Nghiên cứu quy trình tách chiết Eurycomanone từ rễ Bách bệnh (Eurycoma longifolia)

Nghiên cứu chi tiết quy trình tách chiết và tinh chế hợp chất eurycomanone từ rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia), ứng dụng quan trọng trong y dược.

• Tác giả: Phạm Minh Sang
• Người hướng dẫn: TS. Phùng Văn Trung
• Trường học: Trường Đại học Mở TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Y - Dược
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình tách chiết Eurycomanone từ dịch chiết rễ cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• PHỤ LỤC
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về cây bách bệnh
• 1.1.1. Giới thiệu về cây bách bệnh
• 1.1.2. Mô tả thực vật
• 1.1.3. Phân bố thu hái và chế biến
• 1.2. Công dụng của cây bách bệnh
• 1.2.1. Một số kinh nghiệm chữa bệnh bằng cây bách bệnh
• 1.3. Thành phần hoá học
• 1.3.1. Một số công trình nghiên cứu trong nước
• 1.3.2. Một số công trình nghiên cứu ngoài nước
• 1.4. Hoạt tính sinh học của cây
• 1.4.1. Hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét và gây độc tế bào
• 1.4.2. Hoạt tính kích thích tình dục
• 1.5. Phương pháp chiết xuất, cô lập và tinh chế hợp chất tự nhiên
• 1.5.1. Phương pháp ngâm dầm
• 1.5.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
• 1.5.3. HPLC điều chế (High Performance Liquid Chromatography)
• 1.6. Phương pháp xác định cấu trúc
• 1.7. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
• 2. Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, phạm vi thí nghiệm
• 2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phân tích eurycomanone trong mẫu
• 2.3.2. Phương pháp phân tích bằng LC – MS
• 2.3.3. Khảo sát các điều kiện chiết xuất Eurycomanone
• 2.3.4. Khảo sát các điều kiện tinh chế eurycomanone
• 3. Chương III: PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết xuất eurycomanone
• 3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện tinh chế eurycomanone
• 3.2.1. Kết quả khảo sát chương trình dung môi chạy MPLC
• 3.2.2. Kết quả khảo sát chương trình dung môi chạy sắc ký điều chế (Prep – HPLC)
• 4. Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Eurycomanone và cây Bách bệnh

Eurycomanone là một hợp chất quassinoid có giá trị cao được tìm thấy trong rễ cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack). Cây Bách bệnh là loại cây dược liệu phổ biến ở Đông Nam Á, đặc biệt là ở Malaysia, được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều công dụng chữa bệnh. Eurycomanone là hoạt chất chính có tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm và tăng cường sức khỏe. Quá trình tách chiết eurycomanone từ rễ cây Bách bệnh là một bài toán quan trọng trong công nghệ sinh học y-dược hiện đại. Việc nghiên cứu quy trình chiết tách hiệu quả này giúp ứng dụng tốt hơn trong sản xuất các sản phẩm dược phẩm chất lượng cao.

1.1. Định nghĩa và đặc điểm Eurycomanone

Eurycomanone là một hợp chất alkaloid đặc trưng với cấu trúc phức tạp, có khối lượng phân tử lớn. Đây là hoạt chất chính trong rễ cây Bách bệnh, chiếm tỉ lệ khác nhau tùy vào nguồn gốc và điều kiện trồng. Hợp chất này có tính chất lipophilic (tan trong chất lỏng không cực), khó tan trong nước nhưng dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, acetonitrile. Đặc điểm này là cơ sở cho việc lựa chọn dung môi trong quá trình tách chiết.

1.2. Ứng dụng và ý nghĩa của Eurycomanone

Eurycomanone có nhiều công dụng dược học quan trọng, bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, tăng cường miễn dịch và cải thiện chức năng sinh dục. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh hiệu quả của hoạt chất này trong điều trị một số bệnh mãn tính. Việc tách chiết eurycomanone với độ tinh khiết cao là yêu cầu cần thiết để phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả và đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng quốc tế.

II. Quy trình chuẩn bị và tách chiết sơ bộ

Quy trình tách chiết eurycomanone bắt đầu từ việc chuẩn bị nguyên liệu rễ cây Bách bệnh. Trước tiên, rễ cây được làm sạch, sấy khô và tán nhuyễn thành bột mịn để tăng diện tích tiếp xúc. Bước chiết xuất sơ bộ sử dụng các dung môi hữu cơ như ethanol 95% hoặc methanol với tỉ lệ rắn-lỏng thích hợp. Quá trình này được thực hiện bằng ngâm lạnh hoặc chiết tách bằng nhiệt trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ và thời gian. Dịch chiết thô sau đó được lọc, làm bay hơi và tập trung để loại bỏ phần lớn các chất không cần thiết trước khi bước tách chiết tiếp theo.

