Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cam thảo bắc glycyrrhiza glabra l từ hạt

Cam thảo bắc (Glycyrrhiza glabra L.) là cây dược liệu quý, được sử dụng rộng rãi… 56 trang · Trung Tâm Ươm Tạo Doanh Nghiệp Nông Nghiệp Công Nghệ Cao · 2017.

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Ánh
• Trường học: Trung Tâm Ươm Tạo Doanh Nghiệp Nông Nghiệp Công Nghệ Cao
• Chuyên ngành: Sinh Thái Học
• Đề tài: Quy Trình Nhân Giống In Vitro Cây Cam Thảo Bắc Từ Hạt
• Loại tài liệu: Báo Cáo Nghiệm Thu Nhiệm Vụ Khoa Học Công Nghệ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• MỤC LỤC
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• THÔNG TIN CHUNG
• PHẦN MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về cây Cam thảo bắc
• 1.2. Thành phần hóa học của Cam thảo bắc
• 1.3. Tác dụng dược lý của cây Cam thảo bắc
• 1.4. Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây Cam thảo bắc
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.1.1. Nghiên cứu tạo mẫu in vitro cây Cam thảo bắc từ hạt
• 2.1.2. Khảo sát môi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cam thảo bắc in vitro
• 2.1.3. Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cam thảo bắc in vitro
• 2.1.4. Nghiên cứu tái sinh cây Cam thảo bắc in vitro từ chồi
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu tạo mẫu in vitro cây Cam thảo bắc từ hạt
• 3.2. Khảo sát môi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cam thảo bắc in vitro bằng đoạn thân mang chồi ngủ cắt từ cây con in vitro
• 3.3. Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cam thảo bắc in vitro
• 3.3.1. Đánh giá ảnh hưởng của sự kết hợp 2 chất điều hòa tăng trưởng BA và NAA đến khả năng nhân nhanh của chồi Cam thảo bắc
• 3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của sự kết hợp 2 chất điều hòa tăng trưởng BA và IBA đến khả năng nhân nhanh của chồi Cam thảo bắc
• 3.4. Nghiên cứu tái sinh cây Cam thảo bắc in vitro từ chồi
• 3.4.1. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Cam thảo bắc
• 3.4.2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Cam thảo bắc
• 3.5. Chi phí sản xuất cây giống in vitro
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan về Quy Trình Nhân Giống In Vitro Cam Thảo Bắc

Cam thảo bắc (Glycyrrhiza glabra L.) là cây dược liệu quý, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và hiện đại. Nhu cầu về cam thảo bắc ngày càng tăng, trong khi nguồn cung từ tự nhiên và phương pháp trồng truyền thống còn hạn chế. Vì vậy, nhân giống in vitro cam thảo bắc từ hạt là giải pháp tiềm năng để sản xuất giống quy mô lớn, đồng đều và sạch bệnh. Nhân giống vô tính cam thảo bắc giúp khắc phục những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống như thời gian sinh trưởng dài và chất lượng không ổn định của hạt giống. Kỹ thuật này hứa hẹn mang lại hiệu quả kinh tế cao và góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm của cây dược liệu này. Theo báo cáo nghiệm thu, quy trình nhân giống in vitro giúp tạo ra cây con đồng đều, sạch bệnh và có hệ số nhân giống cao. Do đó, cần có cái nhìn tổng quan về quy trình này để tối ưu hóa hiệu quả.

1.1. Tầm Quan Trọng của Nhân Giống In Vitro Cam Thảo Bắc

Nhân giống in vitro, hay nuôi cấy mô cam thảo bắc, đóng vai trò then chốt trong việc đáp ứng nhu cầu thị trường ngày càng tăng. Phương pháp này cho phép sản xuất giống cam thảo bắc nhanh chóng, với số lượng lớn và chất lượng đồng đều. Đặc biệt, kỹ thuật nhân giống in vitro giúp bảo tồn nguồn gen quý của cam thảo bắc, đồng thời cung cấp cây giống sạch bệnh, khắc phục các vấn đề tồn tại trong nhân giống truyền thống. Cây giống in vitro có khả năng thích nghi tốt hơn với điều kiện môi trường, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cho người trồng.

