Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp từ E.Coli trong điều kiện GMP

Luận văn nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp từ E. coli theo chuẩn GMP. Đột phá mới trong y học, ứng dụng tiềm năng điều trị bệnh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Thu
• Người hướng dẫn: GS. Trương Nam Hải
• Trường học: Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình ung thư ở Việt Nam và trên thế giới
• 1.2. Các phương pháp điều trị ung thư
• 1.3. Tổng quan về Interleukin-2
• 1.3.1. Cấu trúc của Interleukin-2
• 1.3.2. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2
• 1.3.3. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
• 1.4. Hệ biểu hiện E. coli
• 1.5. Vector biểu hiện pET22b(+)
• 1.6. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor
• 1.7. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 1.8. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 1.9. Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Chủng giống và plasmid
• 2.1.2. Máy móc và thiết bị
• 2.1.3. Các môi trường và dung dịch
• 2.1.3.1. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein
• 2.1.3.2. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2
• 2.1.3.3. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC
• 2.1.3.4. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE
• 2.1.3.5. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE
• 2.1.3.6. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot
• 2.1.3.7. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít
• 2.2.2. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế)
• 2.2.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 2.2.4. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 2.2.5. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot
• 2.2.6. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One
• 2.2.7. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit
• 2.2.8. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA
• 2.2.9. Điện di SDS-PAGE
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít
• 3.1.1. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít
• 3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng
• 3.1.3. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt 1
• 3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2
• 3.2. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men
• 3.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 3.4. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 3.5. Xác định độ tinh sạch của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One
• 3.6. Xác định hàm lượng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Hiểu Rõ Về Sản Xuất IL 2 Tái Tổ Hợp E

Interleukin-2 (IL-2) người là một cytokine then chốt, đóng vai trò trung tâm trong việc điều hòa và kích hoạt đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Trong bối cảnh các bệnh ung thư ngày càng gia tăng, liệu pháp miễn dịch ung thư sử dụng IL-2 nổi lên như một giải pháp đột phá, đặc biệt trong điều trị ung thư biểu mô thận và u hắc tố ác tính. Tuy nhiên, việc sản xuất IL-2 từ nguồn tự nhiên là không khả thi về mặt quy mô và chi phí. Do đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở ra một kỷ nguyên mới, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp này với số lượng lớn. Trong các hệ thống biểu hiện, hệ thống biểu hiện E. coli được ưu tiên lựa chọn nhờ tốc độ sinh trưởng nhanh, môi trường nuôi cấy đơn giản và chi phí thấp. Tuy nhiên, để Interleukin-2 tái tổ hợp có thể được sử dụng làm dược chất trên người, toàn bộ quy trình phải tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn Thực hành sản xuất tốt (GMP). Nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Thu (2015) tập trung vào việc hoàn thiện quy trình này, từ việc tối ưu hóa biểu hiện protein trong chủng E. coli BL21(DE3) đến việc thiết lập một quy trình tinh sạch hiệu quả. Mục tiêu cuối cùng là tạo ra một sản phẩm dược phẩm sinh học an toàn, có hoạt tính cao và giá thành hợp lý, góp phần tự chủ nguồn cung nguyên liệu dược phẩm sinh học (API) quan trọng này tại Việt Nam. Bài viết này sẽ phân tích sâu các khía cạnh kỹ thuật, từ thách thức đến giải pháp trong việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp E.Coli đạt chuẩn GMP.

1.1. Interleukin 2 Cytokine then chốt trong liệu pháp miễn dịch

Interleukin-2 (IL-2) là một glycoprotein có khối lượng phân tử khoảng 15 kDa, được tiết ra chủ yếu bởi tế bào lympho T. Chức năng chính của nó là kích thích sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào miễn dịch quan trọng như tế bào T, tế bào giết tự nhiên (NK), và đại thực bào. Cơ chế này giúp tăng cường khả năng của hệ miễn dịch trong việc nhận diện và tiêu diệt các tế bào bất thường, bao gồm cả tế bào ung thư. Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã chính thức phê duyệt việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ung thư, minh chứng cho vai trò không thể thiếu của nó trong y học hiện đại. Sản phẩm thương mại Proleukin® (Aldesleukin) là một minh chứng thành công, tuy nhiên chi phí cao là một rào cản lớn. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất trong nước là một nhiệm vụ cấp thiết.