2.1. Chuẩn bị nguyên liệu rễ cây Bách bệnh

Nguyên liệu rễ cây Bách bệnh cần được lựa chọn kỹ lưỡng từ những cây khỏe mạnh. Rễ được làm sạch bằng nước để loại bỏ đất, cặn bẩn mà không làm mất hoạt chất. Sau đó, rễ được sấy khô ở nhiệt độ 40-60°C để giảm độ ẩm và dễ tán hơn. Quá trình tán nhuyễn tạo bột mịn giúp tăng diện tích tiếp xúc với dung môi chiết, từ đó nâng cao hiệu suất tách chiết và giảm thời gian xử lý.

2.2. Chiết xuất sơ bộ Eurycomanone

Chiết xuất sơ bộ sử dụng dung môi hữu cơ chẳng hạn ethanol 95% với tỉ lệ rắn/lỏng 1:10. Quá trình ngâm lạnh thường được thực hiện trong 2-3 ngày ở nhiệt độ phòng với khuấy đều để đảm bảo tương tác tối ưu. Sau đó, dịch chiết được lọc qua giấy lọc, phần cặn rắn loại bỏ. Dịch chiết thô được tập trung bằng bay hơi dưới áp suất giảm để hòa tan eurycomanone trong lượng dung môi tối thiểu, chuẩn bị cho bước tách chiết tinh khiết tiếp theo.

III. Quy trình tách chiết tinh khiết bằng sắc ký

Để đạt được eurycomanone độ tinh khiết cao, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký pha đảo C18 được áp dụng. Quy trình tách chiết tinh khiết bao gồm hai giai đoạn chính: MPLC (Medium Performance Liquid Chromatography) để tách chiết sơ bộ các hợp chất tương tự, và Prep-HPLC để tách chiết cuối cùng đạt độ tinh khiết tối đa. Phương pháp pha động sử dụng các dung môi kể như acetonitrile, methanol và nước với những gradient tỉ lệ khác nhau tùy thuộc vào bán cước lưu của eurycomanone. Các phân đoạn collected được phân tích kiểm chứng bằng HPLC phân tích để đánh giá độ tinh khiết trước khi gộp chung.

3.1. Sắc ký MPLC pha đảo C18

Sắc ký MPLC sử dụng cột pha đảo C18 với kích thước hạt 40-63 μm để tách chiết sơ bộ. Pha động bao gồm nước/acetonitrile với các gradient tỉ lệ khác nhau tùy theo đặc tính hấp phụ của eurycomanone. Quá trình elution được theo dõi bằng UV ở bước sóng 254 nm để phát hiện eurycomanone. Các phân đoạn collected từ MPLC có nồng độ eurycomanone tăng dần, giảm khối lượng chất gây nhiễu và chuẩn bị cho bước Prep-HPLC tiếp theo.

3.2. Tách chiết tinh khiết Prep HPLC

Prep-HPLC sử dụng cột pha đảo C18 với đường kính lớn hơn (thường 20mm) để xử lý lượng mẫu lớn hơn. Pha động là hỗn hợp acetonitrile/nước hoặc methanol/nước với gradient tối ưu dựa trên kết quả MPLC. Các phân đoạn chứa eurycomanone được hứng riêng dựa trên thời gian lưu. Sau khi Prep-HPLC, mẫu được phân tích HPLC phân tích để xác nhận độ tinh khiết ≥ 98% trước khi gộp chung và sấy khô để nhận sản phẩm cuối cùng.

IV. Phương pháp phân tích xác nhận Eurycomanone

Sau quá trình tách chiết, eurycomanone phải được xác nhận danh tính và đánh giá độ tinh khiết bằng các phương pháp phân tích hiện đại. HPLC-DAD (Diode Array Detector) được sử dụng để phân tích định lượng eurycomanone với độ chọn lọc cao. Phổ UV của mẫu được so sánh với chuẩn eurycomanone để xác nhận danh tính và đánh giá độ tinh khiết. LC-MS (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry) cung cấp dữ liệu khối lượng phân tử và cấu trúc mảnh vỡ, giúp xác thực hợp chất một cách chắc chắn. Sự kết hợp các phương pháp này đảm bảo độ tin cậy cao cho kết quả phân tích và đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng quốc tế.

