Luận án TS. Nguyễn Minh Ngọc: Quy trình tổng hợp Berberin Clorid

Luận án tiến sĩ Dược học trình bày quy trình tổng hợp Berberin Clorid. Nội dung nghiên cứu, phương pháp tổng hợp và tinh chế đạt chuẩn Dược điển Việt Nam.

• Tác giả: Nguyễn Minh Ngọc
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Đình Luyện
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Dược Phẩm & Bào Chế
• Đề tài: Nghiên Cứu Xây Dựng Quy Trình Tổng Hợp Berberin Clorid Chuyên Ngành Chuẩn Dược Điển
• Loại tài liệu: Luận Án
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái Quát Về Berberin Clorid Và Ứng Dụng Lâm Sàng

Berberin clorid là một hợp chất alkaloid tự nhiên có tầm quan trọng lớn trong lĩnh vực dược phẩm hiện đại. Đây là muối clorid của berberin, một alkaloid được chiết xuất từ nhiều loại dược liệu truyền thống như lá cẩu tía, hương thảo vàng và các loại thảo dược khác. Hợp chất này sở hữu nhiều tính chất sinh học quý báu, bao gồm hoạt động kháng khuẩn, chống viêm và điều hòa huyết áp. Trong công nghệ dược phẩm, berberin clorid được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh lý tiêu hóa, bệnh tim mạch và rối loạn chuyển hóa glucose. Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam quy định rõ các yêu cầu về độ tinh khiết, tính chất hóa học và an toàn của chất này, đảm bảo chất lượng trong sản xuất dược phẩm.

1.1. Đặc Điểm Cấu Trúc Hóa Học Của Berberin Clorid

Berberin clorid có công thức phân tử C₂₀H₁₈NO₅⁺Cl⁻, với cấu trúc chứa một nhân isoquinoline được ghép với một nhân benzodioxol. Cấu trúc này giúp berberin có độ ổn định cao và khả năng tương tác mạnh với các thành phần sinh học trong cơ thể. Nhóm hạt nhân quaternary ammonia làm cho berberin clorid dễ hòa tan trong nước, thuận lợi cho sản xuất và bào chế dược phẩm.

1.2. Ứng Dụng Lâm Sàng Và Tầm Quan Trọng Dược Học

Berberin clorid được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường tiêu hóa, tiêu chảy do vi khuẩn, và rối loạn chuyển hóa lipid. Nghiên cứu gần đây chứng minh hiệu quả của berberin trong kiểm soát glucose máu, giúp hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2. Hợp chất này cũng có tác dụng bảo vệ tim mạch và làm giảm viêm, mở ra nhiều khả năng ứng dụng trong lâm sàng hiện đại.

II. Quy Trình Tổng Hợp Berberin Clorid Theo Phương Pháp Hóa Học

Quy trình tổng hợp berberin clorid theo tiêu chuẩn dược điển bao gồm nhiều bước phức tạp được thiết kế để đảm bảo độ tinh khiết cao và hiệu suất tối ưu. Phương pháp hiện đại sử dụng 2,3-dimethoxybenzaldehyde làm chất liệu xuất phát chính, kết hợp với homopiperonylamin hydrochloride thông qua một loạt phản ứng hóa học có kiểm soát. Quy trình này yêu cầu kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ, pH và thời gian phản ứng để đạt được sản phẩm cuối cùng với độ tinh khiết ≥98% theo yêu cầu của Dược điển Việt Nam V. Sử dụng các chất xúc tác thích hợp và dung môi lựa chọn cẩn thận giúp nâng cao hiệu suất và giảm thiểu tạp chất trong quá trình tổng hợp berberin clorid.

2.1. Giai Đoạn Chuẩn Bị Chất Liệu Xuất Phát

Giai đoạn đầu tiên liên quan đến tổng hợp 3,4-methylenedioxy-β-nitrostyrene từ piperonal thông qua phản ứng condensation với nitromethane. Phản ứng này được xúc tác bằng piperidine hoặc các base hữu cơ khác, diễn ra ở nhiệt độ phòng đến 60°C. Sản phẩm trung gian này được tinh chế bằng kỹ thuật kết tinh để đạt độ tinh khiết cao, là nền tảng cho các bước tiếp theo.