1.2. Tại sao hệ thống biểu hiện E. coli là lựa chọn tối ưu

Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) là một trong những hệ thống biểu hiện phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp. Ưu điểm vượt trội của hệ thống này bao gồm: tốc độ sinh trưởng cực nhanh (thời gian nhân đôi chỉ khoảng 20-30 phút), môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền, và khả năng đạt được mật độ tế bào cao trong các hệ thống lên men vi sinh vật quy mô lớn. Đặc biệt, bộ gen của E. coli đã được giải mã hoàn toàn và có nhiều công cụ di truyền mạnh mẽ, ví dụ như vector biểu hiện pET và các chủng E. coli BL21(DE3) được biến đổi gen để tối ưu hóa hiệu suất biểu hiện. Những yếu tố này giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất và thời gian nghiên cứu, khiến E. coli trở thành một "nhà máy tế bào" lý tưởng cho việc sản xuất các dược phẩm sinh học như IL-2.

II. Các Thách Thức Khi Sản Xuất IL 2 Tái Tổ Hợp Trong E

Mặc dù hệ thống biểu hiện E. coli có nhiều ưu điểm, quá trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp vẫn đối mặt với hai thách thức kỹ thuật lớn, ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng và độ an toàn của sản phẩm cuối cùng. Thách thức đầu tiên và phổ biến nhất là sự hình thành các thể vùi (inclusion bodies). Do tốc độ tổng hợp protein diễn ra quá nhanh và môi trường nội bào của vi khuẩn thiếu các hệ thống hỗ trợ cuộn gấp phức tạp của sinh vật bậc cao, phân tử IL-2 thường không cuộn xoắn đúng cấu trúc không gian. Thay vào đó, chúng tích tụ lại thành các khối protein không tan, không có hoạt tính sinh học. Thách thức thứ hai liên quan đến bản chất của E. coli là vi khuẩn Gram âm. Màng ngoài của chúng chứa lipopolysaccharide (LPS), hay còn gọi là nội độc tố (endotoxin). Chất này khi đi vào máu người có thể gây ra các phản ứng miễn dịch nguy hiểm như sốt cao, sốc nhiễm trùng. Do đó, việc loại bỏ nội độc tố khỏi sản phẩm cuối cùng là một yêu cầu bắt buộc và tối quan trọng trong quy trình sản xuất GMP. Việc giải quyết triệt để hai vấn đề này là chìa khóa để đảm bảo sản phẩm protein tái tổ hợp không chỉ có hoạt tính sinh học IL-2 cao mà còn đạt tiêu chuẩn an toàn để sử dụng trên người.

2.1. Vấn đề hình thành thể vùi inclusion bodies không tan

Khi một gen ngoại lai được biểu hiện ở mức độ cao trong E. coli, các chuỗi polypeptide mới tổng hợp không kịp cuộn gấp thành cấu trúc không gian ba chiều chính xác. Chúng có xu hướng kết tụ lại với nhau tạo thành các khối đặc, không hòa tan gọi là thể vùi. Mặc dù việc này giúp bảo vệ protein khỏi sự phân giải của protease nội bào và giúp thu nhận dễ dàng hơn ở bước đầu, protein trong thể vùi lại hoàn toàn mất hoạt tính sinh học. Để khôi phục hoạt tính, cần phải thực hiện một quy trình phức tạp bao gồm việc hòa tan thể vùi bằng các chất biến tính mạnh (như urea hoặc guanidine HCl) và sau đó là quá trình tái cuộn xoắn protein (refolding) trong điều kiện được kiểm soát chặt chẽ. Quá trình này thường có hiệu suất thấp và đòi hỏi sự tối ưu hóa kỹ lưỡng.