4.1. Phân tích HPLC và đánh giá độ tinh khiết

Phân tích HPLC là phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá độ tinh khiết eurycomanone. Cột HPLC pha đảo C18 được sử dụng với pha động tối ưu (thường acetonitrile/nước hoặc methanol/nước). Dòng chảy được duy trì ổn định khoảng 1 mL/min với nhiệt độ cột 25-30°C. Phát hiện sử dụng DAD ở bước sóng 254 nm nơi eurycomanone có hấp thụ tối đa. Độ tinh khiết được tính toán dựa trên diện tích đỉnh eurycomanone so với tổng diện tích tất cả các đỉnh, với tiêu chuẩn ≥ 98%.

4.2. Xác thực cấu trúc bằng LC MS và phổ UV

LC-MS được sử dụng để xác thực cấu trúc phân tử của eurycomanone qua khối lượng M+ và các mảnh vỡ đặc trưng. Phổ UV của mẫu so sánh với chuẩn eurycomanone giúp xác nhận danh tính dựa trên bước sóng hấp thụ. Khối lượng phân tử của eurycomanone khoảng m/z = 390, với các mảnh vỡ đặc trưng tùy thuộc cấu trúc. Sự trùng khớp giữa mẫu và chuẩn trong cả HPLC, LC-MS và phổ UV xác nhận 100% rằng mẫu đã tách chiết thành công và đạt chất lượng phẩm chất cao.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và công nghệ sinh học y - dược, việc tìm kiếm và chiết xuất các hoạt chất sinh học từ nguồn thảo dược đang là hướng nghiên cứu quan trọng nhằm tạo ra các chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường đi kèm nguy cơ tác dụng phụ và chi phí điều trị cao, đặc biệt đối với các quốc gia đang phát triển như Việt Nam. Do đó, xu hướng khai thác các nguồn dược liệu tự nhiên có chi phí hợp lý, độ an toàn cao và sẵn có trong nước nhận được sự quan tâm lớn từ giới khoa học y dược.

Cây bách bệnh (tên khoa học: Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Thanh thất Simaroubaceae), còn được biết đến với tên gọi dân gian là cây mật nhân, là loài thảo dược phân bố phổ biến tại Đông Nam Á. Tại Việt Nam, cây mọc rải rác ở các vùng núi thấp, trung du, tập trung nhiều ở miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ (Đồng Nai, Tây Ninh). Hoạt chất có giá trị dược lý nổi bật nhất tập trung ở rễ cây, chủ yếu là các hợp chất quassinoid (tiêu biểu như eurycomanone, eurycomanol) và alkaloid nhóm canthin-6-one. Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh eurycomanone có tác dụng kích thích sản sinh nội tiết tố nam (testosterone), hỗ trợ chức năng sinh lý, gây độc trên một số dòng tế bào ung thư (vú, phổi, đại tràng), chống ký sinh trùng sốt rét và kháng viêm.

Tuy nhiên, tại Việt Nam thời điểm nghiên cứu, cây bách bệnh chủ yếu được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian hoặc trong các bài thuốc cổ truyền thô sơ. Một số chế phẩm thương mại từ thảo dược trên thị trường thiếu các chất chuẩn đối chứng tinh khiết để kiểm nghiệm, định lượng chính xác hàm lượng hoạt chất cũng như đánh giá độ tinh sạch. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài "Nghiên cứu quy trình tách chiết eurycomanone từ dịch chiết rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)" được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu:

• Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập eurycomanone đạt độ tinh khiết cao từ rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng trung áp (MPLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC).
• Khảo sát, lựa chọn dung môi chiết xuất tối ưu từ nguyên liệu thô để thu hồi hàm lượng eurycomanone cao nhất.
• Khảo sát và tối ưu hóa hệ dung môi tách trên hệ thống MPLC và Prep-HPLC; kiểm tra, định danh hoạt chất và đánh giá độ tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) và HPLC phân tích.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất eurycomanone trong rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack).
• Phạm vi không gian: Mẫu rễ bách bệnh được thu thập tại tỉnh Kon Tum; các thí nghiệm chiết xuất, phân tích và tinh chế được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Hóa dược (Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại TP. Hồ Chí Minh).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 02/2019 đến tháng 05/2019.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở hóa thực vật và phương pháp phân tích, tách chiết hiện đại đối với các hợp chất thiên nhiên:

• Khung lý thuyết hóa thực vật và thành phần hoạt chất: Rễ bách bệnh chứa thành phần hóa học đa dạng với hơn 65 hợp chất đã được công bố trên thế giới, bao gồm các nhóm cấu trúc chính: quassinoid (eurycomanone, eurycomanol, pasakbumin A, longilactone...), alkaloid (canthin-6-one, β-carboline), triterpenoid (khung squallan, tirucallan) và biphenylneolignan. Trong đó, eurycomanone là quassinoid chủ đạo quyết định nhiều hoạt tính sinh học quan trọng.
• Quy chuẩn chiết xuất: Khảo sát chiết rắn - lỏng phương pháp hoàn lưu nóng theo tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 25:1 (ml/g) dựa trên hướng dẫn của Dược điển Việt Nam IV.
• Phương pháp chiết xuất và cô lập:
  • Chiết rắn - lỏng hoàn lưu nóng: Dùng để rút hoạt chất từ bột rễ khô sang dung môi chiết.
  • Sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Sử dụng hệ máy CombiFlash Rf200 (Teledyne ISCO), cột pha đảo RediSep C18 GOLD (50 g), kỹ thuật nạp mẫu khô (dry load) trên bông y tế nhằm phân tách sơ bộ các phân đoạn chứa hoạt chất mục tiêu.
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC): Sử dụng hệ thống Gilson PLC 2250, cột pha đảo Phenomenex C18 (250 mm x 21 mm, 10 μm) với vòng tiêm mẫu (sample loop) thể tích 20 ml để tinh chế phân đoạn thu nhận từ MPLC thành eurycomanone tinh khiết.
• Phương pháp phân tích và định danh:
  • Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC-MS): Hệ thống HPLC Dionex Ultimate 3000 kết hợp đầu dò khối phổ MSQ Plus (Thermo Scientific), cột Thermo Scientific Hypersil GOLD C18 (3 μm, 150 x 2,1 mm), nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI full scan: 190 – 1500 m/z) để xác định tỷ số khối lượng trên điện tích ($m/z$), đối chiếu với khối lượng phân tử lý thuyết và chất chuẩn.
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích (HPLC-DAD): Sử dụng đầu dò mảng Diode (DAD) tại bước sóng 254 nm, hệ dung môi pha động gồm Kênh A (Nước chứa 0,1% acid formic - FA) và Kênh B (Acetonitrile - AC) để kiểm tra thời gian lưu, phổ hấp thụ tử ngoại (UV) và định lượng độ tinh sạch của phân đoạn.

Bảng tóm tắt các trang thiết bị và hệ thống phân tích chính sử dụng trong nghiên cứu:

Thiết bị / Hệ thống	Hãng sản xuất / Model	Cột tách / Đầu dò	Mục đích sử dụng
MPLC	Teledyne ISCO (CombiFlash Rf200)	Cột RediSep C18 GOLD (50 g)	Tách sơ bộ các phân đoạn từ cao tổng
Prep-HPLC	Gilson PLC 2250	Cột Phenomenex C18 (250 x 21 mm, 10 μm)	Phân lập, tinh chế eurycomanone tinh khiết
LC-MS	Dionex Ultimate 3000 + MSQ Plus	Hypersil GOLD C18 (150 x 2,1 mm, 3 μm) / ESI	Xác định cấu trúc, định danh phân tử khối
HPLC phân tích	Dionex Ultimate 3000	Hypersil GOLD C18 / Đầu dò DAD (254 nm)	Kiểm tra độ tinh sạch và so sánh phổ UV

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp toàn diện các tư liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