2.2. Quy Trình Khử Và Tạo Amine

Homopiperonylamine hydrochloride được tổng hợp từ 3,4-methylenedioxy-β-nitrostyrene thông qua phản ứng khử với Fe/acetic acid hoặc LiAlH₄. Phương pháp khử với Fe được ưa chuộng hơn do an toàn cao và chi phí thấp. Sản phẩm sau khử được chuyển đổi thành muối hydrochloride để tăng độ ổn định và khả năng tan trong nước, tạo điều kiện thuận lợi cho bước ghép nối tiếp theo trong tổng hợp berberin clorid.

III. Các Phương Pháp Tinh Chế Berberin Clorid Đạt Tiêu Chuẩn Dược Điển

Tinh chế berberin clorid là giai đoạn quan trọng để loại bỏ các tạp chất hữu cơ và vô cơ, đảm bảo sản phẩm cuối cùng đáp ứng tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V. Phương pháp kết tinh lặp đi lặp lại (recrystallization) từ các dung môi thích hợp như ethanol, methanol hoặc các hỗn hợp dung môi là phương pháp chủ yếu. Khảo sát yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ kết tinh, tỷ lệ dung môi, tốc độ làm lạnh và độ pH có vai trò quyết định đến hiệu suất tinh chế và độ tinh khiết sản phẩm. Các bước tinh chế phải được thực hiện trong điều kiện kiểm soát chặt chẽ để đạt được berberin clorid với độ tinh khiết ≥98%, hàm lượng ẩm ≤5%, và không chứa các tạp chất độc hại theo quy định.

3.1. Phương Pháp Kết Tinh Và Lựa Chọn Dung Môi

Việc lựa chọn dung môi tinh chế là bước quan trọng trong quy trình tinh chế berberin clorid. Ethanol và methanol được sử dụng phổ biến do có khả năng hòa tan tốt ở nhiệt độ cao nhưng kết tinh tốt ở nhiệt độ thấp. Hỗn hợp dung môi (ethanol/water) giúp kiểm soát tốt hơn quá trình kết tinh. Tỷ lệ dung môi được tối ưu hóa thông qua nghiên cứu để đạt hiệu suất tinh chế cao nhất, thường trong khoảng 10-20 mL dung môi cho 1g berberin clorid thô.

3.2. Kiểm Tra Độ Tinh Khiết Và Đạt Chuẩn Dược Điển

Độ tinh khiết berberin clorid được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), một phương pháp phân tích tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V. Các tiêu chí đánh giá bao gồm hàm lượng alkaloid chính, tạp chất liên quan, độ ẩm, tro không hòa tan và các chất lạ khác. Sản phẩm phải đạt ≥98% berberin và không chứa các chất độc hại, đảm bảo an toàn cho sử dụng lâm sàng.

IV. Xây Dựng Quy Trình Sản Xuất Berberin Clorid Ở Quy Mô Công Nghiệp

Việc xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid ở quy mô tăng dần (từ 100g đến 500g/mẻ) là những bước quan trọng hướng tới sản xuất công nghiệp. Mỗi giai đoạn tăng quy mô đòi hỏi đánh giá lại các thông số phản ứng, kiểm soát nhiệt độ, lượng chất xúc tác và thời gian phản ứng để duy trì độ tinh khiết và hiệu suất. Kiểm soát chất lượng được thực hiện liên tục ở mỗi bước để phát hiện sớm các vấn đề. Quy trình phải tuân thủ các nguyên tắc GMP (Good Manufacturing Practice), bao gồm việc ghi chép chi tiết, xác nhận quy trình và kiểm tra định kỳ. Nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid tổng hợp dưới các điều kiện bảo quản khác nhau (nhiệt độ 25°C, 40°C; độ ẩm 65%, 75%) theo tiêu chuẩn ICH giúp xác định thời hạn sử dụng hợp lý.

4.1. Tối Ưu Hóa Thông Số Phản Ứng Ở Quy Mô Lớn

Khi tăng quy mô từ phòng thí nghiệm lên 500g/mẻ, nhiều yếu tố cần được tái đánh giá như tốc độ trộn, phân bố nhiệt, tốc độ thêm chất liệu và thời gian phản ứng. Kiểm soát nhiệt độ trở nên phức tạp hơn do tỷ lệ diện tích/thể tích giảm. Phải sử dụng thiết bị có hệ thống làm mát hiệu quả, nước lạnh tuần hoàn hoặc ban tỏa nhiệt để duy trì nhiệt độ ổn định. Việc xây dựng mô hình toán học dự báo thay đổi hiệu suất theo quy mô giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất berberin clorid.