1.2. Ưu Điểm Nổi Bật của Phương Pháp Nhân Giống In Vitro

Nhân giống in vitro cam thảo bắc từ hạt mang lại nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. Đầu tiên, hệ số nhân giống cao, cho phép sản xuất hàng loạt cây con trong thời gian ngắn. Thứ hai, cây giống được tạo ra đồng đều về mặt di truyền và hình thái. Thứ ba, quy trình được thực hiện trong điều kiện vô trùng, đảm bảo cây giống sạch bệnh. Cuối cùng, ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống cam thảo giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên, tăng tính ổn định của nguồn cung.

II. Vấn Đề Thách Thức Khi Nhân Giống Cam Thảo Bắc Từ Hạt

Mặc dù có nhiều ưu điểm, quy trình nhân giống in vitro cam thảo bắc từ hạt cũng đối mặt với không ít thách thức. Tỷ lệ nảy mầm của hạt giống cam thảo bắc tự nhiên thường thấp và không đồng đều. Quá trình khử trùng hạt để loại bỏ vi sinh vật gây hại có thể ảnh hưởng đến khả năng sống sót của phôi. Việc lựa chọn và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy phù hợp cho từng giai đoạn phát triển của cây là yếu tố then chốt quyết định thành công của quy trình. Bên cạnh đó, chi phí phòng thí nghiệm nhân giống in vitro và kỹ thuật phức tạp đòi hỏi đội ngũ kỹ thuật viên lành nghề cũng là những rào cản cần vượt qua.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Chọn Lọc Hạt Giống Chất Lượng

Việc lựa chọn hạt giống cam thảo bắc chất lượng cao là bước quan trọng đầu tiên. Tuy nhiên, chất lượng hạt giống trên thị trường hiện tại không đồng đều, gây khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng cây con. Theo báo cáo, chất lượng hạt giống không đồng đều là một trong những nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ nảy mầm thấp và sự phát triển không đồng đều của cây con. Do đó, cần có quy trình kiểm định chất lượng hạt giống chặt chẽ trước khi đưa vào nuôi cấy mô cam thảo bắc.

2.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Khử Trùng Hạt Cam Thảo Bắc

Khử trùng hạt là bước thiết yếu để loại bỏ các tác nhân gây bệnh, nhưng quá trình này cũng có thể gây tổn thương cho phôi. Việc sử dụng nồng độ và thời gian khử trùng không phù hợp có thể làm giảm độ nảy mầm của hạt cam thảo bắc. Cần phải tối ưu hóa quy trình khử trùng để đảm bảo loại bỏ hiệu quả các vi sinh vật gây hại mà không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm và phát triển của hạt.

2.3. Xác Định Đúng Điều kiện nuôi cấy in vitro cam thảo

Việc xác định đúng điều kiện nuôi cấy đòi hỏi nhiều thí nghiệm và điều chỉnh. Các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, và thành phần môi trường phải được kiểm soát chặt chẽ. Việc nuôi cấy mô tế bào thực vật đòi hỏi sự chính xác và cẩn thận để đảm bảo sự phát triển khỏe mạnh của cây con.

III. Cách Tạo Mẫu In Vitro Cam Thảo Bắc Từ Hạt Hiệu Quả

Để tạo mẫu in vitro hiệu quả, cần tuân thủ quy trình nghiêm ngặt từ khâu chuẩn bị đến gieo cấy. Đầu tiên, hạt giống được xử lý và khử trùng cẩn thận. Sau đó, hạt được gieo trên môi trường dinh dưỡng phù hợp, thường là môi trường MS (Murashige & Skoog) có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng. Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao và sự phát triển khỏe mạnh của cây con. Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng trong việc thiết lập quần thể cây cam thảo bắc sạch bệnh và đồng đều.

3.1. Chuẩn Bị và Xử Lý Hạt Giống Cam Thảo Bắc

Hạt giống sau khi được chọn lọc cần được ngâm trong nước ấm (khoảng 30°C) trong 24 giờ để kích thích quá trình nảy mầm. Sau đó, hạt được khử trùng bằng dung dịch Sodium hypochlorite (Javel) 2,5% trong thời gian thích hợp (ví dụ, 10-15 phút) để loại bỏ các vi sinh vật gây hại. Theo tài liệu gốc, thời gian khử trùng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng nảy mầm của hạt. Sau khi khử trùng, hạt được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng trước khi gieo cấy.

3.2. Môi Trường và Điều Kiện Gieo Cấy Thích Hợp

Môi trường MS là lựa chọn phổ biến cho nuôi cấy in vitro. Môi trường này thường được bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng như BAP (Benzylaminopurine) để kích thích sự phát triển của chồi. Điều kiện ánh sáng (16 giờ sáng/8 giờ tối), nhiệt độ (25-28°C) và độ ẩm (60-70%) cần được duy trì ổn định trong suốt quá trình ươm hạt cam thảo bắc. Cần chú ý thay đổi môi trường định kỳ để cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho cây con.

