Nghiên cứu quy trình tách chiết Eurycomanone từ rễ Bách bệnh (Eurycoma longifolia)

Nghiên cứu chi tiết quy trình tách chiết và tinh chế hợp chất eurycomanone từ rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia), ứng dụng quan trọng trong y dược.

• Tác giả: Phạm Minh Sang
• Người hướng dẫn: TS. Phùng Văn Trung
• Trường học: Trường Đại học Mở TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Y - Dược
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình tách chiết Eurycomanone từ dịch chiết rễ cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Eurycomanone và cây Bách bệnh

Eurycomanone là một hợp chất quassinoid có giá trị cao được tìm thấy trong rễ cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack). Cây Bách bệnh là loại cây dược liệu phổ biến ở Đông Nam Á, đặc biệt là ở Malaysia, được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều công dụng chữa bệnh. Eurycomanone là hoạt chất chính có tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm và tăng cường sức khỏe. Quá trình tách chiết eurycomanone từ rễ cây Bách bệnh là một bài toán quan trọng trong công nghệ sinh học y-dược hiện đại. Việc nghiên cứu quy trình chiết tách hiệu quả này giúp ứng dụng tốt hơn trong sản xuất các sản phẩm dược phẩm chất lượng cao.

1.1. Định nghĩa và đặc điểm Eurycomanone

Eurycomanone là một hợp chất alkaloid đặc trưng với cấu trúc phức tạp, có khối lượng phân tử lớn. Đây là hoạt chất chính trong rễ cây Bách bệnh, chiếm tỉ lệ khác nhau tùy vào nguồn gốc và điều kiện trồng. Hợp chất này có tính chất lipophilic (tan trong chất lỏng không cực), khó tan trong nước nhưng dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, acetonitrile. Đặc điểm này là cơ sở cho việc lựa chọn dung môi trong quá trình tách chiết.

1.2. Ứng dụng và ý nghĩa của Eurycomanone

Eurycomanone có nhiều công dụng dược học quan trọng, bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, tăng cường miễn dịch và cải thiện chức năng sinh dục. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh hiệu quả của hoạt chất này trong điều trị một số bệnh mãn tính. Việc tách chiết eurycomanone với độ tinh khiết cao là yêu cầu cần thiết để phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả và đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng quốc tế.

II. Quy trình chuẩn bị và tách chiết sơ bộ

Quy trình tách chiết eurycomanone bắt đầu từ việc chuẩn bị nguyên liệu rễ cây Bách bệnh. Trước tiên, rễ cây được làm sạch, sấy khô và tán nhuyễn thành bột mịn để tăng diện tích tiếp xúc. Bước chiết xuất sơ bộ sử dụng các dung môi hữu cơ như ethanol 95% hoặc methanol với tỉ lệ rắn-lỏng thích hợp. Quá trình này được thực hiện bằng ngâm lạnh hoặc chiết tách bằng nhiệt trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ và thời gian. Dịch chiết thô sau đó được lọc, làm bay hơi và tập trung để loại bỏ phần lớn các chất không cần thiết trước khi bước tách chiết tiếp theo.

2.1. Chuẩn bị nguyên liệu rễ cây Bách bệnh

Nguyên liệu rễ cây Bách bệnh cần được lựa chọn kỹ lưỡng từ những cây khỏe mạnh. Rễ được làm sạch bằng nước để loại bỏ đất, cặn bẩn mà không làm mất hoạt chất. Sau đó, rễ được sấy khô ở nhiệt độ 40-60°C để giảm độ ẩm và dễ tán hơn. Quá trình tán nhuyễn tạo bột mịn giúp tăng diện tích tiếp xúc với dung môi chiết, từ đó nâng cao hiệu suất tách chiết và giảm thời gian xử lý.

2.2. Chiết xuất sơ bộ Eurycomanone

Chiết xuất sơ bộ sử dụng dung môi hữu cơ chẳng hạn ethanol 95% với tỉ lệ rắn/lỏng 1:10. Quá trình ngâm lạnh thường được thực hiện trong 2-3 ngày ở nhiệt độ phòng với khuấy đều để đảm bảo tương tác tối ưu. Sau đó, dịch chiết được lọc qua giấy lọc, phần cặn rắn loại bỏ. Dịch chiết thô được tập trung bằng bay hơi dưới áp suất giảm để hòa tan eurycomanone trong lượng dung môi tối thiểu, chuẩn bị cho bước tách chiết tinh khiết tiếp theo.

