cẩn thận. Đầu tiên, cần phân tích promoter OsYSL2 để xác định các vùng điều hòa cis quan trọng. Sau đó, thiết kế gRNA đặc hiệu với độ dài 20-21 nucleotide, có thành phần GC thích hợp (40-60%) và cấu trúc bậc hai ổn định. Vector pBUN6A11 được sử dụng để chứa các thành phần CRISPRa, bao gồm dCas9, VP64 và gRNA. Quá trình biến nạp vector vào tế bào được thực hiện thông qua Agrobacterium tumefaciens, một vi khuẩn có khả năng chuyển gen vào thực vật. Thiết kế này được kiểm chứng an toàn bằng đánh giá off-target, đảm bảo không ảnh hưởng đến các gen khác.

2.1. Phân lập và phân tích vùng promoter OsYSL2

Vùng promoter OsYSL2 dài khoảng 1,5 kb, chứa các yếu tố điều hòa quan trọng như TATA box và các vị trí gắn kết nhân tố phiên mã. Nghiên cứu in silico giúp xác định các motif protein bảo thủ và yếu tố cis trên promoter. Phân tích so sánh giữa các giống lúa Indica và Japonica cho thấy độ tương đồng cao, cho phép ứng dụng rộng rãi kỹ thuật này trên các giống lúa khác nhau.

2.2. Thiết kế gRNA và đánh giá tính đặc hiệu

Các gRNA được thiết kế trên vùng upstream 1,5 kb của OsYSL2, được lựa chọn dựa trên tiêu chí thành phần GC và cấu trúc bậc hai. Quá trình đánh giá off-target sử dụng công cụ sinh học thông tin để kiểm tra độ đặc hiệu gRNA, đảm bảo chỉ tác động lên gen mục tiêu OsYSL2 mà không gây tác động phụ trên các gen khác.

III. Ứng dụng CRISPRa trên giống lúa TBR225

Giống lúa TBR225 được lựa chọn cho nghiên cứu này do có nền tảng di truyền tốt và tiềm năng cải tiến cao. Ứng dụng công nghệ CRISPRa để tăng cường biểu hiện OsYSL2 trên TBR225 nhằm nâng cao hàm lượng sắt trong hạt gạo. Quá trình biến nạp được thực hiện thông qua agro-infiltration hoặc floral dip, hai phương pháp phổ biến để chuyển gen vào thực vật nhằm mục đích. Sau khi biến nạp, các cây được nuôi cấy và phân tích biểu hiện gen bằng qRT-PCR để xác minh mức độ tăng cường. Kết quả dự kiến sẽ cho thấy lúa TBR225 chứa vector CRISPRa có mức biểu hiện OsYSL2 cao hơn so với lúa hoang dã, từ đó nâng cao giá trị dinh dưỡng của gạo.

3.1. Quy trình biến nạp vector vào lúa TBR225

Agrobacterium tumefaciens mang vector CRISPRa được sử dụng để biến nạp vào các mô thực vật của lúa TBR225. Quá trình nuôi cấy mô và tái sinh cây được thực hiện trên môi trường MS có các hormone điều hòa phù hợp. Các cây tái sinh T0 được chọn lọc bằng kháng sinh để xác nhận sự có mặt của vector, sau đó được chuyển sang nhà kính để nuôi và thu hạch.

3.2. Đánh giá hiệu quả tăng cường biểu hiện OsYSL2

Biểu hiện gen OsYSL2 được phân tích thông qua qRT-PCR sử dụng chủng loại tham chiếu. Dữ liệu biểu hiện được so sánh giữa các cây chứa vector CRISPRa và lúa kiểm soát. Phân tích hàm lượng sắt trong hạt được thực hiện bằng phương pháp ICP-MS, xác nhận tác động của tăng cường OsYSL2 lên nội dung sắt.

IV. Ý nghĩa và triển vọng ứng dụng của công nghệ CRISPRa

Công nghệ CRISPRa mang lại nhiều ưu điểm so với các phương pháp chỉnh sửa gen truyền thống. Không cắt DNA giúp giảm thiểu rủi ro, cải thiện tính an toàn của sản phẩm biến nạp. Khả năng tăng cường biểu hiện gen mà không cần cắt DNA mở ra tiềm năng ứng dụng trong cải tiến đặc tính dinh dưỡng của các cây trồng chính. Kết quả nghiên cứu trên gen OsYSL2 của lúa TBR225 chứng minh tính khả thi của phương pháp CRISPRa trong cải thiện hàm lượng sắt, góp phần giải quyết vấn đề thiếu sắt dinh dưỡng toàn cầu. Trong tương lai, công nghệ này có thể mở rộng ứng dụng cho các gen khác và các loại cây trồng khác, tạo ra những sản phẩm nông nghiệp có giá trị dinh dưỡng cao và có khả năng chống chịu tốt hơn với môi trường.