4.2. Đánh Giá An Toàn Và Ổn Định Sản Phẩm

Thử độc tính cấp của berberin clorid tổng hợp được thực hiện trên động vật (chuột, gerbil) theo hướng dẫn OECD 423 để xác định LD50 và các hiệu ứng độc hại tiềm ẩn. Nghiên cứu độ ổn định theo tiêu chuẩn ICH trong 6 tháng ở các điều kiện tăng tốc (40°C ± 2°C, RH 75% ± 5%) và dài hạn (25°C ± 2°C, RH 60% ± 5%) xác định thời hạn sử dụng. Các kết quả này cung cấp cơ sở khoa học cho việc đăng ký và phê duyệt berberin clorid tổng hợp làm nguyên liệu dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin là một hóa dược phổ biến dùng để sản xuất thuốc cho điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn đường ruột và ức chế tình trạng kích thích co thắt nhu động ruột. Berberin được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam từ những năm 1960 làm thuốc chữa lỵ và nhiễm khuẩn đường ruột. Ngoài ra, berberin còn có trong thành phần của một số loại thuốc khác như thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do tác nhân kích thích bên ngoài và thuốc điều trị bệnh đau mắt hột. Hiện nay, rất nhiều tác dụng khác của berberin được nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng như giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm [33], [39] và chống lại tác hại của vi khuẩn tả, hạ đường huyết, làm giảm mạnh lượng cholesterol, triglycerid và xơ vữa, nhưng không gây ra tác dụng phụ điển hình như các statin [19], [29], [107].

Berberin ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào bình thường [89]. Ngoài ra, berberin còn có tác dụng bảo vệ tim mạch, đồng thời có tác dụng chống trầm cảm [82]. Nhu cầu về berberin ngày càng tăng. Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng berberin cũng rất lớn.

Trên thế giới ngành công nghiệp dược đang phải đối mặt với việc khai thác tràn lan quá mức các loại dược liệu mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt [1]. Việc canh tác truyền thống tại các vùng trồng dược liệu chứa berberin hiện nay cũng không đáp ứng được nhu cầu của thị trường thuốc hiện tại [6], [8]. Trên thế giới, các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc đã tổng hợp và thương mại hóa chế phẩm berberin tổng hợp từ rất lâu. Các nghiên cứu tổng hợp berberin đã được các nhà khoa học trên thế giới phát triển trong nhiều thập kỉ nay.

Chúng tôi thấy rằng sản xuất berberin bằng con đường tổng hợp hóa học nhằm đảm bảo sự ổn định, bền vững nguồn nguyên liệu là rất triển vọng và thiết thực. Vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng được quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g/mẻ đạt tiêu chuẩn dược dụng. Đánh giá được độc tính cấp và độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được.

Khái quát chung về berberin clorid 1. Đặc điểm cấu trúc hóa học - Công thức phân tử: [C20H18NO4]+Cl- (M = 371,86 đvC) - Công thức cấu tạo [92]: - Tên khoa học: 9,10-dimethoxy-5,6-dihydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquino[3,2-a] isoquinolin-7-ium clorid. - Dạng dược dụng của berberin được quy định trong Dược điển Việt Nam V [4], Dược điển Nhật bản XVII [92] là muối berberin clorid dihydrat. Ngoài ra, nó còn có dạng dược dụng là muối berberin tannat, berberin sulfat [92].

Trong thực vật, berberin được sinh tổng hợp từ L-tyrosin, một trong 20 acid amin cơ sở trong các quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào. Con đường sinh tổng hợp berberin 2 Trong quá trình sinh tổng hợp berberin [32] hai phân tử tyrosin tham gia vào hai quá trình phản ứng khác nhau để tạo ra hai sản phẩm trung gian là L-3,4- dihydroxyphenylalanine (L -DOPA) và acid 4-hydroxypyruvic. Các sản phẩm trung gian trên đều tham gia vào quá decarboxyl hóa để tạo thành dopamin và 4 hydroxyphenylacetaldehyd tương ứng. Hợp chất dopamin và 4-hydroxy-phenylacetaldehyd tham gia phản ứng ankyl hóa amino để tạo thành (S) -norcolaurin tương tự như phản ứng Mannich.