III. Quy trình tách chiết tinh khiết bằng sắc ký

Để đạt được eurycomanone độ tinh khiết cao, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký pha đảo C18 được áp dụng. Quy trình tách chiết tinh khiết bao gồm hai giai đoạn chính: MPLC (Medium Performance Liquid Chromatography) để tách chiết sơ bộ các hợp chất tương tự, và Prep-HPLC để tách chiết cuối cùng đạt độ tinh khiết tối đa. Phương pháp pha động sử dụng các dung môi kể như acetonitrile, methanol và nước với những gradient tỉ lệ khác nhau tùy thuộc vào bán cước lưu của eurycomanone. Các phân đoạn collected được phân tích kiểm chứng bằng HPLC phân tích để đánh giá độ tinh khiết trước khi gộp chung.

3.1. Sắc ký MPLC pha đảo C18

Sắc ký MPLC sử dụng cột pha đảo C18 với kích thước hạt 40-63 μm để tách chiết sơ bộ. Pha động bao gồm nước/acetonitrile với các gradient tỉ lệ khác nhau tùy theo đặc tính hấp phụ của eurycomanone. Quá trình elution được theo dõi bằng UV ở bước sóng 254 nm để phát hiện eurycomanone. Các phân đoạn collected từ MPLC có nồng độ eurycomanone tăng dần, giảm khối lượng chất gây nhiễu và chuẩn bị cho bước Prep-HPLC tiếp theo.

3.2. Tách chiết tinh khiết Prep HPLC

Prep-HPLC sử dụng cột pha đảo C18 với đường kính lớn hơn (thường 20mm) để xử lý lượng mẫu lớn hơn. Pha động là hỗn hợp acetonitrile/nước hoặc methanol/nước với gradient tối ưu dựa trên kết quả MPLC. Các phân đoạn chứa eurycomanone được hứng riêng dựa trên thời gian lưu. Sau khi Prep-HPLC, mẫu được phân tích HPLC phân tích để xác nhận độ tinh khiết ≥ 98% trước khi gộp chung và sấy khô để nhận sản phẩm cuối cùng.

IV. Phương pháp phân tích xác nhận Eurycomanone

Sau quá trình tách chiết, eurycomanone phải được xác nhận danh tính và đánh giá độ tinh khiết bằng các phương pháp phân tích hiện đại. HPLC-DAD (Diode Array Detector) được sử dụng để phân tích định lượng eurycomanone với độ chọn lọc cao. Phổ UV của mẫu được so sánh với chuẩn eurycomanone để xác nhận danh tính và đánh giá độ tinh khiết. LC-MS (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry) cung cấp dữ liệu khối lượng phân tử và cấu trúc mảnh vỡ, giúp xác thực hợp chất một cách chắc chắn. Sự kết hợp các phương pháp này đảm bảo độ tin cậy cao cho kết quả phân tích và đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng quốc tế.

4.1. Phân tích HPLC và đánh giá độ tinh khiết

Phân tích HPLC là phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá độ tinh khiết eurycomanone. Cột HPLC pha đảo C18 được sử dụng với pha động tối ưu (thường acetonitrile/nước hoặc methanol/nước). Dòng chảy được duy trì ổn định khoảng 1 mL/min với nhiệt độ cột 25-30°C. Phát hiện sử dụng DAD ở bước sóng 254 nm nơi eurycomanone có hấp thụ tối đa. Độ tinh khiết được tính toán dựa trên diện tích đỉnh eurycomanone so với tổng diện tích tất cả các đỉnh, với tiêu chuẩn ≥ 98%.

