Tách Chiết Và Tinh Sạch Squalene Từ Sinh Khối Vi Tảo Schizochytrium Sp PQ7

Tìm hiểu quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ sinh khối vi tảo Schizochytrium sp PQ7, ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

• Tác giả: Lê Thị Thùy
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tách Chiết Squalene Từ Vi Tảo Schizochytrium Sp PQ7
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Việt Nam

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về tảo và vi tảo
• 1.1.1. Khái niệm về tảo và vi tảo
• 1.2. Vài nét về đặc điểm sinh học của tảo
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái tảo
• 1.2.2. Đặc điểm cấu tạo
• 1.2.3. Sinh sản
• 1.2.3.1. Sinh sản sinh dưỡng
• 1.2.3.2. Sinh sản vô tính
• 1.2.3.3. Sinh sản hữu tính
• 1.2.4. Phân loại
• 1.3. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo
• 1.4. Ứng dụng của vi tảo
• 1.4.1. Sử dụng vi tảo làm nguyên liệu cho người và động vật
• 1.4.2. Sản xuất nhiên liệu sinh học (NLSH)
• 1.4.3. Khai thác các chất có hoạt tính sinh học
• 1.4.3.1. Vitamin
• 1.4.3.2. Axit béo không bão hòa
• 1.4.3.3. Chất chống oxy hóa

Tóm tắt

I. Tổng quan về tách chiết squalene từ vi tảo Schizochytrium sp PQ7

Tách chiết squalene từ vi tảo Schizochytrium sp PQ7 đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng. Squalene là một hợp chất lipid có giá trị cao, được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm. Vi tảo Schizochytrium là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc sản xuất squalene do khả năng sinh trưởng nhanh và hàm lượng lipid cao. Nghiên cứu này không chỉ giúp phát triển công nghệ tách chiết mà còn góp phần bảo vệ môi trường và động vật hoang dã.

1.1. Đặc điểm sinh học của vi tảo Schizochytrium

Vi tảo Schizochytrium có khả năng sinh trưởng trong môi trường nước mặn và nước lợ. Chúng có cấu trúc tế bào đơn bào, chứa nhiều lipid và squalene. Đặc điểm này giúp vi tảo trở thành nguồn nguyên liệu lý tưởng cho việc tách chiết squalene.

1.2. Lợi ích của squalene trong dinh dưỡng và sức khỏe

Squalene có nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm khả năng giảm cholesterol và tăng cường hệ miễn dịch. Nó cũng được sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc da nhờ tính năng giữ ẩm và làm mềm da.

II. Thách thức trong việc tách chiết squalene từ vi tảo

Mặc dù vi tảo Schizochytrium có tiềm năng lớn, nhưng việc tách chiết squalene vẫn gặp nhiều thách thức. Các phương pháp tách chiết hiện tại thường tốn kém và không hiệu quả. Ngoài ra, việc duy trì điều kiện nuôi cấy ổn định cũng là một vấn đề lớn. Nghiên cứu cần tìm ra các phương pháp tối ưu hơn để tăng hiệu suất tách chiết.

2.1. Các phương pháp tách chiết squalene hiện tại

Hiện nay, các phương pháp tách chiết squalene bao gồm chiết xuất bằng dung môi, siêu âm và enzyme. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng, ảnh hưởng đến hiệu suất và chi phí sản xuất.

2.2. Vấn đề về chi phí và hiệu suất tách chiết

Chi phí sản xuất cao và hiệu suất tách chiết thấp là những vấn đề chính trong việc sản xuất squalene từ vi tảo. Cần có nghiên cứu để cải thiện quy trình và giảm chi phí.

III. Phương pháp tách chiết squalene hiệu quả từ vi tảo

Để tối ưu hóa quy trình tách chiết squalene, nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau. Việc kết hợp các phương pháp tách chiết có thể giúp tăng hiệu suất và giảm chi phí. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng enzyme và siêu âm có thể cải thiện đáng kể hiệu quả tách chiết.

3.1. Sử dụng enzyme trong tách chiết squalene

Enzyme có thể giúp phá vỡ cấu trúc tế bào của vi tảo, từ đó giải phóng squalene một cách hiệu quả hơn. Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng enzyme có thể tăng hiệu suất tách chiết lên đến 30%.

3.2. Ứng dụng công nghệ siêu âm trong tách chiết

Công nghệ siêu âm giúp tăng cường quá trình tách chiết bằng cách tạo ra sóng siêu âm, làm tăng sự khuếch tán của squalene ra khỏi tế bào vi tảo. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả và tiết kiệm thời gian.

IV. Ứng dụng thực tiễn của squalene trong ngành công nghiệp

Squalene có nhiều ứng dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm. Nó được sử dụng như một thành phần trong các sản phẩm chăm sóc da, giúp cải thiện độ ẩm và làm mềm da. Ngoài ra, squalene cũng được nghiên cứu như một chất bổ sung dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe.

4.1. Squalene trong mỹ phẩm

Trong ngành mỹ phẩm, squalene được sử dụng như một chất làm mềm và giữ ẩm. Nhiều sản phẩm chăm sóc da hiện nay đã bổ sung squalene để cải thiện hiệu quả sử dụng.