IV. Phương Pháp Nhân Nhanh Cụm Chồi Cam Thảo Bắc In Vitro

Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi là bước quan trọng để tăng số lượng cây giống. Chồi từ cây con in vitro được cắt và cấy vào môi trường nhân nhanh, thường là môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như BA (Benzyladenine) và NAA (α-Naphthaleneacetic acid). Tỷ lệ BA/NAA trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến khả năng nhân nhanh của chồi. Cần tối ưu hóa nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng để đạt được hệ số nhân chồi cao nhất. Trong quá trình này, việc kiểm soát điều kiện vô trùng là yếu tố then chốt để tránh nhiễm bệnh và đảm bảo sự phát triển khỏe mạnh của chồi.

4.1. Ảnh Hưởng của BA và NAA Đến Khả Năng Nhân Chồi

Nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa BA và NAA có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng nhân nhanh của chồi. BA có tác dụng kích thích sự phát triển của chồi, trong khi NAA thúc đẩy sự hình thành rễ. Tỷ lệ BA/NAA tối ưu phụ thuộc vào giống và điều kiện nuôi cấy. Theo tài liệu, môi trường bổ sung BA ở nồng độ cao (ví dụ, 2 mg/L) và NAA ở nồng độ thấp (ví dụ, 0,5 mg/L) thường cho kết quả tốt nhất.

4.2. Tối Ưu Hóa Môi Trường Nhân Nhanh Cụm Chồi

Ngoài BA và NAA, các yếu tố khác như nồng độ muối khoáng, vitamin và đường trong môi trường cũng ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh của chồi. Cần tiến hành các thí nghiệm để xác định môi trường tối ưu cho từng giống cam thảo bắc. Việc điều chỉnh pH của môi trường (khoảng 5,8) và bổ sung các chất chống oxy hóa cũng có thể cải thiện hiệu quả nhân nhanh.

V. Hướng Dẫn Tái Sinh Cây Cam Thảo Bắc In Vitro Từ Chồi

Sau khi nhân nhanh đủ số lượng chồi, giai đoạn tiếp theo là tái sinh cây hoàn chỉnh. Chồi được chuyển sang môi trường tạo rễ, thường là môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như IBA (Indole-3-butyric acid) hoặc NAA. IBA thường được ưu tiên sử dụng vì ít gây hiện tượng callus (mô sẹo) hơn NAA. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ cần được điều chỉnh để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của rễ. Khi cây con đã có hệ rễ khỏe mạnh, chúng có thể được chuyển sang giai đoạn huấn luyện để thích nghi với điều kiện ngoại cảnh.

5.1. Ảnh Hưởng của IBA Đến Khả Năng Tạo Rễ

IBA là chất điều hòa sinh trưởng phổ biến được sử dụng để kích thích sự hình thành rễ trong nuôi cấy mô. Nồng độ IBA tối ưu thường nằm trong khoảng 0,5-1 mg/L. Theo tài liệu gốc, IBA cho thấy hiệu quả tạo rễ tốt hơn so với NAA, đồng thời giảm thiểu sự hình thành callus. Thời gian tiếp xúc của chồi với IBA cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng rễ.

5.2. Quy Trình Huấn Luyện Cây Con In Vitro

Sau khi có hệ rễ khỏe mạnh, cây con cần được huấn luyện để thích nghi với điều kiện ngoại cảnh. Cây được chuyển sang giá thể vô trùng (ví dụ, xơ dừa, tro trấu) và đặt trong điều kiện ẩm độ cao (80-90%) trong vài tuần. Ánh sáng cần được điều chỉnh từ từ để tránh gây sốc cho cây. Sau giai đoạn huấn luyện, cây con có thể được trồng trong vườn ươm hoặc trực tiếp trên đồng ruộng.