• Tổng quan thực vật học và phân bố: Cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là loài cây gỗ nhỏ, đơn tính khác gốc, lá kép lông chim lẻ từ 10 đến 36 đôi lá chét. Mùa hoa nở vào tháng 3–4, quả chín đỏ sẫm vào tháng 5–6.
• Dược lý và kinh nghiệm chữa bệnh: Trình bày các ghi chép từ Đông y (sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi, Từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi) về tác dụng thanh nhiệt, trị tả lỵ, nôn mửa, đau mỏi gân xương, ghẻ lở, cảm mạo.
• Thành phần hóa học: Tổng kết các công trình trong nước (Nguyễn Ngọc Sương 1968, Phạm Thị Như Hồng 2006, Trần Anh Tuấn 2007) và quốc tế (Kardono 1991, Kuo 2004, các nhóm tác giả Nhật Bản từ 1982 đến 1993). Đã có hơn 65 hợp chất được xác định từ rễ bách bệnh, nổi bật là các diterpenoid dạng quassinoid, alkaloid khung canthin-6-one và β-carboline, triterpene khung squallan và tirucallan.
• Hoạt tính sinh học và độc tính: Hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum; hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư phổi (A-549) và ung thư vú (MCF-7); khả năng kích thích tăng tiết testosterone nội sinh lên 4,4 lần và thúc đẩy tổng hợp nitric oxide. Dữ liệu độc tính thực nghiệm cho thấy $LD_{50}$ của dịch chiết cồn đạt 1,5–2 g/kg, dịch chiết nước đạt 3 g/kg; độc tính cấp ở liều 0,6 g/kg và độc tính bán trường diễn ở mức 0,4 g/kg có thể ảnh hưởng đến gan, thận, lách, tinh hoàn; liều dùng khuyến nghị tối đa ở người lớn không quá 1 g/ngày.
• Phương pháp chiết xuất, cô lập và phân tích: Đánh giá nguyên lý của các phương pháp ngâm dầm, chiết lỏng - lỏng, sắc ký trung áp (MPLC), sắc ký điều chế (Prep-HPLC), phép đo khối phổ (MS) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, điều kiện vận hành thiết bị và các bước tiến hành:

• Xử lý nguyên liệu: Rễ bách bệnh Kon Tum sau khi làm sạch, cắt lát được sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi.
• Khảo sát dung môi chiết: So sánh hiệu suất chiết eurycomanone giữa ethanol (EtOH) 96% và nước cất bằng phương pháp hoàn lưu nóng trong 3 giờ với tỷ lệ dung môi/dược liệu 25:1 (100 ml/4 g). Sau đó, thực hiện điều chế cao tổng từ 2 kg nguyên liệu rễ khô với 50 lít dung môi tối ưu được lựa chọn.
• Quy trình MPLC trên cột pha đảo C18: Khảo sát 5 chương trình dung môi gradient giữa methanol (MeOH) và nước:
  • Chuẩn bị: 500 mg cao tổng hòa tan trong 1 ml MeOH, phân tán đều lên bông y tế, sấy khô hoàn toàn rồi nạp vào ống chứa mẫu (dry cartridge).
  • Ổn định cột: Cột RediSep C18 GOLD (50 g) được cân bằng bằng hệ MeOH:Nước (30:70) với lưu lượng 20 ml/phút trong 10 phút.
  • Khảo sát 5 chương trình gradient: Biến thiên tỷ lệ MeOH từ 0% lên 100% qua các khoảng thời gian khác nhau, theo dõi độ phân giải pic và thu các phân đoạn qua ống nghiệm.
• Quy trình Prep-HPLC: Mẫu phân đoạn chứa eurycomanone từ MPLC được tinh sạch tiếp trên hệ Gilson PLC 2250 (cột Phenomenex C18, kích thước 250 x 21 mm, hạt 10 μm). Khảo sát 2 chương trình rửa giải gradient MeOH:Nước ở tốc độ dòng 10 ml/phút, thể tích nạp mẫu 1,5 ml (tương đương 100 mg mẫu).
• Kiểm tra và đánh giá phân tích: Phân tích định danh bằng LC-MS (chế độ ESI) và đo độ tinh sạch bằng HPLC phân tích (đầu dò DAD 254 nm, pha động nước chứa 0,1% FA và acetonitrile).

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được và các phân tích chuyên môn:

• Khảo sát dung môi chiết: Phân tích HPLC cho thấy dung môi nước cho hàm lượng eurycomanone đạt 0,012%, cao hơn rõ rệt so với dung môi ethanol 96% chỉ đạt 0,0085%. Do đó, nước được lựa chọn làm dung môi chính để chiết 2 kg rễ bách bệnh khô thu cao tổng.
• Khảo sát chương trình dung môi MPLC:
  • Chương trình 1: Sắc ký đồ hầu như chỉ xuất hiện pic dung môi, không tách được các chất.
  • Chương trình 2 và 3: Pic sắc ký rõ nét hơn, các phân đoạn 8–10 (ở chương trình 2) và 8–12 (ở chương trình 3) xuất hiện hiện tượng kết tinh tinh thể. Tuy nhiên, khi kiểm tra bằng LC-MS, các tinh thể này không cho tín hiệu pic khối phổ của eurycomanone.
  • Chương trình 4 và 5: Tách phân đoạn đạt hiệu quả cao. Phân đoạn hứng từ ống số 14 đến 20 cho thấy pic rõ ràng. Khi đo kiểm tra trên LC-MS, phân đoạn 14–20 xuất hiện tín hiệu ion tương ứng với phân tử lượng eurycomanone ($m/z$ phù hợp) và có phổ UV trùng khớp hoàn toàn với chất chuẩn eurycomanone.
• Khảo sát chương trình dung môi Prep-HPLC: Thực hiện chạy sắc ký điều chế trên các phân đoạn 14–20 thu từ MPLC để loại bỏ tạp chất còn lại. Chương trình gradient được tối ưu hóa cho phép tách riêng biệt pic eurycomanone, thu hồi hợp chất mục tiêu đạt độ tinh khiết cao khi kiểm tra lại bằng HPLC-DAD.

Chương IV: Kết luận và đề nghị

• Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất và phân lập eurycomanone từ rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thông qua sự kết hợp giữa kỹ thuật MPLC và Prep-HPLC pha đảo. Đã xác định nước là dung môi chiết xuất thích hợp hơn ethanol 96% và thiết lập được điều kiện sắc ký tối ưu để thu nhận eurycomanone tinh sạch.
• Đề nghị: Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tối ưu hóa quy trình ở quy mô lớn hơn, ứng dụng eurycomanone phân lập được làm chất chuẩn đối chứng cho việc kiểm nghiệm các sản phẩm thảo dược thương mại, cũng như khảo sát thêm các hoạt tính sinh học chuyên sâu khác.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã đưa ra các kết quả định lượng và thông số kỹ thuật thực nghiệm cụ thể:

Kết quả chiết xuất và tinh chế thực nghiệm

Bảng so sánh hiệu suất chiết xuất eurycomanone theo dung môi:

Dung môi khảo sát	Phương pháp chiết	Tỷ lệ dung môi / dược liệu	Thời gian chiết	Hàm lượng eurycomanone thu nhận (%)	Đánh giá lựa chọn
Ethanol 96%	Hoàn lưu nóng	25:1 (100 ml / 4 g)	3 giờ	0,0085%	Không chọn
Nước cất	Hoàn lưu nóng	25:1 (100 ml / 4 g)	3 giờ	0,0120%	Được chọn để chiết cao tổng

Bảng thông số chương trình dung môi MPLC tối ưu (Chương trình 4 và 5):

Bước thực hiện	Thời gian (phút)	Tốc độ dòng (ml/phút)	Kênh A (% MeOH)	Kênh B (% Nước)	Mục đích
1	00 giây	20	20	80	Bắt đầu gradient
2	24 phút	20	50	50	Tách phân đoạn eurycomanone (ống 14–20)
3	30 phút	20	100	0	Rửa rửa giải nồng độ cao
4	40 phút	20	100	0	Rửa cột và hoàn tất chu trình

Đóng góp của đề tài

• Thiết lập quy trình tách chiết hai bước hiệu quả: Kết hợp sắc ký trung áp MPLC nạp mẫu khô để phân đoạn sơ bộ lượng lớn mẫu cao thô (500 mg/lần chạy), sau đó sử dụng Prep-HPLC để tinh chế triệt để, giúp rút ngắn thời gian phân lập và giảm thiểu tiêu tốn dung môi so với sắc ký cột cổ điển mở.
• Xác định thông số dung môi kinh tế và an toàn: Chứng minh dung môi nước đạt hiệu suất chiết eurycomanone cao hơn cồn 96% (0,012% so với 0,0085%), mang lại giải pháp chiết xuất thân thiện môi trường, chi phí thấp và dễ triển khai thực tế.
• Cung cấp dữ liệu phổ đối chứng chuẩn xác: Cung cấp đầy đủ dữ liệu sắc ký đồ HPLC, phổ tử ngoại UV và phổ khối lượng LC-MS của phân đoạn eurycomanone phân lập được so với chất chuẩn đối chiếu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung thực nghiệm của khóa luận, các hạn chế và hướng mở được ghi nhận bao gồm:

• Hạn chế:
  • Quy trình thực nghiệm mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (khối lượng mẫu chiết 2 kg rễ khô, lượng mẫu nạp cột MPLC 500 mg/mẻ và Prep-HPLC 100 mg/mẻ).
  • Chưa tiến hành khảo sát tối ưu hóa đa yếu tố đối với quá trình chiết (nhiệt độ, số lần chiết lặp lại, kích thước tiểu phân bột rễ).
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng nâng cấp quy trình chiết xuất và phân lập lên quy mô bán công nghiệp (pilot).
  • Sử dụng hoạt chất eurycomanone tinh khiết thu được để thiết lập chất chuẩn làm việc (working standard) phục vụ định lượng, kiểm soát chất lượng các chế phẩm từ cây bách bệnh trên thị trường.
  • Nghiên cứu sâu hơn về độ ổn định của hoạt chất trong các điều kiện bảo quản khác nhau.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho các đối tượng và nội dung cụ thể:

• Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Hóa dược, Dược học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
• Nội dung tham khảo giá trị:
  • Tổng quan chi tiết về hệ thống hóa thực vật cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) với danh mục hơn 65 hợp chất và các cấu trúc quassinoid, alkaloid, triterpenoid.
  • Các bảng chương trình dung môi gradient cụ thể cho hệ thống MPLC CombiFlash và Prep-HPLC Gilson pha đảo C18.
  • Phương pháp nạp mẫu khô bằng bông y tế trên cột MPLC giúp xử lý mẫu cao khó tan hoặc độ nhớt cao mà không làm nghẹt cột sắc ký.
  • Chương trình phân tích sắc ký HPLC và khối phổ LC-MS (chế độ ESI) dùng để định danh quassinoid.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lại chọn nước thay vì ethanol 96% để chiết xuất eurycomanone từ rễ bách bệnh?

Trong thử nghiệm so sánh điều kiện chiết hoàn lưu nóng (tỷ lệ dung môi/dược liệu 25:1 trong 3 giờ), phân tích HPLC cho thấy dịch chiết bằng nước thu được hàm lượng eurycomanone là 0,012%, cao hơn đáng kể so với dịch chiết bằng ethanol 96% (chỉ đạt 0,0085%). Ngoài ra, dung môi nước có ưu điểm giá thành rẻ, an toàn và dễ ứng dụng trong sản xuất thực tế.

2. Kỹ thuật nạp mẫu nào được sử dụng trong quá trình chạy sắc ký MPLC?

Nghiên cứu sử dụng phương pháp nạp mẫu khô: lấy 500 mg cao tổng hòa tan trong 1 ml methanol (có hỗ trợ đánh siêu âm), dùng bông y tế thấm hết dịch mẫu, sấy khô hoàn toàn rồi nạp vào đầu vào ("in") của ống chứa mẫu trước khi gắn lên cột pha đảo RediSep C18 GOLD 50 g.

3. Các phân đoạn kết tinh ở chương trình dung môi MPLC thứ 2 và thứ 3 có phải là eurycomanone không?

Không. Mặc dù ở chương trình 2 (phân đoạn 8–10) và chương trình 3 (phân đoạn 8–12) có xuất hiện hiện tượng kết tinh tinh thể, nhưng kết quả phân tích khối phổ LC-MS sau đó xác nhận không thấy xuất hiện mũi tín hiệu khối lượng phân tử của eurycomanone.

4. Phân đoạn MPLC nào được xác định chứa eurycomanone để đưa vào tinh chế Prep-HPLC?

Trong chương trình dung môi MPLC thứ 4 và thứ 5, các phân đoạn từ ống số 14 đến 20 cho tín hiệu sắc ký rõ ràng. Phân tích khối phổ LC-MS và phổ hấp thụ UV xác nhận các phân đoạn này chứa eurycomanone trùng khớp với chất chuẩn, do đó được gom lại để tiến hành tinh sạch trên hệ thống Prep-HPLC.

