Thiết lập quy trình Real-time PCR phát hiện đậu phộng dị ứng trong thực phẩm

Khóa luận trình bày quy trình Real-time PCR phát hiện đậu phộng gây dị ứng. Giải pháp kiểm nghiệm an toàn thực phẩm hiệu quả trong sản xuất công nghiệp.

• Tác giả: Hà Thị Phương Trinh
• Người hướng dẫn: ThS. Lao Đức Thuận
• Trường học: Đại học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Thiết lập quy trình Real-time PCR phát hiện đậu phộng gây dị ứng trong các nguyên liệu sản xuất thực phẩm thương mại.
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Real time PCR phát hiện đậu phộng dị ứng

Real-time PCR (qPCR) là công nghệ tiên tiến trong phát hiện protein đậu phộng gây dị ứng. Phương pháp này sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để xác định sự hiện diện của đậu phộng trong thực phẩm một cách chính xác và nhanh chóng. Real-time PCR phát hiện đậu phộng đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là đối với các sản phẩm có nguy cơ nhiễm chéo. Công nghệ này giúp bảo vệ sức khỏe của những người dị ứng đậu phộng bằng cách phát hiện thành phần này ở mức độ cực thấp.

1.1. Khái niệm và nguyên lý hoạt động

Real-time PCR là kỹ thuật khuếch đại DNA với khả năng theo dõi quá trình phản ứng theo thời gian thực. Phương pháp này dựa trên nguyên lý huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR. Khi DNA đậu phộng được khuếch đại, tín hiệu huỳnh quang tăng theo từng chu kỳ, giúp định lượng chính xác hàm lượng chất gây dị ứng trong mẫu phân tích.

1.2. Tầm quan trọng trong kiểm soát chất lượng

Phát hiện đậu phộng dị ứng bằng Real-time PCR đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Phương pháp này có độ nhạy cao, có thể phát hiện các dấu vết đậu phộng ở mức độ ppb (phần triệu tỷ). Điều này rất quan trọng đối với người dị ứng, vì ngay cả một lượng nhỏ đậu phộng cũng có thể gây phản ứng nguy hiểm.

II. Quy trình chuẩn bị mẫu và trích chiết DNA

Giai đoạn chuẩn bị mẫu là bước tiền xử lý quan trọng để đảm bảo kết quả chính xác. Mẫu thực phẩm chứa đậu phộng phải được xử lý theo quy trình chuẩn. Trích chiết DNA từ mẫu yêu cầu sử dụng các chất hóa học đặc biệt để phá vỡ tế bào và giải phóng axit nucleic. Quá trình này cần được tiến hành trong điều kiện vô trùng để tránh nhiễm bẩn. Sau trích chiết, DNA được tinh sạch bằng các phương pháp chuyên dụng trước khi tiến hành khuếch đại.

2.1. Quy trình lấy mẫu và bảo quản

Lấy mẫu đại diện từ các vị trí khác nhau của sản phẩm thực phẩm. Mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ phù hợp, thường là -20°C hoặc -80°C. Thời gian bảo quản không vượt quá hạn định để tránh degradation của DNA. Ghi chép chi tiết thông tin mẫu bao gồm nguồn gốc, ngày lấy mẫu, và điều kiện bảo quản.

2.2. Phương pháp trích chiết DNA hiệu quả

Sử dụng bộ trích chiết DNA chuyên dụng hoặc phương pháp hóa học thông dụng. Quá trình bao gồm: lysis mẫu, loại bỏ protein, và s沉tủa DNA. DNA được hòa tan trong buffer để giữ ổn định. Kiểm tra chất lượng DNA bằng đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA phải đạt tiêu chuẩn trước khi tiến hành Real-time PCR.