4.2. Xác thực cấu trúc bằng LC MS và phổ UV

LC-MS được sử dụng để xác thực cấu trúc phân tử của eurycomanone qua khối lượng M+ và các mảnh vỡ đặc trưng. Phổ UV của mẫu so sánh với chuẩn eurycomanone giúp xác nhận danh tính dựa trên bước sóng hấp thụ. Khối lượng phân tử của eurycomanone khoảng m/z = 390, với các mảnh vỡ đặc trưng tùy thuộc cấu trúc. Sự trùng khớp giữa mẫu và chuẩn trong cả HPLC, LC-MS và phổ UV xác nhận 100% rằng mẫu đã tách chiết thành công và đạt chất lượng phẩm chất cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Tổng quan về cây bách bệnh I.1 Giới thiệu về cây bách bệnh Cây bách bệnh hay còn gọi là mật nhân, hậu phác, tho nan (Lào), antoung sar (campuchia), Tongkat ali (Mã Lai). Tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack (Crassula pinnata Lour.), thuộc họ thanh thất (Simaroubaceae).2 Mô tả thực vật Cây nhỏ có cành, lá kép lông chim lẻ gồm 10 đến 36 đôi lá chét, hầu như không có cuống, hình trứng dài, dày, nhẵn hoặc có lông ở mặt dưới. Cây bách bệnh là loài đơn tính khác gốc (dioecious) nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái. Hoa màu đỏ nâu mọc thành chùm, nở vào tháng 3 – 4.

Mỗi hoa có 5 – 6 cánh rất nhỏ. Cây kết quả vào tháng 5 – 6. Quả non màu xanh, khi chín đổi sang màu đỏ sẫm, nhẵn, hơi thuôn dài, đầu tù và cong, mặt trong có lông thưa và ngắn, dài từ 1 – 2 cm, ngang 0,5 – 1 cm. Một hạt có nhiều lông ngắn.3 Phân bố thu hái và chế biến Eurycoma Jack là chi nhỏ gồm những đại diện là cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á.

Vùng Đông Nam Á có ba loài và một vài dưới loài, trong đó đáng chú ý nhất là loài bách bệnh phân bố rộng rãi từ Myanmar đến các nước Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, đảo Sumatra. Ở Việt Nam cây mọc phổ biến ở khắp nước ta nhưng phổ biến nhất ở miền Trung, Tây Nguyên, Tây Ninh, đặc biệt quanh vùng Biên Hoà, Trảng Bom và Định Quán − Đồng Nai. Người ta dùng quả, vỏ thân và vỏ rễ phơi hay sấy khô làm thuốc.2 Công dụng của cây bách bệnh I.1 Tác dụng dược lý Theo Đông y, cây có vị đắng, tính ấm, dung chữa nhiều bệnh nên có tên là bách bệnh như: ăn không tiêu, tiêu chảy, nôn mửa, kiết lỵ,… Nước sắc lá cây trị ghẻ lở mụn nhọt. Các quassinoid từ rễ cây có tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét Plasmodium.

(Chan và cs, 1989) 3 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS. Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng Sách những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của GS – TS Đỗ Tất Lợi có ghi như sau: trong vỏ cây mật nhân có chứa một chất đắng gọi là quassin. Vỏ cây dùng chữa những trường hợp ăn uống không tiêu, đau mỏi lưng.

Quả của cây này dùng để chữa lỵ (Đỗ Tất Lợi, 1999). Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của TS Võ Văn Chi, người ta dùng rễ cây mật nhân thái nhỏ, tẩm rượu sao để làm thuốc, có vị đắng, tính mát. Thường dùng chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu, tức ngực, gân xương yếu, tay chân tê đau, tả lỵ, nôn mửa. Còn dùng chữa tứ thời cảm mạo.

(Võ Văn Chi, 2003) Tại Việt Nam rễ, vỏ và quả cây được dùng sắc thuốc, vị rất đắng. Thuốc được dùng trị xổ giun, sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc, đầy bụng, và cả say rượu. Khi dùng ngoài da thuốc có thể trị ghẻ lở. Có lẽ vì đa dụng nên cây này được đặt tên là “mật nhân”.

Ngoài ra cây mật nhân có khả năng tăng kích thích tố testosterone nên trong giới lực sĩ, cây dùng như vị thuốc bổ để thêm năng lượng cơ thể giúp tăng cường chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hoá, giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể.2 Một số kinh nghiệm chữa bệnh bằng cây bách bệnh I.1 Điều trị các triệu chứng về rối loạn tiêu hoá, đường ruột, đau nhức xương khớp, tê thấp Dùng 2 lít rượu với 0,2 kg rễ mật nhân. Cây rửa sạch rồi chẻ nhỏ ra đủ kích cỡ lọt bình ngâm là được (bằng ngón tay), phơi khô, rượu ngâm sau một thời gian chuyển sang màu vàng tuỳ đậm đặc mà màu rượu vàng mức độ nào, tuỳ độ đặc mà người uống khi rót rượu từ bình ra khi uống có thể pha thêm rượu ở ngoài.2 Công thức trị đau gan, nước da vàng, ngứa, suyễn Mật nhân tán cho nhuyễn, để bột uống hoặc làm hoàn, mỗi ngày uống 2 lần, mỗi lần 1 muỗng cà phê đầy. Trong khoảng 1 – 2 tuần sẽ hết. 4 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS.

Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng I.3 Thành phần hoá học Qua kết quả thu nhận từ các công trình nghiên cứu đã được công bố, đã phân lập hơn 65 hợp chất các loại từ rễ cây bách bệnh (Kuo và cs, 2004), thành phần hoá học của cây bách bệnh vô cùng phong phú và đa dạng, bao gồm nhiều hợp chất như các diterpenoids, triterpen với 3 khung sườn cơ bản như: quassinoid, squallan và tirucallan. Ngoài ra, còn có các alkaloid, steroid, flavonoid. Trong đó, quassinoid, alkaloid đóng vai trò quan trọng nhất và hoạt lực chủ yếu của cây bách bệnh.1 Một số công trình nghiên cứu trong nước Hiện nay trong nước chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây bách bệnh.

Năm 1968 từ cao ete dầu hoả của vỏ và lá cây mật nhân, nhóm tác giả Nguyễn Ngọc Sương, trường Đại học Khoa học Sài Gòn đã phân lập được 7 hợp chất là β- sistosterol (1), campesterol (2), 2,6-dimethoxybezoquinone (3), eurycomalactone (4), dihydroeurycomalactone (5), laurycolatone A (6), laurycolactone B (7). (1) β–sistosterol (2) Campesterol (3) 2,6-dimethoxybezoquinone (4) Eurycomalactone 5 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS. Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng (5) Dihydroeurycomalactone (6) Laurycolacton A (7) Laurycolacton B Năm 2006, GS.TS Trần Quán Anh, trung tâm nam học của bệnh viện Việt Đức - Hà Nội, đã nghiên cứu tính hiệu quả và an toàn của sản phẩm Khang Dược trong điều trị mãn dục nam.

Kết quả nghiên cứu trên 30 bệnh nhân sau thời gian sử dụng bước đầu cho thấy: 100% nam giới bị mãn dục nam có sử dụng mật nhân đều tăng nồng độ testosterone trong máu sau 3 tháng sử dụng. Thuốc có tác dụng cải thiện sức khoẻ toàn diện, nâng cao chất lượng đời sống tình dục một cách tự nhiên, gia tăng ham muốn, tăng trương lực cơ, chống mệt mỏi, hồi phục nhanh sinh lực sau khi quan hệ tình dục. Đối với những người bị rối loạn cương dương, xuất tinh sớm, thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị cùng với nhóm thuốc đặc hiệu, làm tăng khoái cảm, tăng khả năng cương cứng, kéo dài thời gian xuất tinh. 6 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS.

Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng Năm 2006 nhóm tác giả Phạm Thị Như Hồng, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM đã phân lập 3 hợp chất triterpen là 25-O-methylpiscidinol A (8), tirucallan-7,24-diene-3-one (9) và epi-sapeline (10) cùng với hai hợp chất quassinoid là quassin (11) và 18-hydroxyquassin (12). (8) 25-O-methylpiscidinol A (9) Tirucallan-7,24-diene-3-one (10) Epi-sapeline (11) Quassin (12) 18-hydroxyquassin 7 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS.

Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng Năm 2007, nhóm tác giả Trần Anh Tuấn, Trần Thị Thu Hương, Trần Hồng Quang, Nguyễn Tiến Hùng, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, đã nghiên cứu thành phần hoá học cây bách bệnh và đã cô lập được 6 hợp chất là: 9-hydroxycanthin-6-one (13), 13,18-dihydroeurycomanone (14), kaempferol-3-0-α-rhamnpyrannoisid (15), eurycomanone (16), eurylene (17), 9-methoxylcanthin-6-one (18). (17) Eurylene (16) Eurycomanone (18) 9-methoxylcanthin-6-one (13) 9-hydroxycanthin-6-one (14) 13,18-dihydroeurycomanone 8 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS. Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS.

