Quy trình Real-time RT-PCR phát hiện mRNA E6 HPV 16 gây ung thư cổ tử cung

Tài liệu về quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng mRNA E6 của virus HPV 16, nguyên nhân chính gây bệnh ung thư cổ tử cung.

• Tác giả: Đinh Vũ Hồng Vân
• Người hướng dẫn: Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng sự biểu hiện mRNA E6 của Human Papilloma Virus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật Real-time RT PCR
• Loại tài liệu: Chuyên đề khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2009
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Quy Trình RT PCR Phát Hiện mRNA E6 HPV 16

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật phát hiện mRNA E6 của HPV type 16 một cách hiệu quả và chính xác. Đây là phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư cổ tử cung tiên tiến, cho phép xác định sự biểu hiện của oncogene E6 trong các mẫu bệnh phẩm. Ung thư cổ tử cung là căn bệnh nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao ở phụ nữ, nhưng có thể chữa khỏi nếu phát hiện kịp thời. Virus human papillomavirus (HPV), đặc biệt là HPV 16 và 18, là nguyên nhân chính gây bệnh. Khi HPV gắn chèn lên bộ gen người, nó biểu hiện khả năng gây ung thư thông qua sự phiên mã của các oncogene. Quy trình RT-PCR không chỉ phát hiện mà còn định lượng mức độ biểu hiện của mRNA E6, giúp theo dõi tiến triển của bệnh một cách hiệu quả.

1.1. Định Nghĩa Và Ý Nghĩa Của RT PCR

Real-time RT-PCR là kỹ thuật phân tử hiện đại kết hợp phiên mã ngược và khuếch đại DNA theo thời gian thực. Phương pháp này cho phép phát hiện mRNA E6 của HPV 16 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. So với các phương pháp truyền thống, RT-PCR có khả năng giám sát sự gia tăng của sản phẩm PCR từng chu kỳ, cung cấp dữ liệu định lượng chính xác. Điều này rất quan trọng trong chẩn đoán sớm và theo dõi sự tiến triển của xâm nhiễm HPV thành ung thư cổ tử cung.

1.2. Vai Trò Của mRNA E6 Trong Ung Thư Cổ Tử Cung

mRNA E6 là sản phẩm của sự phiên mã từ oncogene E6 của HPV 16. Protein E6 là yếu tố quan trọng gây ung thư, có khả năng ức chế protein p53, một gen ức chế khối u. Sự biểu hiện của mRNA E6 chỉ ra rằng virus đã tích hợp vào bộ gen tế bào chủ và đang hoạt động. Phát hiện mRNA E6 là chỉ dấu của sự gắn chèn HPV, từ đó giúp xác định nguy cơ phát triển thành ung thư cổ tử cung.

II. Nguyên Lý Và Các Thành Phần Của Quy Trình RT PCR

Quy trình RT-PCR bao gồm hai giai đoạn chính: phiên mã ngược và khuếch đại DNA theo thời gian thực. Giai đoạn đầu tiên, RT (Reverse Transcription), chuyển đổi mRNA E6 thành cDNA bằng enzyme reverse transcriptase. Giai đoạn thứ hai, Real-time PCR, khuếch đại cDNA bằng Taq polymerase với sự giám sát của probe huỳnh quang. Hệ primer-probe được thiết kế đặc hiệu cho gene E6 của HPV 16, tạo ra sản phẩm 81bp. Các thành phần thiết yếu bao gồm: mẫu RNA, enzyme RT, cDNA polymerase, primer, probe, và các nucleotide (dNTP). Điều kiện phản ứng được tối ưu hóa với nhiệt độ, thời gian, và nồng độ chất đặc biệt.

2.1. Giai Đoạn Phiên Mã Ngược Reverse Transcription

Phiên mã ngược là bước đầu tiên trong quy trình RT-PCR, chuyển đổi mRNA E6 thành cDNA (DNA bổ sung). Enzyme reverse transcriptase nhận diện mRNA và tổng hợp cDNA một chiều bắt đầu từ primer oligo-dT. Quá trình này diễn ra ở 37-42°C trong khoảng 30-60 phút. Độ chính xác của giai đoạn này ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phát hiện mRNA E6. cDNA sau đó được sử dụng làm khuôn cho giai đoạn Real-time PCR.