III. Thiết lập và thực hiện Real time PCR

Thiết lập phản ứng Real-time PCR đòi hỏi các thành phần chính bao gồm primer đặc hiệu cho đậu phộng, DNA polymerase, và chất báo hiệu huỳnh quang. Primer được thiết kế để nhận diện các gen đặc trưng của đậu phộng với độ đặc hiệu cao. Quá trình khuếch đại diễn ra qua các vòng lặp nhiệt độ: biến tính, ghép mồi, và kéo dài. Theo dõi tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ để xác định ngưỡng chu kỳ (Ct) - giá trị quan trọng nhất của phương pháp này.

3.1. Lựa chọn primer và thiết kế phản ứng

Primer phải được thiết kế đặc hiệu cho các gen mã hóa protein Ara h (allergen chính của đậu phộng). Sử dụng phần mềm BLAST để kiểm tra độ đặc hiệu. Thực hiện các thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ primer, MgCl2, và template DNA. Kiểm tra hiệu suất primer bằng phản ứng Real-time PCR thử nghiệm. Đảm bảo không có dị vị hoặc primer dimer.

3.2. Điều kiện phản ứng tối ưu

Nhiệt độ biến tính: 94-95°C, 3-5 phút. Nhiệt độ ghép mồi: 50-65°C tùy thuộc primer (30-60 giây). Nhiệt độ kéo dài: 72°C (1-2 phút). Số chu kỳ: 35-45 vòng. Sử dụng qPCR master mix chứa SYBR Green hoặc TaqMan probe. Chạy đối chứng dương (DNA đậu phộng tinh khiết) và âm (không DNA) trong mỗi thí nghiệm.

IV. Phân tích kết quả và diễn giải dữ liệu

Phân tích kết quả Real-time PCR dựa vào giá trị Ct (cycle threshold) - số chu kỳ cần thiết để tín hiệu vượt ngưỡng배景. Ct thấp hơn cho thấy hàm lượng DNA đậu phộng cao hơn. Tạo đường cron tham khảo sử dụng các mẫu đậu phộng tiêu chuẩn với nồng độ xác định. Mẫu có Ct trong khoảng đối chứng được xác định là dương tính (chứa đậu phộng). Kết quả được thể hiện bằng tỷ lệ phần trăm hoặc ppm (parts per million).

4.1. Giải thích giá trị Ct và định lượng

Ct nhỏ (<20): hàm lượng DNA cao, dương tính mạnh. Ct trung bình (20-30): hàm lượng DNA vừa phải. Ct lớn (>30): hàm lượng DNA thấp, gần mức phát hiện. Ct >35: có thể âm tính hoặc dương tính yếu. Dựa vào đường cron, tính toán nồng độ mẫu chưa biết. Báo cáo kết quả với độ không chắc chắn đo lường (khoảng tin cậy 95%).

4.2. Kiểm định chất lượng và độ tin cậy

Kiểm tra hiệu suất amplification (E) phải từ 90-110%. Độ lặp lại được đánh giá bằng hệ số biến thiên (CV) <5%. R² của đường cron chuẩn phải >0.99. Xác nhận kết quả bằng điện di gel hoặc sequencing. So sánh với phương pháp khác (ELISA) để xác minh. Lưu giữ toàn bộ dữ liệu thô cho lần kiểm tra lại nếu cần.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Dị ứng với thực phẩm hiện đang là một trong những vấn đề dinh dưỡng cấp thiết, bởi tất cả các thực phẩm có chứa protein đều có thể là tác nhân gây dị ứng. Dị ứng thực phẩm thường gặp nhất là type I do immunoglobulin E xúc tác phản ứng mẫn cảm. Biểu hiện lâm sàng của dị ứng thực phẩm khá đa dạng, từ nổi mày đay, ngứa ran, đau bụng, khó thở cho tới sốc phản vệ và có thể dẫn tới tử vong nếu không được cấp cứu kịp thời. Đặc biệt, đậu phộng là một vấn đề nghiêm trọng đối với các bệnh nhân dị ứng vì hai lý do: đầu tiên, một phần ba của tất cả các phản ứng dị ứng nghiêm trọng xuất hiện ở bệnh nhân dị ứng đậu phộng, thứ hai, lượng đậu phộng rất thấp cũng có thể kích hoạt các phản ứng dị ứng.

