Khảo sát điều kiện tách chiết Protease từ tụy lợn bằng phương pháp 2 pha lỏng

Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp 2 pha lỏng. Đánh giá hiệu quả và các yếu tố ảnh hưởng.

• Tác giả: Bùi Minh Nam
• Người hướng dẫn: Ths. Mai Văn Hiên
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Khảo sát một số điều kiện tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về tách chiết Protease từ tụy lợn

Protease tụy là một loại enzyme có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình tiêu hóa protein của con người. Tụy lợn chứa hàm lượng protease cao, làm cho nó trở thành một nguồn tốt để tách chiết protease cho các ứng dụng y dược học và công nghiệp. Phương pháp tách chiết 2 pha lỏng (ATPS - Aqueous Two-Phase System) là một kỹ thuật hiện đại, cho phép tách chiết các protein với hiệu suất cao và đặc tính được bảo vệ tốt. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả hơn các phương pháp truyền thống như kết tủa chất mạnh. Việc nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết enzyme từ tụy lợn là rất cần thiết để nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng thực tế.

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm của Protease tụy

Protease tụy là các enzyme proteolytic được tiết ra bởi tuyến tụy, bao gồm trypsin, chymotrypsin và elastase. Những enzyme này đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa protein thực phẩm. Tụy lợn chứa nồng độ protease rất cao, làm cho nó trở thành nguồn chiết tách protease lý tưởng. Các enzyme này có tính đặc hiệu cao và hoạt tính mạnh, phù hợp cho các ứng dụng dược phẩm.

1.2. Ý nghĩa của việc tách chiết Protease

Tách chiết protease từ tụy lợn mang lại nhiều lợi ích quan trọng trong y dược học và công nghiệp thực phẩm. Protease được sử dụng trong điều trị các bệnh tiêu hóa, chống viêm, và trong các quy trình công nghiệp. Phương pháp ATPS hiện đại giúp cải thiện độ tinh khiết và hoạt tính enzyme, tạo ra sản phẩm chất lượng cao hơn so với các phương pháp truyền thống.

II. Nguyên lý phương pháp tách chiết 2 pha lỏng ATPS

Phương pháp ATPS (Aqueous Two-Phase System) là một kỹ thuật phân vùng dựa trên việc tạo thành hai pha lỏng không phối trộn lẫn nhau từ các dung dịch polymer và muối hoặc hai polymer khác nhau. Khi các protein được đưa vào hệ thống này, chúng sẽ phân vùng ưu tiên vào một pha cụ thể tùy thuộc vào tính chất vật lý hóa học của chúng. Hệ thống Polymer/Muối (như PEG/K2PO4) và hệ thống Polymer/Polymer (như PEG/Dextran) là hai dạng ATPS phổ biến nhất. Phương pháp này có ưu điểm là môi trường nhẹ nhàng, bảo vệ tốt cấu trúc và hoạt tính enzyme protease, cho phép tách chiết liên tục với hiệu suất cao. Đây là lý do tại sao ATPS ngày càng được ưa chuộng trong các quy trình tách chiết protein từ các nguồn sinh học tự nhiên.

2.1. Hệ thống Polymer Muối trong tách chiết Protease

Hệ thống Polymer/Muối sử dụng Polyethylene Glycol (PEG) kết hợp với muối như K2PO4 hoặc K3PO4 để tạo hai pha. PEG có khả năng tương tác với protein thông qua các tương tác thẩm thấu, giúp chiết tách protease hiệu quả. Ưu điểm của hệ thống này là chi phí thấp, dễ thực hiện và phù hợp cho sản xuất quy mô lớn. Tỷ lệ PEG và muối có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách chiết enzyme và độ tinh khiết của sản phẩm.

2.2. Hệ thống Polymer Polymer trong ứng dụng

Hệ thống Polymer/Polymer kết hợp hai loại polymer khác nhau như PEG và Dextran hoặc PEG và NaPA (Natri polyacrylat). Hệ thống này cho phép điều chỉnh chọn lọc cao hơn trong quá trình tách chiết protease. Polymer/Polymer thường được sử dụng khi cần độ tinh khiết cao vì có khả năng phân biệt tốt hơn giữa các loại protein khác nhau.

III. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết

Hiệu suất tách chiết protease bằng phương pháp ATPS phụ thuộc vào nhiều yếu tố quan trọng cần được kiểm soát chặt chẽ. pH của dung dịch là một trong những yếu tố then chốt, ảnh hưởng đến điện tích của protein và khả năng phân vùng vào các pha khác nhau. Thành phần và tỷ lệ các polymer cũng quyết định độ dày của giao diện pha và khả năng chiết tách enzyme hiệu quả. Nhiệt độ trong quá trình tách chiết protease cần được duy trì ổn định để bảo vệ hoạt tính enzym. Ngoài ra, hàm lượng protein ban đầu trong dịch tụy đồng nhất, thời gian tách chiết, và các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đáng kể. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là chìa khóa để đạt được hiệu suất tách chiết cao và độ tinh khiết tốt.

3.1. Ảnh hưởng của pH đến tách chiết

pH có tác động trực tiếp đến điện tích bề mặt của protease tụy, ảnh hưởng đến khả năng tương tác với polymer. Ở pH tối ưu, protease sẽ có điện tích thích hợp, giúp cải thiện hiệu suất tách chiết enzyme. Thường pH được điều chỉnh trong khoảng 7,0-8,0 để bảo vệ tính hoạt động của protease. Các nghiên cứu cho thấy pH 7,4-7,6 thường cho kết quả tốt nhất.

3.2. Tác động của thành phần và tỷ lệ polymer

Thành phần polymer (loại và nồng độ) và tỷ lệ khối lượng giữa các thành phần quyết định định hình của hai pha trong ATPS. Thay đổi nồng độ PEG từ 10-20% (w/w) và muối từ 15-20% có thể tối ưu quá trình tách chiết protease. Việc tìm tỷ lệ tối ưu giúp tăng hàm lượng protein thu được và giảm mất mát hoạt tính enzyme.

IV. Ứng dụng thực tiễn và triển vọng tương lai

Protease tụy được tách chiết bằng phương pháp ATPS có nhiều ứng dụng quan trọng trong y dược học và công nghiệp. Trong lĩnh vực y dược, protease được sử dụng để sản xuất các thuốc tiêu hóa, chống viêm và hỗ trợ chữa lành vết thương. Trong công nghiệp thực phẩm, enzyme này giúp cải thiện tính chất dinh dưỡng và hương vị của các sản phẩm. Phương pháp tách chiết ATPS có triển vọng sáng sủa nhờ các ưu điểm: môi trường thân thiện với enzym, hiệu suất cao, dễ mở rộng quy mô sản xuất. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc tách chiết protease từ tụy lợn sẽ ngày càng tối ưu hơn, mở ra những cơ hội mới trong sản xuất các enzyme tinh khiết với chi phí hiệu quả, phục vụ nhu cầu ngày càng tăng của các ngành y dược và thực phẩm.

4.1. Ứng dụng trong lĩnh vực y dược

Protease tụy từ tách chiết protease bằng ATPS được áp dụng rộng rãi trong y dược học. Enzyme này sử dụng trong điều trị các rối loạn tiêu hóa, giảm viêm, và hỗ trợ miễn dịch. Hoạt tính enzyme cao giúp tăng hiệu quả điều trị. Ngoài ra, protease cũng được sử dụng trong các bình xịt y tế và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe chuyên dụng.