2.2. Giai Đoạn Real Time PCR Và Hệ Primer Probe

Real-time PCR khuếch đại cDNA mục tiêu qua các chu kỳ nhiệt lặp. Hệ primer-probe đặc hiệu cho gene E6 HPV 16 được sử dụng để nhận diện sản phẩm khuếch đại. Probe được gắn với fluorophore (huỳnh quang) và quencher, phát ra tín hiệu khi cDNA được khuếch đại. Sản phẩm RT-PCR có kích thước 81bp, dễ phát hiện. Nhiệt độ lai được khảo sát để tối ưu hóa độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng.

III. Quy Trình Tách Chiết Mẫu Và Chuẩn Bị Mẫu Bệnh Phẩm

Tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm là bước tiền xử lý quan trọng trong phát hiện mRNA E6 bằng RT-PCR. Mẫu bệnh phẩm (các tế bào từ cổ tử cung có kết quả xác định nhiễm HPV 16) được xử lý bằng dung dịch lysis để phá vỡ màng tế bào. RNA được tách chiết bằng phương pháp phenol-chloroform hoặc kit thương mại chuyên dụng. Mẫu RNA được bảo quản ở -20°C để duy trì ổn định. Chất lượng RNA được đánh giá thông qua đo OD260/280 bằng spectrophotometer. Mẫu RNA sạch sẽ và toàn vẹn là điều kiện tiên quyết cho RT-PCR thành công. Quy trình tách chiết ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của phát hiện mRNA E6.

3.1. Phương Pháp Tách Chiết RNA Từ Mẫu Bệnh Phẩm

Tách chiết RNA sử dụng dung dịch guanidinium thiocyanate hoặc kit RNA extraction để cô lập RNA từ mẫu tế bào. Mẫu được lysis hoàn toàn, sau đó RNA được 沉淀 bằng ethanol và rửa với ethanol 70%. RNA được hòa tan trong nước không chứa RNase hoặc TE buffer. Quy trình cần thực hiện nhanh chóng để tránh degradation RNA do RNase. Mẫu RNA được kiểm tra độ tinh khiết trước khi sử dụng cho RT-PCR.

3.2. Kiểm Định Chất Lượng RNA Và Điều Kiện Lưu Trữ

Chất lượng RNA được đánh giá bằng spectrophotometer qua tỷ số OD260/280 (phải ≥1.8). RNA toàn vẹn không bị degradation được xác nhận bằng gel electrophoresis. Mẫu RNA sạch sẽ được lưu trữ ở -20°C hoặc -80°C để bảo quản dài hạn. RNA tươi được sử dụng ngay hoặc lưu trữ tối đa 24 giờ ở 4°C. Điều kiện lưu trữ đúng đắn đảm bảo độ ổn định của mRNA E6 cho các phản ứng RT-PCR tiếp theo.

IV. Ứng Dụng Lâm Sàng Và Kết Quả Đánh Giá Quy Trình RT PCR

Quy trình RT-PCR đã được thử nghiệm thành công trên hai mươi mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân nhiễm HPV 16 xác định. Kết quả cho thấy hai trong hai mươi trường hợp xuất hiện sự gắn chèn của virus vào bộ gen tế bào chủ, được xác nhận qua sự biểu hiện của mRNA E6. Độ nhạy và độ đặc hiệu của hệ primer-probe được khảo sát và tối ưu hóa. Sản phẩm PCR 81bp dễ phát hiện và xác định bằng gel electrophoresis. Phương pháp RT-PCR có tiềm năng lớn trong chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của xâm nhiễm HPV thành ung thư cổ tử cung. Tuy nhiên, cần thử nghiệm trên một lượng bệnh phẩm lớn hơn để ứng dụng lâm sàng rộng rãi.