Sản phẩm được metyl hóa nhóm amin và ether hóa đồng thời bằng S-Adenosylmethionin (SAM) tạo thành (S) - reticulin. Sản phẩm của quá trình sinh tổng hợp này tham gia vào quá trình oxi hóa amin bậc 3 tạo thành ion iminium, sau đó nhóm iminium tham gia phản ứng đóng vòng nội phân tử (phản ứng Mannich) vị trí ortho tạo thành X. Sau đó, hợp chất X tham gia phản ứng chuyển vị xeto – enol để tạo thành (S)-scoulerin, và tiếp tục bị metyl hóa bởi SAM để tạo thành (S)–tetrahydrocolumbamin. Hợp chất này bị oxy hóa để tạo thành hợp chất metylenedioxy vòng.

Từ ortho -methoxyphenol, O2, enzym NADPH và cytochrom P-450, tạo thành (S)-canadin. Cuối cùng, (S)-canadin bị oxy hóa thành berberin. Tính chất vật lý - Berberin clorid là tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng [4]. - Berberin clorid tan trong nước theo tỷ lệ 1/400, tan tốt trong nước nóng, ethanol, không tan trong cloroform và ether.

Berberin không có carbon bất đối nên không có đồng phân quang học [11], [67]. - Berberin clorid dạng dihydrat có nhiệt độ nóng chảy là 191-192℃ [71], dạng khan nước là 204-206℃ (phân hủy) [12]. Tính chất hóa học - Dạng bazơ có khả năng tạo muối với các acid khác nhau, việc tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân tử nước [6]. [C20H18O4N]+OH- + HCl [C20H18O4N]+Cl- + H2O 3 - Berberin clorid tham gia phản ứng trao đổi [72]: [C20H18O4N]+Cl- + NaOH [C20H18O4N]+OH- + NaCl - Phản ứng cộng nucleophil vào liên kết đôi C = N+ [2], [72]: [C20H18O4N]+Cl- + NaCN [C20H18O4N]+CN- + NaCl - Nhân thơm có chứa N của berberin clorid có thể bị khử bởi các tác nhân khác nhau tạo thành hydro alcaloid không màu theo hình 1.

Phản ứng khử berberin - Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, vòng chứa nguyên tử N không vững bền, trong môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal theo hình 1. Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm 1. Ứng dụng trong lâm sàng - Berberin có hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm được chỉ định trong lâm sàng để điều trị nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ, viêm ống mật [19], [29], [107], giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm [33], [39]. - Berberin có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) bao gồm Staphylococcus aureus, Shigella antidysenteria, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Escherichia coli [52], [102], [115].

- Tác dụng điều trị nhiễm khuẩn của berberin là do khả năng liên kết với các protein amyloid trong màng sinh học, làm gián đoạn sự ổn định của nó và tăng cường hoạt 4 tính kháng khuẩn của kháng sinh, đồng thời cạnh tranh với LPS để gắn với TLR4 / MD-2, qua đó ức chế quá trình viêm trong nhiễm trùng [18]. Tác dụng dược lý Berberin lần đầu tiên được phân lập từ cây Xanthoxylon cava vào năm 1926. Dịch chiết từ các loài thực vật có chứa hoạt chất này đã được mô tả có khả năng điều trị các bệnh lý liên quan đến đường tiêu hóa như bệnh tả và các bệnh tiêu chảy do vi khuẩn trong y học dân gian truyền thống của người Mỹ, Trung Quốc và Nhật Bản trong nhiều thế kỉ. Các nghiên cứu chỉ ra rằng berberin có khả năng ức chế khá nhiều chủng vi khuẩn gram dương như Staphylococcus aureus, Staphylococcus cholermidis, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis và các chủng vi khuẩn gram âm như Aspergdlus fumigatus, Plasmodium falciparum.