4.2. Triển vọng phát triển công nghệ tách chiết

Trong tương lai, phương pháp ATPS sẽ được kết hợp với các công nghệ khác như điện di, sắc ký để nâng cao độ tinh khiết. Nghiên cứu về các hệ thống ATPS mới với chi phí thấp hơn và hiệu suất tách chiết cao hơn sẽ được ưu tiên. Ứng dụng công nghệ tách chiết enzyme hiện đại sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất, giảm chi phí và tạo ra sản phẩm protease chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong bối cảnh toàn cầu hóa và phát triển bền vững hiện nay, việc khai thác và sử dụng hiệu quả các nguồn tài nguyên sẵn có, đặc biệt là các phụ phẩm và phế phẩm từ các ngành công nghiệp khác nhau, đang trở thành một vấn đề cấp bách. Không chỉ góp phần giảm thiểu tác động đến môi trường, việc tận dụng các phụ phẩm và phế phẩm còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế, đồng thời thúc đẩy sự phát triển của nền kinh tế tuần hoàn bền vững. Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngành công nghiệp chế biến thịt lợn là một trong những ngành sản xuất ra nhiều phụ phẩm và phế phẩm nhất như tụy, ruột, da, xương,… Trong đó, tụy lợn là một nguồn phụ phẩm giàu tiềm năng vì chứa một lượng lớn enzym protease [20], [28], [82]. Protease là enzym đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp khác nhau, chiếm 60% thị trường enzym.

Chúng được sử dụng trong sản xuất chất tẩy rửa, da, thực phẩm, dược phẩm, giấy và bột giấy, cũng như trong việc thu hồi bạc từ phim ảnh và các quy trình xử lý sinh học [40]. Đặc biệt trong ngành y dược học, protease vừa có thể là nguyên liệu thô để tổng hợp các chế phẩm dược dụng, vừa đóng vai trò như một công cụ để sản xuất ra các loại thuốc khác [40], [95]. Nhờ những ứng dụng của mình, thị trường protease dự kiến sẽ tăng trưởng đáng kể trong những năm tới, có thể đạt 3,54 tỷ đô la trong năm 2024 và dự kiến đạt 4,72 tỷ đô la vào năm 2029 [46]. Đây là lý do thôi thúc các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu về các nguồn tổng hợp, các phương pháp làm tăng hiệu suất, độ tinh sạch của protease.

Trong khi đó phương pháp tách chiết 2 pha lỏng gần đây được quan tâm để thay thế các phương pháp truyền thống trong chiết xuất enzym nhờ sở hữu nhiều ưu điểm như hiệu suất cao, chi phí thấp, thân thiện với môi trường và dễ dàng mở rộng quy mô [62], [63]. Tuy nhiên, hiệu suất tách chiết phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần, tỷ lệ pha lỏng, pH, nhiệt độ, thời gian và các điều kiện khác [48], [77]. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Khảo sát một số điều kiện tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu chính: 1. Đánh giá hiệu quả tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng.

Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả tách chiết protease tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng. Định nghĩa Protease hay enzym thủy phân protein, peptidase, proteinase được định nghĩa là các enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid [17]. Theo Ủy ban Danh pháp của Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế (IUBMB), protease được xếp vào lớp 3 – Hydrolase và là phân lớp 4 (EC 3. Phân loại Việc phân nhóm các protease có thể dựa trên loại phản ứng trong đó protease đóng vai trò là chất xúc tác hay bản chất và tính chất hóa học của vị trí xúc tác, cũng như sự phát triển của cấu trúc protease và mối quan hệ của chúng [39].

Việc phân loại protease dựa trên tính đặc hiệu hoặc cơ chế xúc tác của chúng đã được Agarwal thảo luận [6]. Trong nghiên cứu này, dựa trên loại phản ứng, enzym protease được chia thành Exopeptidase (EC 3.19) và Endopeptidase (EC 3. Exopeptidase Exopeptidase hoạt động ở cuối hoặc gần cuối chuỗi polypeptid và được phân loại thành aminopeptidase hoặc carboxypeptidase. Exopeptidase giải phóng acid amin đầu N được gọi là aminopeptidase.

Những chất xúc tác phản ứng giải phóng dipeptid hoặc tripeptid lần lượt được gọi là dipeptidylpeptidase hoặc tripeptidylpeptidase [17], [73]. Sự hiện diện của aminopeptidase được báo cáo ở rất nhiều loài vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Các aminopeptidase được tiết ra dưới dạng aminopeptidase nội bào và ngoại bào [92]. Đầu C của chuỗi protein chịu ảnh hưởng chủ yếu của carboxypeptidase.