2.2. Nguy cơ nhiễm nội độc tố endotoxin từ vi khuẩn

Nội độc tố (LPS) là thành phần cấu trúc của màng ngoài vi khuẩn Gram âm như E. coli. Trong quá trình phá vỡ tế bào để thu nhận protein tái tổ hợp, một lượng lớn nội độc tố sẽ được giải phóng vào dung dịch. Đây là một chất gây sốt cực mạnh, có thể gây nguy hiểm đến tính mạng người bệnh dù chỉ ở nồng độ rất thấp. Theo Dược điển Hoa Kỳ, hàm lượng nội độc tố cho các sản phẩm tiêm tĩnh mạch không được vượt quá 0.5 EU/ml. Do đó, quy trình tinh sạch phải tích hợp các bước chuyên biệt để loại bỏ nội độc tố, thường sử dụng các phương pháp như sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực. Việc kiểm soát chất lượng dược phẩm ở khâu này là cực kỳ quan trọng, đòi hỏi phải có các phép thử LAL (Limulus Amebocyte Lysate) để xác nhận sản phẩm cuối cùng đạt tiêu chuẩn an toàn.

III. Hướng Dẫn Lên Men Tối Ưu Sản Xuất IL 2 Tái Tổ Hợp E

Để tối đa hóa sản lượng protein tái tổ hợp, quá trình lên men vi sinh vật phải được kiểm soát và tối ưu hóa một cách khoa học. Đây là giai đoạn quyết định đến mật độ tế bào và hiệu suất biểu hiện IL-2 trước khi bước vào giai đoạn tinh sạch. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Thu (2015) đã thực hiện việc chuyển giao công nghệ từ quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác) sang quy mô lớn hơn trong các hệ thống lên men 5 lít và 10 lít tại nhà máy sản xuất chuẩn GMP-WHO. Quá trình này không chỉ đơn giản là tăng thể tích mà đòi hỏi phải tối ưu lại hàng loạt các thông số. Các yếu tố quan trọng như thành phần môi trường dinh dưỡng, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), nhiệt độ, pH, và lượng oxy hòa tan (dOT) đều được khảo sát một cách hệ thống. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung dinh dưỡng đúng thời điểm và sử dụng nồng độ chất cảm ứng phù hợp có thể làm tăng sinh khối tế bào lên 3-5 lần và tăng hàm lượng Interleukin-2 tái tổ hợp thu được lên 2-3 lần so với điều kiện ban đầu. Việc tối ưu hóa này là nền tảng vững chắc để đảm bảo một quy trình sản xuất ổn định, hiệu quả và có khả năng nhân rộng lên quy mô công nghiệp.

3.1. Thiết lập quy trình lên men vi sinh vật quy mô lớn

Quy trình được bắt đầu bằng việc nuôi cấy chủng giống E. coli BL21-IL2 qua đêm. Sau đó, toàn bộ dịch cấy được chuyển vào hệ thống lên men bioreactor 5 lít hoặc 10 lít. Các điều kiện ban đầu được thiết lập bao gồm nhiệt độ 37°C, pH môi trường 6.0 - 7.0, và tốc độ khuấy, sục khí được điều chỉnh tăng dần theo thời gian. Hệ thống bioreactor cho phép theo dõi liên tục các thông số quan trọng, đặc biệt là nồng độ oxy hòa tan (dOT). Khi chỉ số dOT giảm xuống dưới 20%, điều này cho thấy vi khuẩn đang tiêu thụ mạnh nguồn dinh dưỡng và oxy để sinh trưởng. Đây là thời điểm then chốt để bổ sung dinh dưỡng và chuẩn bị cho giai đoạn cảm ứng biểu hiện protein.