Trong những nghiên cứu này, khoảng 1 mg protein đậu phộng là đủ để xuất hiện các phản ứng nhẹ ở người dị ứng đậu phộng. Các dấu hiệu của việc dị ứng đậu phộng rất đa dạng: nổi mề đay ở da, da bị ửng đỏ và sưng tấy; đường hô hấp có hiện tượng khó thở, thở khò khè; bụng chướng đau, tiêu chảy hoặc nôn mửa; nặng hơn, dị ứng đậu phộng có khả năng khiến người bệnh tụt huyết áp, nhịp tim không đều hoặc thậm chí ngừng đập. Đậu phộng chứa nhiều protein khác nhau, mỗi loại có cấu trúc riêng biệt của nó. Một số protein trong số này gây dị ứng, có khả năng kích hoạt các kháng thể IgE.

Các protein gây dị ứng đậu phộng cụ thể như: Ara H1, Ara H2, Ara H3, Ara H4, Ara H5, Ara H6, Ara H7, Ara 8, Ara Agglutinin, Ara HLTP, Ara Holeosin, Ara HT1. Trong đó, Ara H2 đã được công nhận là chất gây dị ứng mạnh trong tất cả các xét nghiệm về việc kích hoạt triệu chứng gây dị ứng và nó gây ra một phản ứng dị ứng ở nồng độ rất thấp, trong khi Ara H1 và Ara H3 thì gây phản ứng dị ứng ở mức độ yếu hơn và phản ứng chỉ xảy ra ở nồng độ cao hơn nhiều lần Ara H2 (Koppelman et al. Trong nghiên cứu của Hird và cộng sự (2003), nhóm tác giả đã chỉ ra rằng, gen Ara H2 mã hóa cho protein Ara H2 và dễ dàng được tìm thấy trong đậu phộng. Cho đến nay, cách duy nhất để người tiêu dùng bị dị ứng đậu phộng tránh các phản ứng dị ứng là tránh sử dụng các loại thực phẩm chứa đậu phộng một cách nghiêm ngặt.

Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy rằng việc vô tình ăn phải thực phẩm chứa đậu phộng hoặc các chất gây dị ứng trong thực phẩm vẫn rất phổ biến. Sự nhiễm 1 các chất gây dị ứng ẩn có thể xảy ra do quá trình làm sạch thiết bị sản xuất không đạt, do sử dụng nguyên liệu nhiễm bẩn hoặc do nhãn không được ghi đầy đủ và chính xác. Đặc biệt, theo số liệu thống kê từ Tổng cục hải quan cho biết, kim ngạch xuất khẩu bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam từ đầu năm đến hết tháng 7/2018 đạt 359,4 triệu USD. Bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam được xuất khẩu chủ yếu sang các thị trường Trung Quốc, Mỹ, Hàn Quốc, Đức, Úc,.

Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích để phát hiện các chất gây dị ứng là cần thiết để giám sát việc thực hiện dán nhãn trên các sản phẩm theo đúng yêu cầu được quy định, nhằm bảo vệ người tiêu dùng khỏi các chất gây dị ứng ẩn và hỗ trợ các nhà sản xuất thiết lập các khái niệm về hệ thống Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCPs), kiểm soát các nguy cơ nhiễm. Đối với việc phát hiện sự có mặt đậu phộng, các nghiên cứu gần đây đã phát triển phương pháp real-time PCR, là một phương pháp có thể áp dụng cho mục đích định lượng. Ưu điểm chính của việc sử dụng real-time PCR cho mục đích này là độ đặc hiệu cao, có thể được sử dụng là phương pháp bán định lượng để phát hiện sự hiện diện của đậu phộng. Do đó, khảo sát và xây dựng quy trình phát hiện các chất gây dị ứng ở đậu phộng bằng kỹ thuật realtime-PCR là cần thiết.