5. Thông số pha động và đầu dò dùng để kiểm tra độ tinh khiết eurycomanone bằng HPLC phân tích là gì?

Hệ thống HPLC phân tích Dionex Ultimate 3000 sử dụng đầu dò DAD ở bước sóng 254 nm. Pha động gồm Kênh A (Nước chứa 0,1% acid formic - FA) và Kênh B (Acetonitrile - AC), chạy chương trình gradient từ 10% B đến 100% B với tốc độ dòng 1,0 ml/phút trong thời gian 25 phút.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Minh Sang đã nghiên cứu và xây dựng thành công quy trình phân lập eurycomanone tinh khiết từ rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thu hái tại Kon Tum. Bằng việc chứng minh nước là dung môi chiết xuất tối ưu hơn ethanol 96% và kết hợp hiệu quả giữa sắc ký trung áp MPLC với sắc ký điều chế Prep-HPLC pha đảo C18, đề tài đã tách chiết thành công hoạt chất mục tiêu và kiểm tra định danh chính xác bằng LC-MS và HPLC-DAD. Kết quả nghiên cứu đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng, tạo tiền đề cho việc điều chế chất chuẩn đối chứng phục vụ công tác kiểm nghiệm và phát triển các chế phẩm dược liệu đạt tiêu chuẩn chất lượng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Tổng quan về cây bách bệnh I.1 Giới thiệu về cây bách bệnh Cây bách bệnh hay còn gọi là mật nhân, hậu phác, tho nan (Lào), antoung sar (campuchia), Tongkat ali (Mã Lai). Tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack (Crassula pinnata Lour.), thuộc họ thanh thất (Simaroubaceae).2 Mô tả thực vật Cây nhỏ có cành, lá kép lông chim lẻ gồm 10 đến 36 đôi lá chét, hầu như không có cuống, hình trứng dài, dày, nhẵn hoặc có lông ở mặt dưới. Cây bách bệnh là loài đơn tính khác gốc (dioecious) nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái. Hoa màu đỏ nâu mọc thành chùm, nở vào tháng 3 – 4.

Mỗi hoa có 5 – 6 cánh rất nhỏ. Cây kết quả vào tháng 5 – 6. Quả non màu xanh, khi chín đổi sang màu đỏ sẫm, nhẵn, hơi thuôn dài, đầu tù và cong, mặt trong có lông thưa và ngắn, dài từ 1 – 2 cm, ngang 0,5 – 1 cm. Một hạt có nhiều lông ngắn.3 Phân bố thu hái và chế biến Eurycoma Jack là chi nhỏ gồm những đại diện là cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á.

Vùng Đông Nam Á có ba loài và một vài dưới loài, trong đó đáng chú ý nhất là loài bách bệnh phân bố rộng rãi từ Myanmar đến các nước Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, đảo Sumatra. Ở Việt Nam cây mọc phổ biến ở khắp nước ta nhưng phổ biến nhất ở miền Trung, Tây Nguyên, Tây Ninh, đặc biệt quanh vùng Biên Hoà, Trảng Bom và Định Quán − Đồng Nai. Người ta dùng quả, vỏ thân và vỏ rễ phơi hay sấy khô làm thuốc.2 Công dụng của cây bách bệnh I.1 Tác dụng dược lý Theo Đông y, cây có vị đắng, tính ấm, dung chữa nhiều bệnh nên có tên là bách bệnh như: ăn không tiêu, tiêu chảy, nôn mửa, kiết lỵ,… Nước sắc lá cây trị ghẻ lở mụn nhọt. Các quassinoid từ rễ cây có tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét Plasmodium.

(Chan và cs, 1989) 3 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS. Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng Sách những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của GS – TS Đỗ Tất Lợi có ghi như sau: trong vỏ cây mật nhân có chứa một chất đắng gọi là quassin. Vỏ cây dùng chữa những trường hợp ăn uống không tiêu, đau mỏi lưng.

Quả của cây này dùng để chữa lỵ (Đỗ Tất Lợi, 1999). Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của TS Võ Văn Chi, người ta dùng rễ cây mật nhân thái nhỏ, tẩm rượu sao để làm thuốc, có vị đắng, tính mát. Thường dùng chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu, tức ngực, gân xương yếu, tay chân tê đau, tả lỵ, nôn mửa. Còn dùng chữa tứ thời cảm mạo.

(Võ Văn Chi, 2003) Tại Việt Nam rễ, vỏ và quả cây được dùng sắc thuốc, vị rất đắng. Thuốc được dùng trị xổ giun, sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc, đầy bụng, và cả say rượu. Khi dùng ngoài da thuốc có thể trị ghẻ lở. Có lẽ vì đa dụng nên cây này được đặt tên là “mật nhân”.

Ngoài ra cây mật nhân có khả năng tăng kích thích tố testosterone nên trong giới lực sĩ, cây dùng như vị thuốc bổ để thêm năng lượng cơ thể giúp tăng cường chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hoá, giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể.2 Một số kinh nghiệm chữa bệnh bằng cây bách bệnh I.1 Điều trị các triệu chứng về rối loạn tiêu hoá, đường ruột, đau nhức xương khớp, tê thấp Dùng 2 lít rượu với 0,2 kg rễ mật nhân.