3.2. Tối ưu hóa dinh dưỡng và chất cảm ứng để tăng sinh khối

Thí nghiệm khảo sát cho thấy việc bổ sung hỗn hợp 1% glucose và 0,5% cao nấm men khi chỉ số dOT giảm xuống dưới 20% mang lại hiệu quả cao nhất. Glucose cung cấp nguồn carbon chính, trong khi cao nấm men cung cấp các amino acid và vitamin thiết yếu, giúp tế bào tăng trưởng mạnh mẽ, đạt giá trị OD600 cao. Dựa trên Bảng 3.1 của nghiên cứu, điều kiện này cho hàm lượng IL-2 cao nhất (0,523 mg/ml). Bên cạnh đó, nồng độ chất cảm ứng IPTG cũng được tối ưu hóa. Kết quả cho thấy nồng độ 0,5 mM IPTG đã đủ để kích hoạt biểu hiện mạnh mẽ, tương đương với nồng độ 1 mM nhưng giúp tiết kiệm chi phí sản xuất đáng kể. Điều kiện tối ưu này sau đó đã được áp dụng cho quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp ở quy mô 10 lít.

IV. Phương Pháp Tinh Sạch Protein IL 2 Đạt Chuẩn GMP

Sau khi kết thúc quá trình lên men, bước tiếp theo và cũng là bước quan trọng nhất để tạo ra một dược phẩm sinh học đạt chuẩn là tinh sạch protein. Quá trình này nhằm mục đích loại bỏ toàn bộ các tạp chất của tế bào chủ E. coli (như protein khác, DNA, và đặc biệt là nội độc tố) để thu được Interleukin-2 tái tổ hợp với độ tinh sạch trên 95%. Quy trình tinh sạch được chia làm hai giai đoạn chính. Giai đoạn đầu là tiền tinh chế, tập trung vào việc phá vỡ tế bào, thu nhận và hòa tan các thể vùi chứa IL-2. Đây là bước xử lý thô nhưng có vai trò quyết định đến hiệu suất của toàn bộ quá trình. Giai đoạn thứ hai, và cũng là giai đoạn tinh vi nhất, là sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này dựa trên các nguyên tắc hóa lý khác nhau để tách IL-2 ra khỏi các tạp chất còn lại. Việc kết hợp một quy trình tiền tinh chế hiệu quả với một hệ thống sắc ký hiện đại đảm bảo sản phẩm cuối cùng không chỉ tinh khiết mà còn giữ được hoạt tính sinh học IL-2 vốn có, sẵn sàng cho các bước kiểm định chất lượng tiếp theo trong quy trình sản xuất GMP.

4.1. Quy trình tiền tinh chế và tái cuộn xoắn protein refolding

Sinh khối tế bào thu được sau lên men được phá vỡ bằng phương pháp siêu âm. Do IL-2 tồn tại dưới dạng thể vùi, chúng được thu lại dễ dàng bằng cách ly tâm. Các thể vùi này sau đó được hòa tan trong dung dịch đệm chứa chất biến tính mạnh (Guanidine HCl 7M) để duỗi thẳng hoàn toàn cấu trúc protein. Tiếp theo là bước quan trọng nhất: tái cuộn xoắn protein (refolding). Dịch protein được pha loãng từ từ để giảm nồng độ chất biến tính, cho phép các chuỗi polypeptide tự cuộn xoắn trở lại cấu trúc không gian 3D đúng. Quá trình này được thực hiện trong điều kiện được kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ và pH để tối đa hóa hiệu suất thu hồi protein có hoạt tính.

4.2. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để tinh sạch

Sau khi tái cuộn xoắn, mẫu IL-2 được đưa vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột sắc ký pha đảo (Reversed-phase). Nguyên lý của phương pháp này là các protein sẽ tương tác kỵ nước với pha tĩnh của cột ở các mức độ khác nhau. Bằng cách thay đổi từ từ nồng độ dung môi hữu cơ (pha động), các protein khác nhau sẽ được rửa giải ra khỏi cột tại những thời điểm khác nhau. IL-2 sẽ được thu nhận tại một đỉnh (peak) đặc trưng trên sắc ký đồ. Phương pháp HPLC pha đảo có khả năng phân tách rất cao, cho phép thu được sản phẩm protein tái tổ hợp với độ tinh sạch vượt trội, thường lớn hơn 95%, đáp ứng yêu cầu khắt khe của quy trình sản xuất GMP.