4.2. Squalene trong dược phẩm

Squalene cũng được nghiên cứu như một thành phần trong các loại thuốc, giúp tăng cường hệ miễn dịch và hỗ trợ điều trị một số bệnh lý. Nghiên cứu cho thấy squalene có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của tách chiết squalene

Tách chiết squalene từ vi tảo Schizochytrium sp PQ7 có tiềm năng lớn trong việc cung cấp nguồn nguyên liệu bền vững cho ngành công nghiệp. Nghiên cứu cần tiếp tục để cải thiện quy trình tách chiết và mở rộng ứng dụng của squalene trong thực tiễn. Tương lai của ngành công nghiệp này hứa hẹn sẽ phát triển mạnh mẽ với sự hỗ trợ của công nghệ hiện đại.

5.1. Triển vọng nghiên cứu và phát triển

Nghiên cứu về tách chiết squalene từ vi tảo sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu cải thiện hiệu suất và giảm chi phí. Các công nghệ mới sẽ được áp dụng để tối ưu hóa quy trình sản xuất.

5.2. Tương lai của squalene trong ngành công nghiệp

Với nhu cầu ngày càng tăng về squalene, ngành công nghiệp này có triển vọng phát triển mạnh mẽ. Việc sử dụng vi tảo như một nguồn nguyên liệu bền vững sẽ góp phần bảo vệ môi trường và động vật hoang dã.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Squalene là một hợp chất hydrocarbon triterpene không bão hòa ($C_{30}H_{50}$) có giá trị thương mại lớn nhờ phổ ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp. Trong ngành mỹ phẩm, squalene giữ vai trò là chất làm mềm và giữ ẩm tự nhiên cho da nhờ khả năng dập tắt các gốc tự do phát sinh từ tia bức xạ tử ngoại. Trong lĩnh vực y học và dược phẩm, squalene thể hiện đặc tính chống oxy hóa mạnh, kích thích chức năng thực bào của hệ miễn dịch, ức chế sự kích hoạt của các gen gây ung thư, hạ nồng độ cholesterol và triglyceride trong máu, đồng thời đóng vai trò tá dược bổ trợ trong một số loại vắc-xin phòng bệnh than và cúm A (H1N1).

Nguồn squalene thương phẩm truyền thống được khai thác chủ yếu từ dầu gan cá mập sống ở tầng biển sâu (chiếm 50% đến 70%, thậm chí tới 90% ở cá mập nhám gai). Tuy nhiên, các chính sách bảo vệ động vật hoang dã biển và sự suy giảm nghiêm trọng của quần thể cá mập đang đặt ra thách thức lớn đối với nguồn cung này. Việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu thay thế từ thực vật (như dầu ô liu, hạt rau dền) hoặc nấm men còn gặp nhiều hạn chế do hàm lượng squalene thấp (thực vật dao động từ 1-61 mg/g dầu; nấm men dưới 0,43 mg/g SKK) và phụ thuộc nặng nề vào mùa vụ canh tác. Do đó, vi tảo biển dị dưỡng, đặc biệt là nhóm Thraustochytrids thuộc chi Schizochytrium, trở thành đối tượng tiềm năng nhờ tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng tích lũy lipit cao và có thể nuôi cấy ổn định quanh năm trong các hệ thống lên men công nghiệp có kiểm soát.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu tách chiết và tinh sạch squalene từ vi tảo biển dị dưỡng vẫn chưa được công bố rộng rãi. Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Thùy (năm 2015, Khoa Công nghệ sinh học) thực hiện đề tài "Tách chiết và tinh sạch squalene từ sinh khối của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp. PQ7" nhằm giải quyết vấn đề thực tiễn trên.

Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng các số liệu khoa học ban đầu về quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô phòng thí nghiệm. Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể gồm:

1. Tách chiết được squalene từ sinh khối của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp. PQ7 trong điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam.
2. Tinh sạch squalene từ sinh khối tảo chủng PQ7.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Sinh khối khô của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp. PQ7 (thuộc bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, phân lập từ các mẫu lá đước mục trôi dạt tại rừng ngập mặn Phú Quốc, Kiên Giang).
• Không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở phân loại học sinh học hiện đại và các đặc tính hóa sinh của vi tảo dị dưỡng. Chủng vi tảo Schizochytrium thuộc họ Thraustochytridae, bộ Thraustochytriales, lớp Labyrinthulea, ngành Heterokonta, giới Chromista (Stramenopilia). Về mặt hóa học, squalene ($C_{30}H_{50}$, danh pháp IUPAC: 2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexane) là một polyunsaturated hydrocarbon mạch hở gồm 6 đơn vị isoprene và 6 liên kết đôi, là chất trung gian trong con đường sinh tổng hợp sterol và cholesterol qua chu trình mevalonate ở sinh vật.