4.1. Kết Quả Phát Hiện mRNA E6 Trên Các Mẫu Bệnh Phẩm

Trong hai mươi mẫu bệnh phẩm được kiểm tra, hai mẫu cho kết quả dương tính, biểu hiện sự gắn chèn của HPV 16 vào bộ gen tế bào. Real-time RT-PCR phát hiện mRNA E6 thông qua tín hiệu huỳnh quang tăng đáng kể ở các chu kỳ sớm. Sản phẩm PCR có kích thước đúng 81bp được xác nhận. Các mẫu âm tính không cho tín hiệu huỳnh quang hoặc tín hiệu xuất hiện ở chu kỳ muộn. Kết quả này chứng minh quy trình RT-PCR có khả năng phát hiện mRNA E6 trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

4.2. Đánh Giá Độ Nhạy Độ Đặc Hiệu Và Triển Vọng Ứng Dụng

Độ nhạy của quy trình RT-PCR được đánh giá bằng cách khảo sát nồng độ cDNA khác nhau. Real-time PCR có thể phát hiện mRNA E6 ở nồng độ thấp so với RT-PCR thông thường. Độ đặc hiệu được xác định qua tính đặc hiệu của primer-probe đối với gene E6 HPV 16. Quy trình RT-PCR có triển vọng ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung và theo dõi đáp ứng điều trị. Cần mở rộng thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm nhiều hơn để xác nhận hiệu quả lâm sàng và chuẩn hóa quy trình.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Human Papilomavirus (HPV: virus gây u nhú vùng sinh dục) là virus gây bệnh cho con người, đặc biệt là phụ nữ. Chúng là nguyên nhân gây ra mụn cơm, mụn cóc và các sùi mào gà ở da, dương vật, âm hộ, hậu môn,… dẫn đến viêm da lành tính, hoặc viêm cơ quan sinh dục dẫn đến vô sinh. Ở phụ nữ, HPV là nguyên nhân chính gây ra bệnh ung thư cổ tử cung (chiếm khoảng 97% trường hợp [44 – 47]. Đây là loại ung thư phụ nữ thường mắc phải, chỉ sau ung thư vú.

Hàng năm trên thế giới có hơn nửa triệu phụ nữ bị ung thư cổ tử cung và trên 50% người bệnh tử vong do phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn. Còn ở Việt Nam trong 10 năm qua, có khoảng 6000 phụ nữ chết vì bệnh này, cao gấp đôi số phụ nữ chết vì AIDS, mặc dù ung thư cổ tử cung có thể được chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện sớm. Hiện nay, người ta đã tìm thấy được hơn 100 type HPV, trong đó có khoảng 40 type tác động lên đường sinh dục nhưng chỉ có 13 type là có nguy cơ cao, đặc biệt type 16 được xác định là có nguy cơ gây bệnh cao nhất [48], chúng hiện diện trong hơn 50% số ca mắc bệnh ung thư cổ tử cung [49]. Khả năng gây bệnh ung thư của các type HPV nguy cơ cao nằm trên protein sớm E6 và E7.

Hai protein này rất cần thiết cho quá trình chuyển biến của khối u ác tính, đồng thời ức chế hệ thống tiêu diệt và đàn áp khối u [50 – 53]. mRNA E6 và E7 mã hoá cho hai protein trên là gene biểu hiện sớm trong quá trình phát triển của virus. Do đó, dựa vào sự hiện diện và số bản sao của mRNA E6 mà người ta có thể xác định được diễn biến của bệnh ung thư cổ tử cung và nếu được phát hiện sớm, khả năng chữa khỏi bệnh hoàn toàn đến 95%. Còn nếu phát hiện ở giai đoạn cuối, tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ còn khoảng 5% [68].

Việc phát hiện sớm sự hiện diện và số lượng của các mRNA E6 trên các bệnh nhân nhiễm HPV type 16 ở Việt Nam là rất cần thiết, điều này giúp ích rất nhiều cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh ung thư cổ tử cung – một căn bệnh rất nguy hiểm cho phụ nữ. 1 Với những ý nghĩa trên, chúng tôi đã tiến hành “Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng sự biểu hiện mRNA E6 của Human papillomavirus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật Real – time RT - PCR”. Nội dung chính của đề tài bao gồm: ⮚ Thiết kế hệ primer và probe chuyên biệt cho gene E6 của virus HPV type 16. ⮚ Thiết lập quy trình Real – time RT PCR nhằm phát hiện và định lượng sự biểu hiện của mRNA E6.

⮚ Thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh phẩm Pap’smear đã xác định dương tính với HPV type 16. Đề tài này được thực hiện tại Công ty Cổ phần Thương mại Sản xuất và Dịch vụ Việt Á trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009. 2 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 I. ĐỊNH NGHĨA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG: Cổ tử cung (CTC) là phần hẹp, bên dưới tử cung và trên âm đạo.