4.1. Ưu điểm của công nghệ CRISPRa so với CRISPR Cas9

CRISPRa không cắt DNA nên tránh được các đột biến không mong muốn và những vấn đề pháp lý liên quan đến GMO ở một số quốc gia. Tính chính xác cao của CRISPRa cho phép điều chỉnh mức biểu hiện gen theo nhu cầu. Phương pháp này cũng có thể kích hoạt đồng thời nhiều gen để tạo ra những đặc tính phức tạp hơn, nâng cao giá trị nông nghiệp.

4.2. Triển vọng ứng dụng trong nông nghiệp bền vững

Công nghệ CRISPRa có tiềm năng cải tiến các cây trồng chính như lúa, ngô, lúa mạch về chất lượng dinh dưỡng và năng suất. Lúa giàu sắt là bước đầu tiên trong hướng phát triển lương thực thông minh về dinh dưỡng. Ứng dụng rộng rãi công nghệ này sẽ hỗ trợ nông nghiệp bền vững và đảm bảo an ninh lương thực cho thế hệ tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Thiếu máu là một trong những căn bệnh phổ biến với hơn hai tỷ người mắc phải, trong đó phần lớn nguyên nhân là do thiếu sắt. Sắt (Fe) là nguyên tố vi lượng đóng vai quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, tuy nhiên khẩu phần ăn hàng ngày của con người lại không cung cấp đủ hàm lượng cần thiết. Do đó, việc tăng cường lượng sắt hấp thu vào cơ thể qua các thực phẩm tiêu thụ sẽ giúp cải thiện vấn đề sức khỏe này. Thực vật chiếm phần lớn chế độ ăn của con người, trong đó, lúa gạo (Oryza sativa L.) là lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số thế giới, được trồng phổ biến ở hơn 100 quốc gia với 90% tổng sản lượng đến từ châu Á.

Ở Việt Nam, TBR225 là giống lúa chủ lực của quốc gia có tính thích ứng rộng, có khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi và sâu bệnh, chất lượng gạo thơm, ngon, mềm dẻo. Tuy vậy, giống lúa này có nhược điểm là hàm lượng sắt trong hạt tương đối thấp. Do đó, việc tăng cường hàm lượng sắt tích lũy trong hạt gạo TBR225 là một trong những hướng nghiên cứu cần thiết để cải thiện tình trạng này. Mặc dù sắt chiếm một lượng lớn trong đất nhưng lại thường tồn tại ở dạng Fe(III) không hòa tan, do đó thực vật phải phát triển những chiến lược khác nhau (chiến lược I và chiến lược II) để hấp thu nguyên tố này.

Lúa gạo sử dụng chiến lược II thông qua việc tạo phức với phytosiderophore để chelate hóa Fe(III). Phức hợp Fe(III)-phytosiderophore được hấp thu và vận chuyển thông qua kênh vận chuyển Yellow Stripe1-Like (YSL). Ở lúa gạo có 18 gen mã hóa cho các protein YSL được tìm ra, trong đó OsYSL2 có vai trò trong tích lũy sắt ở hạt. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy giảm biểu hiện của gen OsYSL2 có thể dẫn đến giảm hàm lượng sắt trong hạt.

Trong khi đó, khi tăng cường biểu hiện gen này thì hàm lượng sắt được cải thiện đáng kể ở hạt gạo. Công nghệ chỉnh sửa hệ gen đang đóng vai trò hỗ trợ chủ lực trong cải thiện tính trạng ở cây trồng thông qua việc thay đổi biểu hiện của gen. Để tăng cường biểu hiện gen mong muốn, nhiều nghiên cứu đã thành công ứng dụng hệ thống CRISPR activation (CRISPRa). Hệ thống này với hoạt tính liên kết đặc hiệu thông qua gRNA, 1 hoạt tính cắt đã bị loại bỏ của dCas9 cùng với yếu tố hoạt hóa phiên mã giúp tăng cường biểu hiện chính xác gen đích mong muốn.