Tùy thuộc vào đặc tính của acid amin còn sót lại ở vị trí hoạt động, carboxypeptidase được phân thành ba loại: serin carboxypeptidase, cystein carboxypeptidase và metallico- carboxypeptidase [70]. Các carboxypeptidase thế hệ đầu tiên như carboxypeptidase A1 và A2 của tuyến tụy có tiềm năng trong quá trình tiêu hóa các phân tử thức ăn. Ngoài ra các carboxypeptidase tham gia tích cực vào việc chữa lành vết thương và quá trình đông máu. Endopeptidase Protease là một endopeptidase nếu nó cắt một liên kết ở xa đầu peptid, bất kể nó có cắt thêm liên kết ở gần hai đầu hay không.

Tuy nhiên, có những endopeptidase không có khả năng phân cắt protein mà chỉ có thể phân cắt các peptid ngắn. Chúng được gọi là “oligopeptidase”[74]. Các endopeptidase được phân loại tùy thuộc vào loại acid amin 2 của nhóm chịu trách nhiệm chính cho hoạt động xúc tác. Cystein protease có bộ đôi xúc tác cystein và histidin, là thành phần rất quan trọng để enzym nhóm này thể hiện khả năng xúc tác của nó.

Khoảng 20 họ cystein protease đã được công nhận [70]. Các cystein protease được chia thành bốn nhóm: (i) giống papain, (ii) giống trypsin với ưu tiên phân cắt ở arginin, (iii) đặc hiệu với acid glutamic và (iv) các loại khác. Calpains là một loại cystein protease cần ion canxi để kích hoạt enzym [71]. Serin protease được sắp xếp thành 20 họ tùy thuộc vào sự giống nhau về cấu trúc của chúng.

Mỗi serin protease có ba phân tử acid amin ở vị trí liên kết xúc tác: aspartat, histidin và serin. Serin protease đóng góp tới 1/3 tổng số protease đã biết [30]. Mỗi metalloprotease đều cần một ion kim loại hóa trị hai để thể hiện hoạt tính thủy phân protein của nó trên protease cụ thể. Cho đến nay có khoảng 30 họ được xác định [69].

Metalloprotease có thể được chia thành bốn nhóm tùy thuộc vào tính đặc hiệu của hoạt động của chúng, (i) trung tính, (ii) kiềm, (iii) Myxobacter I và (iv) Myxobacter II. Acid aspartic protease là các protease có tính acid, sử dụng phân tử nước để tạo ra aspartat tại vị trí xúc tác [91]. Những protease này được chia thành ba họ là retropepsin, protein pararetrovirus và pepsin. Các ví dụ về acid aspartic protease tiềm năng bao gồm pepsin, cathepsin và rennin.

Acid aspartic protease có hoạt tính cao và hiệu quả ở phạm vi pH thấp (3–4). Enzym thủy phân protein có threonin ở vị trí xúc tác được gọi là threonin protease. Xúc tác enzym bằng threonin protease bao gồm hai giai đoạn. Ban đầu, chất nền được nucleophile nhắm đến để tạo thành chất trung gian acyl-enzym, sau đó là quá trình thủy phân phụ thuộc vào nước để giải phóng các sản phẩm và enzym tự do [15].

Acid glutamic protease được đặc trưng bởi việc tất cả vị trí hoạt động đều chứa acid glutamic. Acid glutamic protease có tính acid và hoạt động tốt ở pH 2. Eqolisin là một ví dụ tiềm năng của protease glutamic được phân lập từ nấm Scytalidium lignicola [84]. Đặc điểm chung của một số loại endopeptidase được trình bày trong Bảng 1.