V. Kết Quả Kiểm Định Chất Lượng Sản Xuất IL 2 Tái Tổ Hợp

Một sản phẩm dược phẩm sinh học chỉ được coi là thành công khi nó vượt qua các bài kiểm tra nghiêm ngặt về chất lượng, độ an toàn và hiệu quả. Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp E.Coli đạt chuẩn GMP không chỉ dừng lại ở việc tạo ra protein, mà phải chứng minh được sản phẩm cuối cùng đạt các tiêu chuẩn dược điển. Trong khuôn khổ nghiên cứu, sản phẩm IL-2 sau khi tinh sạch bằng HPLC đã được tiến hành hàng loạt các phép thử quan trọng. Đầu tiên là kiểm soát chất lượng dược phẩm về mặt hóa lý, bao gồm việc xác định độ tinh sạch và nhận dạng đúng protein mục tiêu. Tiếp theo là kiểm tra độ an toàn sinh học, với phép thử loại bỏ nội độc tố là quan trọng nhất. Cuối cùng, và cũng là yếu tố quyết định giá trị của sản phẩm, là đánh giá hoạt tính sinh học IL-2. Phép thử này nhằm xác nhận rằng protein tái tổ hợp không chỉ đúng về cấu trúc mà còn có khả năng kích thích tế bào miễn dịch hoạt động như IL-2 tự nhiên. Kết quả từ các phân tích này là bằng chứng xác thực cho sự thành công của quy trình, mở đường cho việc ứng dụng trong liệu pháp miễn dịch ung thư.

5.1. Kiểm soát chất lượng dược phẩm Độ tinh sạch và an toàn

Độ tinh sạch của sản phẩm IL-2 sau HPLC được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và phân tích bằng phần mềm Quantity One. Kết quả cho thấy sản phẩm đạt độ tinh sạch rất cao, lớn hơn 95%, chỉ xuất hiện một băng protein duy nhất ở khối lượng phân tử khoảng 15 kDa. Tính đặc hiệu của protein được khẳng định lại bằng phương pháp Western blot, cho thấy khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2. Về độ an toàn, phép thử LAL kit được sử dụng để kiểm tra hàm lượng nội độc tố. Kết quả cho thấy mẫu IL-2 tinh sạch là âm tính, tức hàm lượng nội độc tố thấp hơn ngưỡng cho phép, đảm bảo an toàn cho việc tiêm vào cơ thể.

5.2. Đánh giá hoạt tính sinh học IL 2 trên dòng tế bào CTLL2

Hoạt tính sinh học là chỉ số quan trọng nhất để đánh giá hiệu quả của IL-2. Nghiên cứu đã sử dụng dòng tế bào lympho T của chuột (CTLL2), một dòng tế bào có sự sinh trưởng phụ thuộc hoàn toàn vào sự có mặt của IL-2 trong môi trường. Bằng phương pháp MTT assay, khả năng kích thích tăng sinh tế bào CTLL2 của mẫu IL-2 tái tổ hợp đã được định lượng và so sánh với mẫu IL-2 chuẩn quốc tế. Kết quả (Bảng 3.2, Nguyễn Thị Minh Thu, 2015) cho thấy các mẫu IL-2 sản xuất trong nước có giá trị EC50 (nồng độ cho 50% hiệu quả tối đa) rất thấp, chứng tỏ hoạt tính sinh học mạnh mẽ và tương đương với các sản phẩm thương mại. Điều này khẳng định quy trình sản xuất đã tạo ra một sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Sức khỏe cộng đồng và ung thƣ là những vấn đề ngày càng đƣợc quan tâmở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Trong đó, ung thƣ là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho ngƣời bệnh và đang có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Theo ghi nhận của tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), trên thế giới có 14,1 triệu ca ung thƣ mớiđƣợc phát hiện và 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ. Ƣớc tính tới năm 2030, mỗi năm sẽ có thêm 25 triệu ca mới mắc bệnh.

Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307, ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190. Nguyên nhân chính gây ung thƣ là do môi trƣờng bên ngoài cùng với chế độ sinh hoạt hằng ngày chiếm tới 90%. Hiện nay các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn là những phƣơng pháp phổ biến nhất trong điều trị ung thƣ trên thế giới. Tuy nhiên, chúng còn một số nhƣợc điểm nhƣ là có thể gây tổn thƣơng cho các tế bào lành, ảnh hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời bệnh.