Hiện nay, chưa thấy các nghiên cứu được công bố về việc phát triển các phương pháp phân tích để phát hiện đậu phộng ở Việt Nam. Vì vậy, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN ĐẬU PHỘNG GÂY DỊ ỨNG TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM THƯƠNG MẠI.” được thực hiện dựa trên nền tảng kế thừa những nghiên cứu trước, nhằm xây dựng và phát triển một phương pháp phát hiện đậu phộng trong các sản phẩm thực phẩm thương mại, gây ảnh hưởng đến bệnh nhân dị ứng đậu phộng.1 TỔNG QUAN VỀ ĐẬU PHỘNG 1.1 Phân loại khoa học Tên khoa học: Arachis hypogaea L. Giới (Regume): Plantae Bộ (ordo): Fabales Họ (Familia): Fabaceae Phân họ (subfamilia): Faboideae Tông (tribus): Aeschynomeneae Chi (Genus): Arachis Loài (Species): Arachis hypogaea 1.2 Nguồn gốc, phân bố và công dụng của đậu phộng 1.1 Nguồn gốc, phân bố Đậu phộng hay còn gọi là lạc, là cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Nam Mỹ (phía nam Bolivia / phía tây bắc Argentina, được phát hiện lần đầu tiên vào khoảng năm 1000 TCN. Đậu phộng được trồng phổ biến sang châu Phi, châu Á, châu Âu và quần đảo Thái Bình Dương khoảng vào thế kỷ 16 và 17 với các chuyến đi khám phá của Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Anh và Hà Lan (Krapovickas, 1969, 1973; Gregort và cộng sự, 1980, 1982; Isleib và cộng sự, 1994).

Cây đậu phộng được biết đến ở Trung Quốc và các nước ở Tây Thái Bình Dương như Indonesia, Madagascar nhờ thương nhân người Bồ Đào Nha vào thế kỷ 17 và một loạt các nhà truyền giáo người Mỹ trong thế kỷ 19 và sau đó lan rộng khắp châu Á [1]. Ở Việt Nam, lịch sử trồng cây đậu phộng chưa được xác minh rõ ràng, theo kỹ sư Hồ Đình Hải, đậu phộng từ Trung Quốc có thể du nhập vào nước ta khoảng thế kỷ 17-18. Ngày nay, đậu phộng được trồng ở 108 quốc gia với khoảng 22,2 triệu ha. Trong đó có 13,69 triệu ha là ở châu Á (Ấn Độ 8 triệu ha; Trung Quốc 3,84 triệu ha), 7,39 triệu ha ở châu Phi, vùng cận Sahara và 0,7 triệu ha ở Trung và Nam Mỹ.

Sản lượng trung bình trên quy mô toàn cầu tăng nhẹ từ 1,08 Mt ha-1 trong những năm 1980 lên 1,15 Mt ha-1 vào những năm 1990 (Carley và Fletcher, 1995), và sản lượng toàn cầu là 29 triệu tấn quả. Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO), Ấn Độ, Trung Quốc và Hoa 4 Kỳ là những nước đứng đầu về sản xuất và trồng trọt đậu phộng, chiếm khoảng 70% diện tích trồng của thế giới (FAO, 1995-2001) [1].2 Công dụng Công dụng của đậu phộng rất đa dạng, tất cả các bộ phận của cây đều có thể được sử dụng. Hạt đậu phộng có thể dùng làm thực phẩm trực tiếp khi luộc hoặc rang, ngoài ra được sử dụng trong các loại món ăn, bánh kẹo nhờ vị thơm và béo của hạt. Dầu từ đậu phộng không chỉ được sử dụng cho nấu ăn, sản xuất bơ thực vật,.

mà còn được sử dụng trong công nghiệp như sản xuất các loại xà phòng trong dân dụng và y tế, là nguồn nhiên liệu cho các động cơ diesel. Đậu phộng sau khi ép dầu, phần bã hay còn gọi là bánh dầu vẫn còn chứa một phần chất béo và protein rất cao, được dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc. Lá và thân cây động phộng giàu nguồn protein và hydrate carbon nên được dùng làm thức ăn tươi hoặc ủ chua cho động vật nhai lại rất tốt. Phần vỏ của hạt có thể được sử dụng làm nhiên liệu đốt, làm chất độn cho đất, như một nguồn hóa chất hữu cơ thô.