Nghiên cứu áp dụng các phương pháp thực nghiệm phòng thí nghiệm để chiết tách, tinh sạch và định lượng hóa lý:

• Phương pháp tách chiết và phân đoạn: Tác giả kế thừa và cải tiến quy trình của Lu và cộng sự (2003) cho phù hợp với trang thiết bị tại Việt Nam. Quy trình gồm 3 bước:
  1. Chiết lipit tổng số từ bột sinh khối khô bằng hệ dung môi methanol : chloroform (tỉ lệ 2:1 thể tích/thể tích - v/v) kết hợp khuấy từ 13 giờ ở 27°C, phân tầng, ly tâm và cô quay chân không ở 70°C.
  2. Phân đoạn squalene thô từ lipit tổng số bằng hỗn hợp methanol : acetone (tỉ lệ 7:3 v/v), kết tinh phân lớp ở nhiệt độ -20°C trong 40 giờ, ly tâm loại bỏ cặn và cô quay bay hơi dung môi ở 70°C.
  3. Tinh sạch squalene thô bằng hệ dung môi hai pha không đồng tan n-hexane : methanol (tỉ lệ 2:1 v/v) nhằm phân tách chọn lọc dựa trên độ phân cực.
• Phương pháp định tính và kiểm tra độ tinh sạch: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng silicagel 60 phủ nhôm (Merck), triển khai trong hệ dung môi n-hexane : diethyl ether : axit axetic (tỉ lệ 70:30:4 v/v/v), hiện màu bằng dung dịch axit sulfuric ($H_2SO_4$) 20% và sấy ở 100°C trong 5 phút.
• Phương pháp định lượng hóa học:
  1. Phản ứng so màu: Dựa trên phản ứng giữa mẫu chứa squalene với $H_2SO_4$ đặc ở 70°C và dung dịch formaldehyde ở 100°C, bổ sung axit axetic lạnh, đo mật độ quang ở bước sóng 400 nm ($OD_{400}$) trên máy quang phổ UV-1601 Shimadzu, đối chiếu với đường chuẩn squalene chuẩn (Sigma S3626).
  2. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC): Sử dụng hệ thống HPLC với cột Thermo Hypersil Gold C18 (150 x 2,1 mm; kích thước hạt 3 µm), pha động đẳng dòng acetonitrile : nước (tỉ lệ 9:1 v/v), tốc độ dòng 250 µL/phút, đầu dò PDA Accella ghi nhận tín hiệu UV ở bước sóng 198 nm.

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu là các số liệu cân đo thực tế, quang phổ hấp thụ và sắc ký đồ thực nghiệm thu thập trực tiếp trong quá trình xử lý sinh khối vi tảo Schizochytrium sp. PQ7 nuôi cấy trong bình lên men 30 lít tại Viện Công nghệ sinh học.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương I hệ thống hóa toàn diện các kiến thức lý thuyết và thực tiễn về vi tảo, đối tượng nghiên cứu và hợp chất squalene:

• Khái quát về hình thái, cấu tạo tế bào, các hình thức sinh sản (sinh dưỡng, vô tính, hữu tính) và hệ thống phân loại 10 ngành tảo. Phân tích giá trị dinh dưỡng của vi tảo với hàm lượng protein dao động từ 6% đến 52%, carbohydrate từ 5% đến 23% và lipit từ 7% đến 23%.
• Điểm lại các hướng ứng dụng công nghệ sinh học của vi tảo: làm thực phẩm chức năng cho người; bổ sung vào khẩu phần thức ăn chăn nuôi gia cầm, tôm cá nhằm tăng tỷ lệ sống và chất lượng trứng; nguyên liệu cho diesel sinh học thế hệ thứ 3; khai thác các chất có hoạt tính sinh học (vitamin B1, B12, C, E, K; các axit béo không bão hòa đa nối đôi PUFAs; chất chống oxy hóa tự nhiên như astaxanthin, $\beta$-caroten, enzyme SOD; chất kháng sinh sinh học) và ứng dụng xử lý nước thải công nghiệp - nông nghiệp.
• Tổng quan về chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium: nguồn gốc phân lập từ mẫu lá cây đước (Rhizophora apiculata Blume) tại đảo Phú Quốc; hàm lượng lipit tổng số đạt 6,26% sinh khối tươi, trong đó axit béo DHA (C22:6n-3) chiếm 43,58% và EPA (C20:5n-3) chiếm 0,75% tổng lượng axit béo.
• Lịch sử phát hiện, đặc điểm cấu trúc hóa học và các nguồn cung cấp squalene trong tự nhiên (động vật, thực vật, nấm men Saccharomyces cerevisiae, Pseudozyma và vi tảo Thraustochytrids). Tổng hợp các bằng chứng thực nghiệm về hoạt tính dược lý của squalene trong việc dập tắt gốc tự do, tăng cường đáp ứng miễn dịch của đại thực bào, ức chế tế bào ung thư, khử độc hóa chất nhân tạo (dioxin) và bảo vệ tim mạch thông qua giảm cholesterol huyết thanh.
• Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam: Ghi nhận các công bố tối ưu hóa sinh khối và squalene bằng cách bổ sung methyl jasmonate (MJA) trên Schizochytrium mangrovei, terbinafine trên Aurantiochytrium mangrovei FB3, chiết tách squalene bằng $CO_2$ siêu tới hạn từ hạt rau dền; chỉ rõ Việt Nam chưa có nghiên cứu tách chiết và tinh sạch squalene từ vi tảo.