Gồm hai phần: cổ ngoài và cổ trong. - Cổ ngoài: là các tế bào biểu mô lát giống tế bào biểu mô lát của âm đạo nhưng trơn láng hơn. - Cổ trong: là biểu mô tuyến gần giống như biểu mô của nội mạc tử cung. Chỗ tiếp giáp giữa biểu mô lát của cổ ngoài và biểu mô tuyến của cổ trong được gọi là lỗ cổ ngoài mô học.

Đây là vùng chuyển tiếp (transformation zone) của hai loại biểu mô. Các trường hợp ung thư CTC đều xuất phát từ vùng này [1, 2]. Hình 1: Cận cảnh cổ tử cung cho thấy sự phát triển của các tế bào bất thường trong bệnh ung thư CTC. TÁC NHÂN GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG: 1.

Tác nhân: Hầu hết các trường hợp bị bệnh ung thư CTC là do Human papillomavirus (HPV) gây ra. HPV thuộc giống Papillomavirus, họ Papovaviridae, không có vỏ bao, đường kính 50 - 55nm, capsid hình khối đa diện. HPV có bộ gene là chuỗi DNA xoắn kép, tồn tại dưới dạng vòng (hoặc episome), chỉ mã hoá cho sáu gene sớm (E) và hai gene muộn (L). 4 Bộ gene HPV có chiều dài khoảng 7906bp.

Trong đó, hai gene gây ung thư quan trọng nhất là E6 và E7 lần lượt có chiều dài khoảng 500bp và 300bp. HPV rất phổ biến và dễ lây nhiễm, nhất là theo đường tình dục [3 – 5]. Hình 2: Virus HPV Hình 3: Bộ gene HPV 2. Các type HPV: Hiện nay, người ta phát hiện có hơn 100 type HPV, mà sự khác nhau về bộ gene giữa các type chỉ khoảng 10% [6].

Dựa vào khả năng gây ung thư, chúng được chia thành hai loại: - Type nguy cơ cao (high – risk type): gồm các type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 55, 56, 59, 66, 68. Các type này có khả năng gây ung thư cao, thường liên quan đến loạn sản và ung thư CTC. - Type nguy cơ thấp (low – risk type): gồm các type 6, 11, 26, 42, 44, 54, 70, 73, ít có khả năng gây ung thư, chỉ gây ra các mụn cóc vùng sinh dục, hoặc các bất 5 thường tế bào CTC, hoặc có thể không biểu hiện triệu chứng bệnh trong kết quả lâm sàng [3]. Trong các type nguy cơ cao, hai type có liên quan đến khoảng 70% trường hợp mắc bệnh là HPV type 16 và HPV type 18 [7, 8].

Riêng HPV type 16 được nhận thấy là phổ biến nhất, chúng hiện diện trong khoảng 50% trường hợp bị bệnh ung thư CTC [9 – 12]. So sánh về mức độ nguy hiểm giữa các type, theo Giáo sư Anthony Gunnel (Viện Karolisnka, Stockhom), với những phụ nữ nhiễm HPV type 16 nồng độ cao, nguy cơ bị ung thư CTC tăng gấp 6 lần so với phụ nữ nhiễm HPV các type khác [71]. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử - hiện tượng chèn gene virus vào bộ gene người: Hiện nay, người ta vẫn chưa thể khẳng định việc chuyển biến từ nhiễm HPV sang ung thư CTC theo một cơ chế xác định nào. Nhưng với các nghiên cứu từ trước tới nay, quá trình xâm nhiễm và gây bệnh ung thư CTC của HPV type nguy cơ cao cũng có thể được mô tả khá đầy đủ và rõ nét.

CTC bình thường có một chỗ hẹp gọi là “vùng chuyển tiếp tế bào biểu mô trụ gai” (transformation zone). Sự xâm nhiễm HPV thường xảy ra ở vùng này nhất do chúng thích hợp với đặc tính biến đổi từ tế bào đáy thành tế bào gai của nó. Đầu tiên, HPV sẽ xâm nhiễm vào lớp tế bào đáy, nhân bản tạo ra các bản sao và thể bổ sung, đồng thời biểu hiện các gene sớm E1, E2, E4, E5, …. Hoạt động này được tiến hành tách biệt với bộ gene chủ trong nhân tế bào.