VI. Ứng Dụng Triển Vọng Nhân Giống In Vitro Cam Thảo Bắc

Quy trình nhân giống in vitro cam thảo bắc từ hạt có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp và công nghiệp dược phẩm. Phương pháp này giúp cung cấp nguồn cây giống chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh cho người trồng. Đồng thời, nhân giống in vitro còn góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm của cam thảo bắc và giảm thiểu áp lực khai thác từ tự nhiên. Trong tương lai, có thể kết hợp kỹ thuật nhân giống in vitro với các phương pháp chọn giống tiên tiến để tạo ra những giống cam thảo bắc có năng suất và chất lượng cao hơn. Việc nghiên cứu và phát triển các quy trình nhân giống in vitro hiệu quả sẽ đóng góp quan trọng vào sự phát triển bền vững của ngành cây dược liệu Việt Nam.

6.1. Tiềm Năng Thương Mại Hóa Cây Giống In Vitro

Thị trường cây giống cam thảo bắc chất lượng cao còn nhiều tiềm năng phát triển. Cây giống in vitro có ưu thế vượt trội so với cây giống truyền thống về chất lượng và độ đồng đều. Việc xây dựng các vườn ươm chuyên sản xuất cây giống in vitro sẽ đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường và mang lại lợi nhuận cao cho nhà đầu tư.

6.2. Nghiên Cứu và Phát Triển Các Giống Cam Thảo Bắc Mới

Kỹ thuật nhân giống in vitro có thể được kết hợp với các phương pháp chọn giống tiên tiến (ví dụ, chọn giống bằng marker, kỹ thuật chuyển gen) để tạo ra các giống cam thảo bắc có năng suất và chất lượng cao hơn. Việc nghiên cứu và phát triển các giống mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả kinh tế cho người trồng và đáp ứng nhu cầu đa dạng của thị trường.

Nội dung chính

QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CAM THẢO BẮC (Glycyrrhiza glabra L.) TỪ HẠT: GIẢI PHÁP ĐỘT PHÁ CHO NGUỒN DƯỢC LIỆU SẠCH

---

Tóm tắt nghiên cứu (200-250 từ)

Cam thảo bắc (Glycyrrhiza glabra L.) là dược liệu quý với thành phần chính là Glycyrrhizin cùng nhiều dẫn xuất flavonoid quý giá, giữ vai trò thiết yếu trong y học cổ truyền và công nghiệp dược hiện đại. Tuy nhiên, các phương pháp nhân giống truyền thống bằng hạt hay giâm hom bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng: tỷ lệ nảy mầm thấp, chất lượng hạt không đồng đều, cây con dễ thoái hóa và chu kỳ thu hoạch kéo dài tới 5 năm.

Nghiên cứu này giải quyết câu hỏi trọng tâm: Làm thế nào để xây dựng một quy trình vi nhân giống (micropropagation) in vitro hoàn chỉnh cây Cam thảo bắc từ hạt với hệ số nhân cao, cây giống đồng nhất và sạch bệnh?

Bằng việc ứng dụng môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS) kết hợp tối ưu hóa các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Cytokinin và Auxin), nhóm nghiên cứu tại Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM đã thiết lập thành công quy trình 4 giai đoạn khép kín:

1. Khử trùng hạt bằng dung dịch NaOCl 2,5% trong 15 phút (tỷ lệ nảy mầm tối ưu đạt 31,3%);
2. Cảm ứng tạo chồi từ đoạn thân mang chồi ngủ trên môi trường MS + 1,0 mg/L BA (tỷ lệ bật chồi 86,67%, số chồi trung bình 5,43 chồi/cụm);
3. Nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS + 2,0 mg/L BA + 0,25 mg/L NAA (hệ số nhân chồi vượt trội 8,2 lần, tỷ lệ tạo cụm 73,33%);
4. Tái sinh rễ hoàn chỉnh trên môi trường MS + 1,5 mg/L IBA (tỷ lệ ra rễ 86,25%, trung bình 3,5 rễ/cây, cây cao 4,7 cm sau 14 ngày).

Quy trình tạo ra cây giống in vitro chất lượng cao, đồng đều, sinh trưởng khỏe mạnh, đồng thời cung cấp mô hình tính toán chi phí sản xuất thương mại với giá thành hợp lý (~1.900 VNĐ/cây in vitro), mở ra tiềm năng tự chủ nguồn dược liệu tại Việt Nam.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng (300-350 từ)

Thực trạng dược liệu và nhu cầu thị trường

Cam thảo bắc (Glycyrrhiza glabra L., họ Đậu - Fabaceae) từ lâu đã được mệnh danh là "quốc lão" trong Đông y nhờ khả năng dẫn thuốc, giải độc, kháng viêm, bảo vệ niêm mạc dạ dày và điều hòa miễn dịch. Hợp chất saponin chính là Glycyrrhizin (chiếm 10–14% trọng lượng khô rễ, ngọt gấp 60 lần đường mía) cùng hơn 27 dẫn xuất flavonoid (như liquiritin, isoliquiritin, glabridin) là nguyên liệu không thể thay thế trong nhiều chế phẩm trị ho, loét dạ dày, kháng virus và mỹ phẩm dưỡng da.