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết nguồn vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và các quy trình thao tác chuẩn:

• Vật liệu sinh học: Chủng Schizochytrium sp. PQ7 giữ trên thạch GPY (0,2% glucose, 0,1% polypeptone, 0,05% cao nấm men, 1,5% agar, 1,5% NaCl). Chủng được nuôi cấy trong bình lên men 30 lít trên môi trường M12 (9% glucose, 1% cao nấm men, 1,5% NaCl) ở 28°C, sục khí liên tục, pH 6,5 - 7,5. Thu hoạch ở pha cân bằng sau 4-5 ngày bằng ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, sấy khô ở 80°C đến khối lượng không đổi và bảo quản tại -20°C.
• Thiết bị và hóa chất: Sử dụng cân phân tích Shimadzu AY120, máy ly tâm Sorvall RT 1900 W, máy cất quay chân không IKA, máy quang phổ UV-1601 Shimadzu, máy HPLC với cột Thermo Hypersil Gold C18, bản mỏng Silicagel 60 Merck; các dung môi hữu cơ tinh khiết phân tích (methanol, chloroform, acetone, n-hexane, diethyl ether, axit axetic, axit sulfuric, formaldehyde, acetonitrile) và mẫu chuẩn squalene Sigma S3626.
• Quy trình thí nghiệm tách chiết lipit tổng số: Sử dụng 8 g bột sinh khối khô, chiết bằng 120 mL hỗn hợp methanol : chloroform (tỉ lệ 2:1 v/v) khuấy từ 13 giờ ở 27°C, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, rửa bã sinh khối 3 lần bằng hỗn hợp dung môi (mỗi lần 20 mL), gộp dịch chiết và cất quay chân không ở 70°C trong 15-20 phút.
• Quy trình phân đoạn squalene thô: Toàn bộ lipit tổng số hòa với 40 mL methanol : acetone (tỉ lệ 7:3 v/v), vortex 5 phút, lưu trữ ở -20°C trong 40 giờ, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, rửa bã 3 lần bằng 10 mL hỗn hợp dung môi lạnh, thu phần dịch và cô quay 70°C.
• Quy trình tinh sạch squalene thô: Hòa tan 10,8 mg squalene thô trong 20 mL n-hexane : methanol (tỉ lệ 2:1 v/v), vortex 5 phút, để lắng 10 phút cho phân tách hai pha, lặp lại quy trình tách chiết 3 lần, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, thu hồi pha n-hexane phía trên.
• Các phương pháp phân tích: Dựng đường chuẩn so màu với squalene chuẩn đo ở bước sóng 400 nm; kiểm tra định tính bằng sắc ký lớp mỏng TLC với hệ dung môi n-hexane : diethyl ether : axit axetic (70:30:4 v/v/v); phân tích định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp pha đảo HPLC.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày số liệu thực nghiệm, tính toán hiệu suất và thảo luận nguyên nhân biến động chỉ tiêu:

• Tách chiết lipit tổng số: Từ 8 g sinh khối khô của chủng PQ7, quy trình tách chiết thu được hiệu suất lipit tổng số đạt 58,94% SKK. Kết quả này tương đồng với các công bố trước đó của nhóm nghiên cứu về chi Schizochytrium (hàm lượng lipit thường chiếm 50% đến 70% SKK).
• Tách chiết squalene thô: Xử lý phân đoạn lipit tổng số bằng dung môi methanol : acetone (7:3 v/v) ở -20°C thu được squalene thô với hiệu suất đạt 26,03% SKK, cao hơn mức 17,5% SKK từng được công bố trên đối tượng Thraustochytrium ATCC 26185 của Lu và cs. (2003).
• Tinh sạch squalene thô: Hệ dung môi n-hexane và methanol phân tách rõ ràng thành hai lớp. Lớp n-hexane phía trên thu giữ phần lớn squalene do tính chất không phân cực; lớp methanol phân cực phía dưới giữ lại các hợp chất phụ và tạp chất.
• Định tính bằng TLC: Bản mỏng silicagel hiển thị vệt băng của mẫu lipit tổng số và mẫu squalene thô có vị trí tương đồng với vệt của squalene chuẩn, chứng minh sự hiện diện của squalene trong dịch chiết.
• Định lượng bằng phương pháp so màu: Thiết lập phương trình đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa hàm lượng squalene ($x$, đơn vị mg) và độ hấp thụ quang ($Y$, tại bước sóng 400 nm): $$Y = 6,5893x + 0,1504$$ Dựa trên đường chuẩn, hàm lượng squalene thô trung bình đạt $44,45 \pm 4,64$ mg/g SKK (Mẫu 1: 39,81 mg/g; Mẫu 2: 49,08 mg/g). Sau khi tinh sạch bằng phân đoạn dung môi, hàm lượng squalene tinh sạch trung bình đạt $74,38 \pm 13,71$ mg/g SKK (Mẫu 1: 60,67 mg/g; Mẫu 2: 88,10 mg/g), tăng 67,3% so với squalene thô. Tác giả đối sánh kết quả này với công bố của Bernard và cs. (2014) trên vi tảo đạt 82 mg/g SKK khi bổ sung vitamin.
• Định lượng bằng phương pháp HPLC: Sắc ký đồ HPLC xuất hiện peak tại thời gian lưu trùng khớp với mẫu squalene chuẩn (khoảng 1,5 - 2,5 phút). Tuy nhiên, trên sắc ký đồ còn xuất hiện nhiều peak phụ, phản ánh mẫu vẫn còn lẫn các tạp chất. Hàm lượng squalene định lượng bằng HPLC đạt 0,0248 mg/g SKK, thấp hơn nhiều so với giá trị thu được từ phương pháp so màu. Tác giả thảo luận nguyên nhân là do sự thất thoát squalene qua nhiều công đoạn xử lý, đồng thời phản ứng so màu có tính đặc hiệu không tuyệt đối vì các hợp chất sterol hoặc phytosterol trong mẫu cũng tham gia tạo màu làm giá trị so màu cao hơn thực tế.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thực nghiệm và ghi nhận đầy đủ các thông số định lượng trong quá trình xử lý sinh khối vi tảo Schizochytrium sp. PQ7:

Chỉ tiêu theo dõi	Giá trị định lượng	Phương pháp / Ghi chú
Hiệu suất tách chiết lipit tổng số	58,94% SKK	Chiết bằng methanol : chloroform (2:1 v/v)
Hiệu suất tách chiết squalene thô	26,03% SKK	Phân đoạn bằng methanol : acetone (7:3 v/v)
Hàm lượng squalene thô (Mẫu 1)	39,81 mg/g SKK	Phương pháp so màu quang phổ ($OD_{400}$)
Hàm lượng squalene thô (Mẫu 2)	49,08 mg/g SKK	Phương pháp so màu quang phổ ($OD_{400}$)
Hàm lượng squalene thô trung bình	44,45 ± 4,64 mg/g SKK	Giá trị trung bình của 2 mẫu lặp
Hàm lượng squalene tinh sạch (Mẫu 1)	60,67 mg/g SKK	Sau tinh sạch bằng n-hexane : methanol
Hàm lượng squalene tinh sạch (Mẫu 2)	88,10 mg/g SKK	Sau tinh sạch bằng n-hexane : methanol
Hàm lượng squalene tinh sạch trung bình	74,38 ± 13,71 mg/g SKK	Tăng 67,3% so với squalene thô
Hàm lượng squalene tinh sạch bằng HPLC	0,0248 mg/g SKK	Đầu dò PDA 198 nm, cột C18

Giải pháp và kiến nghị kỹ thuật do tác giả đề xuất:

• Khẳng định tính khả thi của quy trình tách chiết cải tiến từ Lu và cs. (2003) bằng hệ dung môi hữu cơ dễ kiếm, chi phí thấp, thao tác đơn giản trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa các điều kiện công nghệ nuôi cấy sinh khối (nhiệt độ, nồng độ glucose, thời gian nuôi) nhằm nâng cao tích lũy squalene của chủng Schizochytrium sp. PQ7.

Đóng góp của khóa luận:

• Cung cấp các dẫn liệu khoa học thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam về khả năng tách chiết và làm sạch squalene từ nguồn sinh khối vi tảo biển dị dưỡng bản địa.
• So sánh, đối chiếu và chỉ rõ sự sai khác bản chất giữa phương pháp định lượng nhanh bằng phản ứng so màu quang phổ và phương pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo HPLC.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra một số hạn chế kỹ thuật trong quá trình thực nghiệm:

• Phương pháp tinh sạch bằng hệ dung môi hai pha n-hexane : methanol (2:1 v/v) chưa loại bỏ được triệt để các tạp chất đồng tan; sắc ký đồ HPLC vẫn xuất hiện nhiều peak phụ bên cạnh peak squalene chuẩn.
• Hàm lượng squalene định lượng bằng HPLC đạt giá trị thấp (0,0248 mg/g SKK) do sự thất thoát mẫu qua các bước cô quay, chuyển pha và do phản ứng màu ở phương pháp so màu bị nhiễu bởi sterol/phytosterol.
• Đề tài chưa tiến hành khảo nghiệm tối ưu hóa các điều kiện môi trường nuôi cấy (như nồng độ nguồn cacbon, oxy hòa tan, nhiệt độ) hoặc bổ sung các chất kích thích/ức chế enzyme để nâng cao năng suất sinh tổng hợp squalene trước khi thu hoạch sinh khối.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Tiếp tục tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của quy trình chiết tách và làm sạch theo Lu và cs. (2003) nhằm giảm thiểu thất thoát và nâng cao hàm lượng squalene tinh sạch.
• Nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố công nghệ nuôi cấy chủng vi tảo Schizochytrium sp. PQ7 (nồng độ glucose, nhiệt độ nuôi, thời gian thu hoạch) để gia tăng cả mật độ sinh khối và hàm lượng squalene nội bào.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa sinh học, Công nghệ thực phẩm và Dược liệu.

Các nội dung có giá trị thực tiễn cao bao gồm:

• Quy trình chi tiết về tỷ lệ dung môi, thời gian chiết, chế độ ly tâm và nhiệt độ cô quay chân không để thu hồi lipit và squalene thô từ sinh khối vi sinh vật.
• Công thức phản ứng và phương pháp xây dựng đường chuẩn so màu squalene với formaldehyde và axit sulfuric đậm đặc tại bước sóng 400 nm.
• Điều kiện vận hành sắc ký bản mỏng TLC (hệ n-hexane : diethyl ether : axit axetic tỉ lệ 70:30:4) và thông số chạy HPLC pha đảo với cột C18 ứng dụng cho phân tích squalene.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi tảo Schizochytrium sp. PQ7 sử dụng trong khóa luận có nguồn gốc từ đâu và nuôi cấy trong điều kiện nào?
Chủng Schizochytrium sp. PQ7 được phân lập từ mẫu lá cây đước (Rhizophora apiculata Blume) mục trôi dạt ven rừng ngập mặn đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang. Chủng được nuôi cấy trong bình lên men 30 lít với môi trường lỏng M12 (chứa 9% glucose, 1% cao nấm men, 1,5% NaCl) ở nhiệt độ 28°C, sục khí liên tục, pH duy trì từ 6,5 đến 7,5 và thu hoạch sinh khối ở pha cân bằng sau 4-5 ngày.