Các lớp tế bào đáy bị nhiễm virus tiếp tục chu trình biệt hoá biến đổi thành tế bào gai, lúc này hai gene muộn L1 và L2 mới được biểu hiện và tạo ra các phần còn lại của virus. Nhờ hoạt động tăng sinh liên tục để thay thế các tế bào già, chết, các virus HPV mới tạo thành sẽ được phóng thích ra ngoài [70]. 6 Hình 4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV trong tế bào chủ. Việc nhiễm các type HPV là điều kiện cần nhưng chưa đủ để gây ung thư CTC.

Sự kiện cho việc bắt đầu gây ra bệnh là hiện tượng chèn gene của các type HPV nguy cơ cao vào bộ gene người, dẫn đến rối loạn các chức năng tế bào. Hiện tượng này được phát hiện trong hơn 90% trường hợp ung thư CTC [13]. Ở trạng thái bình thường, bộ gene virus HPV tồn tại dưới dạng DNA plasmid, độc lập với nhân tế bào chủ, trong đó có hai gene gây ung thư quan trọng nhất là E6 và E7. Hai gene này chỉ biểu hiện khả năng gây ung thư khi được phiên mã thành mRNA, sau đó dịch mã thành protein.

Sở dĩ ở trạng thái bình thường, chúng không phiên mã sang mRNA theo hoạt động nhân bản của virus là do sự ức chế và kìm hãm của gene E2, nên chúng tồn tại độc lập theo bộ gene virus mà không ảnh hưởng đến bộ gene chủ nếu không có hiện tượng chèn gene xảy ra [65]. Việc tế bào bị nhiễm dai dẳng các type nguy cơ cao sẽ làm cấu trúc tế bào CTC bị rối loạn và chu trình tế bào bị xáo trộn. Đến một lúc nào đó, khi nhiễm sắc thể người bị mất ổn định, một số vị trí dễ gãy trên nhiễm sắc thể sẽ trở nên lỏng lẻo và yếu ớt, dưới một điều kiện thuận lợi nào đó, bộ gene virus HPV nguy cơ cao sẽ chèn vào các vị trí trên, gắn kết hai gene E6 và E7 vào bộ gene chủ. Từ đó chúng 7 được phiên mã thành mRNA rồi thành protein lên theo hoạt động tăng sinh của tế bào (Hình 4).

Khi gắn vào bộ gene chủ, hai oncogene E6 và E7 sẽ mất đi sự kiểm soát của gene E2, và biểu hiện rõ khả năng gây ung thư. Một vài nghiên cứu cho thấy, E6 và E7 có nhiệm vụ mã hoá cho hai protein làm ức chế hai hệ thống tiêu diệt và đàn áp khối u p53 và pRb. Việc bất hoạt hệ thống p53 sẽ dẫn đến hiện tượng bất tử hoá tế bào (do kích hoạt enzyme telomerase – có vai trò kéo dài đầu telomere của nhiễm sắc thể) và bất hoạt pRb sẽ làm cho tế bào tăng sinh liên tục, gây mất ổn định tế bào và chuyển thành ung thư CTC [65]. Hình 5: Diễn tiến của hiện tượng chèn gene E6 và E7 vào trong bộ gene chủ.

Khi các tế bào ung thư bắt đầu xâm lấn vào mô liên kết, có chiều hướ ng lan rộng dọc theo màng đáy được gọi là ung thư xâm lấn (invasive cancer). Ung thư CTC nếu tiến triển nặng có thể di căn sang bụng, phổi và một số nơi khác. Trước khi chuyển biến thành ung thư, từ giai đoạn nhiễm HPV type nguy cơ cao tế bào còn phải trải qua các giai đoạn thương tổn trong tế bào biểu mô CTC 8 (CIN). Tuỳ mức độ nặng nhẹ mà người ta chia CIN thành ba loại: CIN I, CIN II và CIN III, trong đó CIN III là thương tổn nặng nhất.

Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng, hiện tượng chèn gene của HPV chỉ xảy ra ở trường hợp bị CIN II, III và ung thư CTC, còn CIN I chỉ hiện diện DNA virus dưới dạng episome [62].