Với mục tiêu cải thiện hàm lượng sắt tích lũy ở hạt gạo TBR225 thông qua tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 sử dụng công nghệ CRISPRa, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Thiết kế cấu trúc CRISPRa tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 ở lúa TBR225”. Đề tài luận văn được thực hiện với các mục tiêu sau: (1) Nghiên cứu in silico họ gen OsYSL; (2) Phân lập và giải trình tự một vùng nằm trên promoter gen OsYSL2; (3) Thiết kế cấu trúc vector tăng cường biểu hiện với gRNA đặc hiệu cho promoter gen OsYSL2 và biến nạp vector thiết kế vào chủng vi khuẩn E. Vai trò của sắt đối với sức khỏe con người Sắt (Fe) là nguyên tố thiết yếu cho tất cả các sinh vật sống và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2001), có khoảng hai tỷ người bị thiếu máu trên toàn thế giới và trong đó, 50% người bị thiếu máu là do thiếu sắt.

Ở Việt Nam, theo điều tra quốc gia về vi chất dinh dưỡng năm 2014 – 2015 của Viện Dinh dưỡng, tình trạng thiếu sắt phổ biến ở trẻ em dưới 5 tuổi (50,3%) và phụ nữ mang thai (47,3%). Thiếu máu do thiếu sắt có thể gây chậm phát triển nhận thức và thể chất, làm giảm khả năng miễn dịch, tăng nguy cơ tử vong mẹ và bé. Nguyên nhân cơ bản của việc thiếu sắt được xác định là do hàm lượng sắt hấp thu qua khẩu phần ăn hàng ngày khá thấp [60]. Khi lượng sắt không đủ để tạo ra hồng cầu, quá trình tổng hợp hemoglobin trong tiền hồng cầu sẽ suy giảm và gây ra các triệu chứng huyết học liên quan đến thiếu máu do sắt.

Chiến lược tối ưu để ngăn chặn tình trạng thiếu sắt chính là tăng cường lượng sắt hấp thu vào cơ thể qua khẩu phần ăn hàng ngày. Thực vật đóng vai trò là nguyên liệu sơ cấp, chiếm vị trí quan trọng trong sức khỏe dinh dưỡng của con người [35]. Trong đó, lúa gạo là lương thực chủ yếu của một nửa dân số thế giới, được trồng phổ biến ở hơn 100 quốc gia với 90% tổng sản lượng toàn cầu đến từ châu Á [30]. Tuy nhiên, so với các lương thực khác, gạo thường chứa hàm lượng sắt thấp và tính khả dụng kém, không cung cấp đủ lượng sắt cần thiết cho dinh dưỡng hàng ngày [97].

Gạo nguyên cám chứa 12 mg Fe kg-1 [44], nhưng trong gạo đã xay xát thì lượng Fe lại giảm đi đáng kể. Điều này xảy ra do hầu hết sắt được tích lũy ở lớp aleurone [98], do đó 90% hàm lượng sắt sẽ mất đi trong quá trình xay xát. Thêm vào đó, hạt gạo chứa nhiều axit phytic (có vai trò trong tích lũy phospho) có thể chelate hóa Fe làm cho sắt trở nên không còn tính khả dụng sinh học [37]. Do đó, việc tăng cường hàm lượng cũng như tính khả dụng sinh học của sắt trong hạt gạo là một trong các hướng nghiên cứu để giải quyết vấn đề sức khỏe cộng đồng.

Vận chuyển sắt ở thực vật Sắt đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học ở thực vật như là hô hấp, tổng hợp diệp lục hay tham gia trong chuỗi truyền điện tử [38]. Mặc dù sắt chiếm một lượng lớn trong đất, tuy nhiên ở đất có tính kiềm (chiếm khoảng 30% diện tích đất trồng trọt trên thế giới) thì hàm lượng sắt lại hạn chế bởi phần lớn sắt tồn tại ở dạng Fe(III) không hòa tan [33]. Trong khi đó, phần lớn Fe sinh khả dụng có nhiều trong đất có tính axit gây độc cho thực vật vì lượng sắt dư thừa có thể hình thành các loại phản ứng oxy thông qua phản ứng Fenton [33, 100]. Do đó, thực vật có cơ chế để tiếp nhận và hấp thu sắt ở rễ, ngăn chặn tình trạng thiếu sắt hoặc ngộ độc sắt và duy trì cân bằng nội môi sắt [33].

Để hấp thu được Fe(III) tồn tại trong đất, thực vật đã phát triển hai chiến lược: chiến lược I và chiến lược II [104]. Sự khác biệt lớn nhất giữa hai chiến lược này là ở giai đoạn oxi hóa sắt khi hấp thu vào thực vật: chiến lược I sử dụng Fe(II) và chiến lược II sử dụng Fe(III) [18]. Thực vật sử dụng chiến lược I bao gồm tất cả thực vật hai lá mầm và thực vật một lá mầm không thuộc họ cỏ [18]. Phần lớn các gen thiết yếu trong hấp thu sắt ở chiến lược I được xác định ở Arabidopsis là ferric-chelate reductase oxidase 2 (FRO2) [85], Fe-regulated transporter 1 (IRT1) [28] và H+-ATPase chịu trách nhiệm tiết proton và hợp chất phenolic vào rễ để tăng cường khả năng hòa tan các ion sắt [55].