Ngoài các phƣơng pháp điều trị trên thì liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu quả cao. Liệu pháp này có thể tiêu diệt tế bào ung thƣ, khống chế khả năng phát triển nhanh chóng của khối u và không làm tổn thƣơng các tế bào khỏe mạnh, tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lƣợng sống. Do đó,liệu pháp miễn dịch đƣợc coi là liệu pháp xanh vì có hiệu quả điều trị rõ rệt, không có tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt, mở ra một hình thức điều trị hoàn toàn mới cho bệnh nhân ung thƣ. Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm nhận biết và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) là một cytokineđƣợc tiết bởi tế bào lympho T đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể.

Cytokine này tham gia vào quá trình kích thích hệ thống miễn dịch sản sinh ra các dòng tế bào T, đồng thời kích thích sự tăng sinh và biệt hóa các dòng tế bào NK và các đại thực bào nhằm tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. IL- 2 đã đƣợc sử dụng điều trị hiệu quả hai loại ung thƣ biểu mô thận và ung thƣ da. Ngoài ra, IL-2 còn đƣợc sử dụng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thƣ khác nhƣ ung thƣ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : [e-mail] phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ buồng trứng,… và có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV. Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã cho phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ung thƣ.

Hiện nay, chế phẩm IL-2 với tên thƣơng phẩm Proleukin® (Aldesleukin) đã đƣợc sản xuất bởi hãng Chiron và thƣơng mại hóa trên toàn thế giới, tuy nhiên giá thành của Proleukin® còn khá cao (khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg). Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp trong điều trị nói chung vẫn còn bị bỏ ngỏ và chƣa có sản phẩm protein tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hoàn toàn từ quá trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất. Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp trong nƣớc và giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị bệnh ung thƣ ta ̣i Viê ̣t Nam , việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp và chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm là rất cần thiết. Trong quá trình nghiên cứusản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp, trình tự amino acid của IL-2 đã đƣợc cải biến nhằm tạo ra đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự giống với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA công nhận.

Ngoài ra, việc cải biến trình tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm. Sản phẩm Proleukin còn có tên hóa học là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tƣơng ứng đột biến mất alanine ở vị trí amino acid số 1, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine. Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mô phòng thí nghiệm sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, chúng tôi đã tiến hành tối ƣu biểu hiện protein IL-2 trong hệ thống lên men 5 và 10 lít tại Viện Công nghệ sinh học và công ty VABIOTECH. Sau đó, sản phẩm lên men đƣợc tiến hành tiền xử lý và tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tinh chế đƣợc tiến hành xác định hoạt tính sinh học và kiểm tra một số chỉ tiêu về độ sạch và độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu của sản phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều trị trên ngƣời với giá thành thấp hơn thƣơng phẩm Proleukin.

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP”. Đề tài đƣợc thực hiện tại Công ty Vacxin và Sinh phẩm số 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : [e-mail] 1, Bộ Y tế và phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : [e-mail] CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới Ung thƣ đang là một căn bệnh hết sức nguy hiểm khiến số lƣợng ngƣời tử vong cao nhất thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO), trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 6.000 nữ giới) và 7,6 triệu ngƣời đã tử vong do ung thƣ (4. Đến năm 2012, có khoảng 14,1 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 7.000 nữ giới) và có 8,2 triệu ngƣời tử vong (4.000 nữ giới) [13], số ngƣời mặc bệnh ung thƣ tăng 11% so với 4 năm trƣớc. Ƣớc tính đến năm 2030 số ca mắc bệnh ung thƣ trên thế giới tăng 70% tƣơng đƣơng với 25 triệu ca mới.