2. Hiệu suất tách chiết lipit tổng số và squalene thô đạt được trong nghiên cứu là bao nhiêu?
Quy trình thực nghiệm từ 8 g bột sinh khối khô chủng PQ7 đạt hiệu suất tách chiết lipit tổng số là 58,94% SKK (sử dụng hệ dung môi methanol : chloroform 2:1 v/v) và hiệu suất tách chiết squalene thô đạt 26,03% SKK (sử dụng hệ dung môi methanol : acetone 7:3 v/v ở nhiệt độ -20°C).

3. Tại sao có sự chênh lệch lớn giữa hàm lượng squalene đo bằng phương pháp so màu ($74,38$ mg/g SKK) và phương pháp HPLC ($0,0248$ mg/g SKK)?
Sự chênh lệch bắt nguồn từ hai nguyên nhân chính được tác giả thảo luận: thứ nhất, squalene bị hao hụt và phân hủy qua nhiều bước phân đoạn, cô quay và chuyển pha; thứ hai, phản ứng so màu bằng axit sulfuric và formaldehyde không hoàn toàn chọn lọc riêng cho squalene mà các hợp chất nhân sterol hoặc phytosterol có trong lipit vi tảo cũng tham gia phản ứng màu, làm giá trị mật độ quang tăng cao hơn hàm lượng thực tế.

4. Quá trình tinh sạch squalene thô dựa trên nguyên lý tách pha nào?
Quá trình tinh sạch sử dụng hệ dung môi n-hexane : methanol (tỉ lệ 2:1 v/v). Nguyên lý dựa trên sự khác biệt về độ phân cực giữa hai dung môi không đồng tan: squalene là hydrocarbon mạch hở không phân cực nên hòa tan ưu tiên vào lớp n-hexane ở phía trên, trong khi các tạp chất và thành phần phân cực khác bị giữ lại trong lớp dung môi methanol ở phía dưới.

5. Bản mỏng sắc ký lớp mỏng (TLC) được triển khai và phát hiện vệt mẫu bằng hóa chất nào?
Bản mỏng TLC phủ silicagel 60 được chạy trong hệ dung môi pha động gồm n-hexane : diethyl ether : axit axetic với tỉ lệ thể tích 70:30:4. Các vệt chất trên bản sắc ký được phát hiện bằng cách phun dung dịch axit sulfuric ($H_2SO_4$) 20% và sấy khô ở nhiệt độ 100°C trong 5 phút.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Lê Thị Thùy đã hoàn thành việc xây dựng và thử nghiệm quy trình tách chiết, tinh sạch squalene từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng bản địa Schizochytrium sp. PQ7 trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Kết quả thực nghiệm xác định hiệu suất thu lipit tổng số đạt 58,94% SKK, hiệu suất squalene thô đạt 26,03% SKK và hàm lượng squalene tinh sạch đạt 74,38 mg/g SKK theo phương pháp so màu và 0,0248 mg/g SKK theo HPLC. Nghiên cứu đã cung cấp những dẫn liệu thực nghiệm ban đầu có giá trị, làm tiền đề cho các định hướng tối ưu hóa nuôi cấy và nâng cao hiệu quả làm sạch squalene từ nguồn vi tảo biển trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vi tảo (Microalgae) là những loại tảo có kích thước hiển vi. Chúng có vai trò rất quan trọng trong tự nhiên và trong đời sống của con người. Trong các thủy vực tảo cung cấp oxy và là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của thủy vực, cung cấp hầu hết thức ăn sơ cấp cho cá cũng như các động vật thủy hải sản khác. Nhiều loại tảo biển còn được khai thác để sản xuất thạch (agar), alginate, sản phẩm giàu iot, làm phân bón….

Nhiều tảo đơn bào được nuôi trồng công nghiệp để tạo ra những nguồn thức ăn cho ngành nuôi trồng thủy sản hay thực phẩm chức năng bổ dưỡng giàu protein, vitamin và khoáng dùng cho người. Tảo còn là nguyên liệu trong các ngành Y, Dược, mỹ phẩm, được sử dụng trong xử lý môi trường, làm phân bón, góp phần giảm nhẹ sự biến đổi khí hậu toàn cầu (sử dụng tảo để giảm thiểu hiệu ứng nhà kính) góp phần trong việc giải quyết vấn đề an ninh năng lượng (sản xuất nhiên liệu sinh học từ tảo)…. Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến nhất của tảo là làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản và tách chiết những chất có hoạt tính sinh học có thể thương mại. Trong những sản phẩm từ tảo thì squalene có giá trị thương mại lớn do các ứng dụng đa dạng và giá thành cao.