Berberin có khả năng làm giảm kích thích co thắt nhu động ruột do vi khuẩn cũng như có hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra kết luận hoạt tính sinh học của hợp chất này dựa trên tương tác giữa các ion iminium trong cấu trúc dị vòng liên hợp của berberin có thể phản ứng với các acid amin trong enzym của các thụ thể trong vi sinh vật. Tác dụng hạ đường huyết Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên 36 người mắc bệnh đái tháo đường loại 2 được phân ngẫu nhiên điều trị bằng berberin hoặc metformin trong một thử nghiệm 3 tháng. Tác dụng hạ đường huyết của berberin tương tự như của metformin.

Nhóm điều trị bằng berberin giúp giảm đáng kể hemoglobin A1c (HbA1c từ 9,5% xuống 7,5%), đường huyết lúc đói (FBG từ 10,6 ± 0,9 mmol/L xuống 6,9 ± 0,5 mmol/L), đường huyết sau bữa ăn (PBG từ 19,8 ± 1,7 mmol/L xuống 11,1 ± 0,9 mmol/L) [111]. Tác dụng hạ đường huyết của berberin dựa trên nhiều cơ chế khác nhau như bảo vệ và phục hồi chức năng tế bào đảo tụy, tăng cường biểu hiện mARN insulin receptor, giảm tình trạng kháng insulin [34], [56], [109], [118]. Trong tế bào gan, tế bào mỡ, berberin làm tăng tiêu thụ hoặc hấp thu glucose khi không có insulin có thể là do sự kích thích glycolysis, có liên quan đến sự ức chế quá trình oxy hóa trong ty thể [50], [108], [110]. Berberin cũng có thể hoạt động như một chất ức chế α- 5 glucosidase.

Nó ức chế các hoạt động disacaridase và giảm vận chuyển glucose qua biểu mô ruột [76], [77]. Tác dụng cải thiện trí nhớ Alzheimer là chứng mất trí nhớ phổ biến nhất, đặc biệt ở người cao tuổi, hiện đang trở thành vấn đề sức khỏe được quan tâm trên toàn cầu. Đây là bệnh gây tử vong ở người cao tuổi đứng hàng thứ 6 hiện nay và là một trong những bệnh tốn kém nhất cho xã hội ở các nước phát triển. Berberin có thể được xem là một tác nhân đầy hứa hẹn để ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer do hợp chất này sở hữu các tác dụng sinh học như chống oxy hóa, ức chế AChE và BChE, ức chế monoamin-oxidase (MAO), giảm sự kết tập mảng β-amyloid và hạ cholesterol.

Thử nghiệm cho thấy sử dụng berberin đường uống với liều 50 mg/kg thể trọng, một lần mỗi ngày, trong 14 ngày, cải thiện đáng kể tình trạng suy giảm trí nhớ trong mô hình gây bệnh Alzheimer trên chuột [42], [43], [45], [46]. Trong một mô hình chuột bị suy giảm trí nhớ gây ra bởi việc bơm acid ibotenic, sự tồn tại của các tế bào hình chóp và hạt được tăng lên rất nhiều trong vùng hippocampus (vùng liên quan tới khả năng lưu trữ, xử lý thông tin trong não) khi dùng berberin. Trong một mô hình chấn thương của dây thần kinh chuột, bốn tuần sau khi sử dụng berberin (20 mg/kg, một lần mỗi ngày trong 1 tuần), độ dày của các sợi trục được cải thiện khoảng 1,4 lần ở gốc xa của vết thương [38]. Tác dụng hạ lipid máu Trong một nghiên cứu của 32 bệnh nhân điều trị hạ lipid máu bằng cách sử dụng berberin 500 mg, hai lần mỗi ngày trong 3 tháng.

Ở những bệnh nhân này, giảm đáng kể LDL, triglycerid, và tổng số cholesterol (giảm 25% LDL, 35% chất béo trung tính và giảm 29% cholesterol toàn phần). Trong một nghiên cứu khác kéo dài 2 tháng với 63 bệnh nhân, sử dụng berberin 500 mg hai lần mỗi ngày, giảm LDL trung bình 23,8%. Kết hợp của simvastatin 20 mg mỗi ngày và berberin, LDL hạ xuống trung bình 31,8% [17], [78]. Nghiên cứu phân tích meta thực hiện bởi Hui Dong và cộng sự đối với 14 thử nghiệm lâm sàng trên 1068 người tình nguyện, cũng chỉ ra rằng nồng độ lipoprotein cholesterol giảm rõ rệt khi được điều trị bằng berberin [31].