Cây đậu phộng có chứa các vi khuẩn cộng sinh tên là Rhizobia, nằm trong các nốt sần của rễ, có khả năng cố định đạm, cung cấp trực tiếp lượng đạm cho cây vừa có tác dụng bổ sung lượng đạm cho vi sinh vật đất (Hồ Đình Hải, 2014). Các bộ phận từ cây đậu phộng được sử dụng trong cả Đông Y và Tây Y. Theo đông y, hạt đậu phộng có vị ngọt, béo và bùi, có tác dụng bổ tỳ, dưỡng vị, nhuận phế, lợi tràng, tiêu đờm, điều hòa khí huyết, tiêu sưng, cầm máu, lợi tiểu, tăng tiết sữa, mát họng, giảm cholesterol, chống lão hóa. Theo các nghiên cứu của y học hiện đại, dược tính từ các bộ phận của đậu phộng như acid folic, mangan, amino acid trytophan, vitamin B3,.

có khả năng giảm nguy cơ sinh con dị tật, ổn định đường huyết, ngăn ngừa sỏi mật, phòng chống trầm cảm, tăng cường trí nhớ, giảm cholesterol, bảo vệ tim mạch,. Tuy nhiên, cũng có một số cảnh báo nguy hiểm đối với người sử dụng đậu phộng. Độc tố aflatioxin sinh ra khi đậu phộng nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm trực tiếp và là chất gây ung thư. Ngoài ra, hệ miễn dịch của cơ thể một số người có phản ứng quá mẫn đối với 5 các protein chứa trong đậu phộng, gây nên các triệu chứng thể chất nghiêm trọng,.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY ĐẬU PHỘNG 1.1 Đặc điểm Đậu phộng là cây thân thảo, thân có thể là thân đứng hoặc thân bò.

Chiều cao thân khoảng 30-40 cm. Thân mọc thẳng, thân non hình tròn, nhưng phần thân mang cành là thân rỗng khi cây ra hoa. Thân có 15 - 25 đốt, phần thân gần gốc có đốt ngắn, phần giữa và phía trên thân đốt dài hơn. Thân thường có màu xanh hoặc đỏ tím, có lông tơ.1 Cây đậu phộng [2] Đậu phộng là cây hai lá mầm.

Lá mọc xen kẽ, là loại lá kép hình lông chim với bốn lá chét, kích thước lá chét dài 18-40 mm và rộng 15-25 mm. Lá thường hình bầu dục dài hoặc hình trứng lộn ngược. Hoa lưỡng tính, thường mọc thành chùm, có 6-7 cái. Hoa màu vàng hoặc trắng, cuống hoa dài 2-4 cm, gồm 5 bộ phận: lá bắc, lá đài, tràng hoa, nhị đực, 6 nhụy cái.

Sau khi thụ phấn, tia củ phát triển dài ra và chui xuống đất, dài 3-7 cm. Tia củ ở trên không có màu tím, sau khi xuống đất có màu trắng. Tia củ do mô phân sinh ở gốc bầu hoa hình thành, sau khi thụ tinh, tia củ phát triển đẩy bầu hoa xuống đất. Lúc này, quả bắt đầu hình thành và phát triển ở độ sâu 2-7 cm dưới mặt đất.

Tia củ có cấu tạo như lông hút, nhờ vậy có thể hút được các chất dinh dưỡng như rễ. Quả bao gồm vỏ hạt và 1-4 hạt.