Squalene được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm là chất làm mền và giữ ẩm cho da; trong lĩnh vực y tế và dược phẩm vì nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng nó là một chất ức chế hiệu quả của ruột già, phổi, và tạo u da, diệt khuẩn và thuốc chống nấm và chức năng miễn dịch không đặc hiệu, và là tác nhân có thể giảm lượng cholesterol trong huyết thanh. Squalene thương mại lớn thường được tách chiết từ dầu gan cá mập biển sâu. Tuy nhiên sự quan tâm của quốc tế về bảo vệ động vật hoang dã biển đang là mối đe dọa cho nguồn sản xuất squalene. Các nguồn thực vật và nấm men đang được nghiên cứu sản xuất squalene nhưng không được mong đợi vì những hạn chế của nó như: thực vật hàm lượng squalene thấp khoảng 1-61 mg/g, vì những ảnh hưởng thay đổi theo mùa và trong sản xuất cây trồng; nấm men nói chung hàm lượng squalene là rất thấp <0,43 mg/g.

Do đó, sự cấp thiết sản xuất squalene thương mại đang là sự quan tâm lớn của các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Việc tiềm kiếm các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống để tách chiết squalene Khoa công nghệ sinh học| Lớp: KS. 11-04 1 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Lê Thị Thùy là rất cần thiết. Chúng tôi mong muốn thực hiện đề tài “Tách chiết và tinh sạch squalene từ sinh khối của chủng vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium sp.

PQ7” nhằm có được các số liệu khoa học về tách chiết và tinh sạch squalene trong điều kiện phòng thí nghiệm. Để đạt được mục tiêu nêu trên, một số nội dung nghiên cứu cần phải được tiến hành như sau: - Tách chiết được squalene từ sinh khối của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp. PQ7 trong điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam. - Tinh sạch squalene từ sinh khối tảo chủng PQ7.

Công việc thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Khoa công nghệ sinh học| Lớp: KS. 11-04 2 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Lê Thị Thùy CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về tảo và vi tảo 1.

Khái niệm về tảo và vi tảo Tảo (Algae) là những thực vật bậc thấp (thực vật có bào tử, cơ thể không phân chia thành thân, rễ, lá). Trong tế bào (TB) tảo có chứa diệp lục và chúng sống chủ yếu ở nước. Vi tảo (Microalgae) là tất cả các loại tảo có kích thức hiển vi tức là muốn quan sát được chúng thì phải sử dụng kính hiển vi. Trong số khoảng 40.000 loài tảo trên thế giới thì vi tảo chiếm khoảng 2/3.

Vai trò quan trọng của vi tảo thể hiện qua quá trình quang hợp hấp thụ CO2, cung cấp O2 cho các sinh vật khác trên trái đất, khép kín vòng tuần hoàn vật chất và làm tăng tốc độ quay vòng của các chu trình đó [5]. Tảo có mặt ở khắp nơi trên trái đất, từ đỉnh núi cao cho đến dưới đáy biển sâu. Những loài tảo sống trong các thuỷ vực được gọi là tảo phù du (phytoplankton) còn những tảo sống bám đáy thủy vực, bám trên các vật sống hay các thành tàu thuyền được gọi là tảo đáy (Phytobentos). Dạng tảo cộng sinh với nấm thành Địa y cũng là dạng phân bố rất rộng rãi và nhiều loài đã được khai thác dùng làm dược phẩm, nước hoa, phẩm nhuộm và các mục đích kinh tế khác [73].

Vài nét về đặc điểm sinh học của tảo Cơ thể tảo được gọi là tản (thallus) vì thiếu thân, rễ và lá nhưng chúng lại có chlorophyll a (sắc tố quang hợp điển hình). Hầu hết các loại tảo đều sống trong môi trường nước, từ nước ngọt đến nước mặn và nước lợ. Tảo có cấu trúc từ dạng đơn bào đến đa bào và tập đoàn. Nhìn chung tế bào tảo có một số đặc điểm cấu trúc tương tự như thực vật bậc cao: có vách TB cấu tạo từ cellulose, có lục lạp và chlorophyll [4].

Một số cấu trúc dạng tản của tảo mà chúng ta thường gặp là cấu trúc monat, cấu trúc palmella, cấu trúc hạt, cấu trúc tập đoàn, cấu trúc sợi, cấu trúc dạng bản và cấu trúc dạng ống (siphon), cấu trúc dạng cây [4]. Khoa công nghệ sinh học| Lớp: KS. 11-04 3 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Lê Thị Thùy 1. Đặc điểm hình thái tảo Tảo có các hình dạng cấu trúc sau đây: - Cấu trúc Monad: Tảo đơn bào, sống đơn độc hay thành tập đoàn, chuyển động nhờ lông roi.

- Cấu trúc Pamella: Tảo đơn bào, không có lông roi, cùng sống chung trong bọc chất keo thành tập đoàn dạng khối có hình dạng nhất định hoặc không. Các tế bào trong tập đoàn không có liên hệ phụ thuộc nhau. - Cấu trúc Hạt: Tảo đơn bào, không có lông roi, sống đơn độc. - Cấu trúc Tập đoàn: Các tế bào sống thành tập đoàn và giữa các tế bào có liên hệ với nhau nhờ tiếp xúc trực tiếp hay thông qua các sợi sinh chất - Cấu trúc Sợi: Cấu tạo thành tản (thallus) đa bào do tế bào chỉ phân đôi theo cùng một mặt phẳng ngang, sợi có phân nhánh hoặc không.