Số liệu mới nhất theo thống kê của Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ (American Cancer Society) cho thấy số ca ung thƣ mới tại Mỹ năm 2015 là 1.430 ngƣời tử vong, số lƣợng này đã giảm 0,43% so với năm 2014 số ca ung thƣ mới là 1.540 và số ngƣời tử vong là 589. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (International Agency for Research on Cancer) ƣớc tính trên tổng số ca ung thƣ toàn cầu, có khoảng hơn một nửa số ca ung thƣ và hơn hai phần ba ca ung thƣ sẽ gia tăng và tập trung ở những nƣớc đang phát triển. Những bệnh ung thƣ chủ yếu nhƣ: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung thƣ thận, ung thƣ da,… Trong đó ung thƣ thận và ung thƣ da chiếm tỷ lệ khoảng 2 - 3% trên tổng số ca ung thƣ [31]. Việt Nam là một trong những nƣớc đang phát triển, theo đó là sự thay đổi về kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh gây tử vong trƣớc đây nhƣ bệnh truyền nhiễm và suy dinh dƣỡng đã giảm mạnh.

Vấn đề không dừng lại ở đó, khi kinh tế phát triển nhanh đồng nghĩa với nhiều vấn đề xảy ra nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng, chất lƣợng thức ăn, béo phì,… Dẫn đến việc gia tăng các bệnh tật nhƣ tiểu đƣờng, tim mạch và đặc biệt là ung thƣ. Theo nhƣ TS. Bùi Xuân Trƣờng, Bệnh viện Đa khoa Quốc tế VinMec cho biết, so với tỷ lệ chung trên thế giới thì Việt Nam thuộc 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : [e-mail] nhóm nƣớc có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ dày, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ gan, ung thƣ đại-trực tràng [62]. Bên cạnh đó tỷ lệ ung thƣ gan tại Việt nam cũng thuộc mức cao nhất thế giới, đặc biệt ở nam giới [62].

Hầu hết các bệnh ung thƣ phổ biến thƣờng gặp tại Việt Nam đều chƣa có xu hƣớng giảm xuống và vẫn đang tiếp tục tăng lên [62]. Ƣớc tính khoảng 85% số bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam đƣợc phát hiện khi đã ở độ tuổi trên 40 [62]. Theo số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, mỗi năm có 150.000 ngƣời mắc ung thƣ mớitrong đó có 75.000 ngƣời tử vong và tại bệnh viện K, tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thƣ hằng năm tăng thêm khoảng 20-30% (PGS. Trần Văn Thuấn, Phó giám đốc bệnh viện K, Viện trƣởng Viện nghiên cứu phòng chống ung thƣ) [63].

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2008, dân số Việt Nam có khoảng 87 triệu ngƣời, số ca ung thƣ mới là 111.600 ngƣời (trong đó 55.000 ca tử vong (43.300 nữ giới) chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thƣ [14].Đặc biệt, theo thống kê mới nhất của Bộ Y tế, trong hội thảo “Phối hợp đa ngành trong phòng chống ung thƣ quốc gia” tổ chức ngày 8-12-2015, tại Hà Nội, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307 và ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190. Nhƣ vậy, việc tìm ra các phƣơng pháp phòng và điều trị ung thƣ nhằm giảm thiểu số ca mắc bệnh ung thƣ và tỉ lệ tử vong là rất cấp bách. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ Ung thƣ là một căn bệnh nguy hiểm và chiếm tỉ lệ tử vong rất cao, tuy nhiên nó có thể đƣợc chữa khỏi hoàn toàn nếu phát hiện và điều trị sớm bằng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp miễn dịch và liệu pháp gen. Các phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau để đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất với mục tiêu là chữa khỏi và giúp kiểm soát hoặc làm giảm nhẹ ung thƣ.Việc chọn lựa phƣơng pháp điều trị phụ thuộc vào từng dạng ung thƣ, vị trí khối u, giai đoạn của bệnh cũng nhƣ thể trạng của bệnh nhân.

Các phƣơng pháp điều trị truyền thống nhƣ phẫu thuật, xạ trị và hóa trị đều nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thƣ, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác nhân khác. Tuy nhiên, việc điều trị bằng ba phƣơng pháp này thƣờng gây ra các tác 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn download by : skknchat@gmail.