Nguyễn Minh Hoàng I.2 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Y dược Hiroshima, Nhật, từ rễ cây có nguồn gốc từ Indonesia đã cô lập được hai hợp chất quassinoid có số oxy hoá cao có tên là eurycomanone (19) và eurycomanol (20). (19) Eurycomanone (20) Eurycomanol Năm 1982, bằng phương pháp sắc kí, phương pháp nhiễu xạ tia X để xác định cấu trúc, Nguyễn Ngọc Sương, S. Pascal đã cô lập được hai hợp chất thuộc nhóm quassinoid 20 carbons, có tên gọi là laurycolacton A (21) và laurycolacton B (22). (21) Laurycolactone A (22) Laurycolactone B 9 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS.

Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng Năm 1986, nhóm tác giả gồm: K. Warhurst, từ cao eter dầu trích từ rễ cây, không những tìm thấy những hợp chất mới thuộc nhóm quassinoid như 3,4-dihydroeurycomalacton (23), 5,6- dehydroeurycomalactone (24), 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalacton (25), mà còn phát hiện thêm sự hiện diện của các alkaloid khác như 10-hydroxycanthin-6-one (26), là tinh thể màu vàng. Đồng thời từ cao chloroform trích từ rễ cây bách bệnh nhóm tác giả đã phân lập được một hợp chất coumarin có tên gọi là scopoletin (27).

(23) 3,4-dihydroeurycomalactone (24) 5,6-dihydroeurycomalactone (27) Scopoletin (25) 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalactone (26) 10-hydroxycanthin-6-one 10 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS. Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng Năm 1989, nhóm tác giả K. Han, từ cao n-butanol trích từ rễ cây bách bệnh, nhóm tác giả đã cô lập được một quassinoid có tên gọi là eurycomanol-2-O-β-D-glucopyranoid (28).

(28) Eurycomanol-2-O-β-D-glucopyranosid Năm 1991, nhóm tác giả H. Shir, trong quá trình thử nghiệm hoạt tính sinh học của cây pasakbumi (bách bệnh), bên cạnh việc phân lập hợp chất paskbumin A (eurycomanone (29)) còn phân lập được hai hợp chất mới cũng có khung sường quassinoid là paskbumin B (30) và paskbumin C (31) từ cao methanol trích từ rễ cây bách bệnh. Eurycomanone (30) R = β – epoxide (pasakbumin – B) (31) R = α – epoxide (pasakbumin – C) 11 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS. Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS.

Nguyễn Minh Hoàng Cùng thời điểm trên, nghiên cứu từ cao n-butanol trích ly từ rễ cây bách bệnh thu hái ở Indonesia, nhóm tác giả thuộc trường đại học y dược Hiroshima - Nhật đã cô lập được hợp chất longilactone (32) và ba hợp chất quassinoid có 19 carbons là 13,21-dihydroeurycomanone (33), 13β,21-dihydroxyeurrycomanone (34) và 14,15β- dihydroklaineanone (35). (32) Longilactone (33) 13,21-dihydroeurycomanone (34) 13β,21-dihydroeurycomanone (35) 14,15β-dihydroklaineanone Năm 1993, nhóm còn tiếp tục cô lập thêm 1 hợp chất quassinoid mới từ cao n- butanol có tên 1,2-seco-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasau-2,5-olide. Ngoài ra, khi tiến hành khảo sát dịch chiết từ lá cây bách bệnh bằng dung môi CH2Cl2 thu được hai hợp chất mới là 6-dehydrolongilactone (36) và 7α- hydroeurycomalactone (37). 12 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS.

Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng 1,2-seco-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasau-2,5-olide (37) 7α -hydroxyeurycomalactone (36) 6-dehydrolongilactone Năm 1991, nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học y dược Tokyo - Nhật, trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây bách bệnh đã phân lập được hai hợp chất mới khung squallan. Đây là hai đồng phân lập thể của nhau, gồm có eurylene (38) và teurylene (39), cả hai đều có dạng tinh thể không màu, có chung công thức phân tử là C34H58O8. (38) Eurylene (39) Teurylene 13 SVTH: Phạm Minh Sang GVHD: TS.

Phùng Văn Trung Khoá luận tốt nghiệp ThS. Nguyễn Minh Hoàng Ngoài ra, từ dịch trích từ rễ cây bách bệnh với ete dầu, K. Sankawa đã cô lập được hợp chất 13β,18- dihydroeurycomanol (40) bằng cách kết tinh trong methanol.