- Cấu trúc Bản: Tản đa bào hình lá do tế bào sinh trưởng ở đỉnh hay ở gốc phân đôi theo các mặt phẳng cả ngang lẫn dọc. Bản cấu tạo bởi một hay nhiều lớp tế bào. - Cấu trúc Ống: Tản là một ống chứa nhiều nhân, có dạng sợi phân nhánh hay dạng cây có thân, lá và rễ giả (rhizoid). Các tế bào thông với nhau vì tuy phân chia nhưng không hình thành vách ngăn.

- Cấu trúc Cây: Tản dạng sợi hay dạng bản phân nhánh, hoặc có dạng thân- lá- rễ giả. Thường mang cơ quan sinh sản có mức độ phân hóa cao [75]. Đặc điểm cấu tạo Vách tế bào của tảo phần lớn được cấu tạo bởi cellulose và pectin, một vài loài tảo vách có thấm thêm sillic (như khuê tảo, tảo ánh vàng) hoặc cacbonat canxi (tảo vòng, tảo đỏ). Mỗi tế bào có một nhân hay đôi khi có nhiều nhân (ở tảo dạng Ống).

Trong nguyên sinh chất có những bản (thylakoids) chứa chất màu (diệp lục và các sắc tố khác) được gọi là thể màu. Thể màu có hình dạng khác nhau: hình bản, sao, dải, hình mạng lưới, đĩa, hạt … và ổn định với từng chi. Trong thể màu có những thể nhỏ gọi là hạch tạo bột, xung quanh có các hạt tinh bột lắng tụ (ở Tảo lục, Tảo vòng). Khoa công nghệ sinh học| Lớp: KS.

11-04 4 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Lê Thị Thùy Những chất dự trữ khác là các hydratcacbon đặc biệt (lamiarin, amylodextrin….) ở trong hoặc ngoài thể màu. Nhiều tảo đơn bào còn có roi, số lượng có thể là 1, 2 hoặc nhiều. Các roi này xuất phát từ gốc ở phía trước của tế bào, có chứa chức năng vận chuyển. Roi có cấu tạo giống với roi của các sinh vật nhân thật.

Một số tảo còn có một chấm đỏ ở gốc roi gọi là điểm mắt - là cơ quan thụ cảm ánh sáng. Một số tảo đơn bào nước ngọt có không bào co bóp [74]. Tế bào của tảo có nhiều đặc điểm chung của các sinh vật nhân thật (Eukaryota hay eukarya): Thành tế bào của tảo cấu tạo bởi polysaccharide. Thành tế bào gồm các sợi cellulose liên kế thành bộ xương (skeleton) nhằm bào vệ duy trì hình dạng ổn định cho tế bào.

Một số tảo có mannan hay xylan thay thế cho cellulose. Ngoài ra còn có phần vô định hình tạo nên chất nền của thành tế bào. Bên ngoài thành tế bào ở một số tảo màng keo chứa các polysaccharide có giá trị thực tiễn như alginate, fucoidane, agar, carragenan, porphyrane, furcelleran, funoran… Ở nhiều loài tảo đơn bào có thành tế bào chỉ là chất nguyên sinh đậm đặc hay chu chất (periplast). Thành tế bào của tảo silic có cấu tạo bởi chất silic.

Một số tảo có lớp muối oxyd sắt calcium carbonat bên ngoài thành tế bào [6]. Tế bào của nhiều tảo vận động được là nhờ lông roi (flagella). Roi cấu tạo bởi 9 cặp vi ống bao quanh 2 vi ống ở giữa và được bao bọc bởi màng sinh chất. Hai vi ống giữa xuất phát từ đĩa gốc (dense plates) và thể gốc (basal body).

Màng sinh chất cũng giống như ở các sinh vật khác. Trong tế bào chất có nhiều bào quan khác nhau. Lục lạp (chloroplasmt) của tảo có cấu tạo như ở thực vật, gồm hai màng bao bọc, bên trong có chất nền (stroma) cùng với hệ thống các túi dẹp gọi là thylakoit xếp chồng lên nhau tạo thành loại cấu trúc giống như grana ở thực vật. Trên màng của thylakoit có nhiều chất diệp lục (chlorophyll) và các enzim tham gia vào quá trình quang hợp.

Ngoài chất diệp lục (a, b, c, d) còn có thể có các sắc tố carotenoit, phổ biến nhất là β-caroten. Nhiều tảo chứa sắc tố xanthophyll, phycobiliprotein.Trong chất nền của lục lạp còn có ADN dạng vòng và ribosom. Đôi khi lục lạp có một vùng đậm đặc protein liên kết với các sản phẩm Khoa công nghệ sinh học| Lớp: KS. 11-04 5 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Lê Thị Thùy dự trữ tạo thành một cấu trúc gọi là nhân tinh bột hay nhân protein (pyranoit).

Lục lạp còn có chứa các giọt lipit nhỏ nằm giữa các thylakoit. Một số tảo còn có thêm một hai lớp mạng lưới nội chất lục lạp (CER- chloroplast endoplasmic reticulum).