Đặc điểm của một số loại endopeptidase [40] Loại Cystein protease Serin protease Metallo- Acid aspartic protease protease Ví dụ μ-Calpain Trypsin Pepsin m-Calpain Chymotrypsin Cathapsin D Cathapsin B H L Mã EC 3.23 pH tối ưu 2-3 6-11 5-8 2-5 Nhiệt độ (°C) 40-55 50-70 65-85 40-55 Khối lượng phân tử 20-37 18-35 19-37 30-48 (kDa) 69-74 1. Thực vật Ở thực vật, protease tham gia vào các quá trình như huy động protein dự trữ, apoptosis (chết theo chu trình),. Protease nói chung là tồn tại dưới dạng proenzym, nó được hoạt hóa sau khi cắt đi đoạn ở đầu N [101]. Chủ yếu, protease thực vật là các endopeptidase loại cystein và hiếm khi quan sát thấy các protease loại khác [13].

Bromelain và papain là các enzym thủy phân protein từ thực vật đã được thương mại hóa và lần lượt được chiết xuất từ dứa và đu đủ [98]. Các nguồn thực vật khác cũng đã được nghiên cứu để xác định các nguồn tiềm năng cho việc sản xuất protease. Sun và cộng sự [90] đánh giá gần 90 loài thực vật và cho thấy có năm loại enzym khác từ quả kiwi, bông cải xanh, gừng, tỏi tây và ớt đỏ đã chứng minh hoạt tính protease đáng kể và những loại thực vật này là nguồn cung cấp protease tiềm năng cho các ứng dụng công nghiệp. Động vật Ở động vật, protease được tìm thấy trong các mô, khiến quá trình chiết phức tạp hơn.

Hơn nữa, nguồn gốc nguyên liệu thô có thể chứa mầm bệnh, là những chất có khả năng gây ô nhiễm, đặc biệt nếu mục đích của sản phẩm là dành cho các ứng dụng chữa bệnh [97]. Tuy nhiên, protease động vật đã được sử dụng từ lâu, chẳng hạn như chymosin được chiết xuất từ dạ dày của bê và cừu non chưa cai sữa được sử dụng trong sản xuất phô mai [60]. Trypsin, chymotrypsin, pepsin là những protease động vật có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm [40]. Các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu các protease mới từ nguồn động vật khác như protease từ tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei có tính ổn định ở nhiệt độ cao và 4 độ pH trong khoảng 7-9 [25], hay một serin protease đầu tiên từ nọc độc của loài rắn Bothrops Brazili có tác dụng tiêu sợi huyết tốt [102].

Vi sinh vật Nguồn protease vi sinh vật từ vi khuẩn, nấm men và nấm sợi chiếm khoảng 40% tổng doanh số bán enzym trên toàn thế giới [27]. Các loài Bacillus là chủng vi sinh vật tiêu biểu nhất được sử dụng trong sản xuất protease, đặc biệt là các serin protease trung tính và kiềm [98]. Bên cạnh nhiều nghiên cứu về Bacillus sp., các vi khuẩn khác cũng là những “nhà sản xuất” protease đáng kể như Pseudomonas aeruginosa [68], Streptomyces griseorubens E44G [7], Corynebacteria alkanolyticum ATH3 [16]. Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các đặc tính xúc tác mới của protease từ nấm men để ứng dụng trong công nghiệp.

Li và cộng sự [57] đã báo cáo việc sản xuất protease acid liên kết tế bào đầu tiên từ nấm men biển Metschnikowia reukaufii W6b có khả năng đông tụ sữa, chứng tỏ tiềm năng trong ngành công nghiệp phô mai, thực phẩm và lên men. Viana và cộng sự [26] đã đánh giá thành phần vi sinh vật trong sữa bò và nhận thấy 17,60% là nấm men, trong đó Candida buinensis đã chứng minh hoạt tính thủy phân protein cao nhất. Protease nấm có quy trình thu hồi đơn giản do sử dụng phương pháp lọc để tách sợi nấm. Đây là ưu điểm vì vi khuẩn đòi hỏi các quy trình tốn kém hơn để phân tách tế bào [29].

Các loài Aspergillus là loài nấm sản xuất protease chiếm ưu thế, đặc biệt là cho các ứng dụng thực phẩm [32], [34], [98]. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT PROTEASE 1.