Cụ thể, Fe(III) được khử thành sắt Fe(II) nhờ FRO2 gần màng tế bào sau đó được vận chuyển từ đất vào tế bào rễ thông qua kênh vận chuyển IRT1. Các thực vật sử dụng chiến lược II như lúa gạo, lúa mì, lúa mạch và ngô tiết lượng lớn phân tử hữu cơ có ái lực cao với Fe là phytosiderophore (PS) thuộc họ mugineic acid (MA) [11, 14, 56, 91]. Việc tổng hợp MA là một con đường bảo thủ xuất phát từ S-adenosyl-L-methionine và bao gồm các phản ứng của nicotianamine synthase (NAS), nicotianamine aminotransferase (NAAT) và deoxymugineic acid synthase (DMAS) [10, 55, 92]. Cụ thể, ba phân tử S-adenosyl-methionine được sử dụng để tổng hợp nicotiamine (NA) bằng enzyme NAS.

Ở thực vật một lá mầm, NA được chuyển hóa thành 2’-deoxymugineic acid (DMA) nhờ enzyme NAAT và 4 DMAS. DMA là thành viên thuộc họ MA. Ở lúa gạo, việc biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzyme phụ thuộc vào hàm lượng Fe trong đất và hầu hết các gen được xác định là có vai trò trong đáp ứng thiếu Fe. NAS nằm trên màng của bóng bào ở tế bào rễ, trong khi đó NAAT nằm trong các bóng bào này cho thấy vị trí sinh tổng hợp MA.

Việc tiết MA vào trong rễ thông qua sự biểu hiện của kênh vận chuyển PS là TOM1. TOM1 được phát hiện ở lúa gạo và lúa mạch và thuộc siêu họ điều hành chính (MFS - major facilitator superfamily), là một trong những nhóm kênh vận chuyển xuyên màng lớn nhất giúp thúc đẩy quá trình vận chuyển cơ chất thông qua màng tế bào và phản ứng với gradient ion hóa thẩm [79]. Sau đó, phức hợp Fe–MA được hình thành và hấp thu qua kênh YELLOW STRIPE 1 (YS1) và YELLOW STRIPE 1-like (YSL) ở tế bào rễ [21, 46]. Phức hợp Fe(III)–DMA được hấp thu vào tế bào chất tế bào rễ có thể bị khử bởi ascorbate và chuyển thành Fe(II)–NA.

Sơ đồ các gen mã cho protein liên quan đến vận chuyển và cân bằng nội môi Fe ở lúa gạo là mô hình đại diện được thể hiện ở Hình 1 [73]. Quá trình hấp thu và vận chuyển ở lúa mì cũng tương tự với lúa gạo và đã được nghiên cứu trước đó [14, 18]. 5 Hình 1: Sơ đồ các kênh liên quan đến hấp thu, vận chuyển và dự trữ sắt ở lúa gạo [73]. Các kênh đó bao gồm: TOM1 (transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1), YS1 (yellow strip1), YSL15 (yellow stripe 1-like), IRT1 (iron-regulated transporter), OsNRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein 1), OsFRDL1 (ferric reductase defective like1), ENA (efflux transporter of nicotianamine), OsVIT (vacuolar iron transporter), OsFER (ferritin).

Tổng quan về họ YSL 1. Họ protein YSL ở thực vật Họ YSL là thành viên thuộc họ oligopeptide transporter (OPT) có các thành viên liên quan đến kênh vận chuyển tri-, tetra-, penta- và hexapeptide và các dẫn xuất của amino acid [105] giúp thực vật sinh trưởng và phát triển [72]. Họ OPT là một 6 nhóm các kênh vận chuyển proton kết hợp có nhiều vai trò trong cân bằng nội môi kim loại, vận chuyển nitơ, và phân bố lưu huỳnh [71, 90]. Các protein OPT được dự đoán có chứa hai motif bảo thủ cao (NPG và KIPPR) và có 12-14 domain xuyên màng với đầu N và đầu C hướng ra ngoài màng tế bào [57, 99].

Ở Arabidopsis, có 17 thành viên thuộc họ OPT được xác định và chia ra thành hai nhóm: Oligopeptide Transporter (PT) và Yellow Stripe-Like (YSL) [57].