Tại Việt Nam, hầu hết nguồn dược liệu Cam thảo bắc thương phẩm đều phải nhập khẩu từ Trung Quốc và Châu Âu với giá thị trường dao động quanh mức 200.000 VNĐ/kg rễ khô. Mặc dù cây có khả năng thích nghi tốt với khí hậu mát mẻ (18–20°C) và không kén đất, phù hợp với các vùng sinh thái đồi núi phía Bắc (Lào Cai, Lai Châu, Sơn La) và Tây Nguyên, nguồn giống sạch bệnh phục vụ canh tác tập trung quy mô lớn tại nước ta vẫn gần như bỏ ngỏ.

Khoảng trống nghiên cứu và tính cấp thiết

Nhân giống truyền thống bằng hạt gặp trở ngại lớn do chất lượng hạt không đồng đều, vỏ hạt dày và bài tiết hợp chất ức chế làm giảm tỷ lệ mọc mầm. Trong khi đó, nhân giống bằng hom thân ngầm đòi hỏi phải khai thác từ cây mẹ 3–4 năm tuổi, làm suy giảm trực tiếp năng suất rễ thu hoạch và tiềm ẩn nguy cơ lây truyền mầm bệnh qua nhiều thế hệ.

Trước khi nghiên cứu này được thực hiện, tại Việt Nam chưa từng có quy trình nuôi cấy mô tế bào in vitro chuẩn hóa nào cho cây Cam thảo bắc được công bố. Việc xây dựng một quy trình công nghệ sinh học bài bản, xác định chính xác nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng cho từng giai đoạn phát triển là yêu cầu cấp thiết nhằm đáp ứng nhu cầu tái cơ cấu cây trồng dược liệu công nghệ cao.

---

Methodology và approach (350-400 từ)

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm khoa học chuẩn mực tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM.

                                  QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM IN VITRO
                                  
                                                              [Tạo chồi: MS + 1,0 mg/L BA]

Thiết kế nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

Mọi thí nghiệm được thiết kế theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (Completely Randomized Design - CRD) với 4 lần lặp lại độc lập:

• Thí nghiệm 1 (Tạo nguồn mẫu vô trùng ban đầu): Khảo sát 4 mức thời gian khử trùng (5, 10, 15, 20 phút) bằng dung dịch Sodium Hypochlorite (NaOCl/Javel 2,5% + 2–3 giọt Tween 80) sau khi rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trong 30 giây (240 mẫu hạt).
• Thí nghiệm 2 (Cảm ứng tạo chồi in vitro): Đánh giá nồng độ 6-Benzylaminopurine (BA) từ 0,0 đến 3,0 mg/L (7 nghiệm thức, 420 mẫu đoạn thân mang chồi ngủ lấy từ cây mầm in vitro 1 tháng tuổi).
• Thí nghiệm 3 (Nhân nhanh cụm chồi): Thiết kế ma trận giai thừa đánh giá tương tác giữa Cytokinin (BA: 1,0 và 2,0 mg/L) với hai nhóm Auxin khác nhau gồm NAA (0,0 – 1,0 mg/L) và IBA (0,0 – 2,0 mg/L) (tổng cộng 20 nghiệm thức, 1.200 mẫu chồi).
• Thí nghiệm 4 (Tái sinh rễ và hoàn chỉnh cây): Khảo sát độc lập nồng độ Auxin kích thích ra rễ gồm NAA (0,1 – 0,5 mg/L) và IBA (0,5 – 2,0 mg/L) so sánh với đối chứng (800 mẫu chồi cao 2–3 cm).

Điều kiện nuôi cấy chuẩn và xử lý thống kê

• Môi trường nuôi cấy: Môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS, 1962) bổ sung 30 g/L đường sucrose và 8 g/L agar, hiệu chỉnh pH 5,8 trước khi khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút.
• Phòng nuôi cấy: Nhiệt độ ổn định ở 25 ± 2°C, độ ẩm 70–75%, cường độ ánh sáng 2.000 lux từ đèn huỳnh quang, chế độ chiếu sáng 12–16 giờ sáng/ngày.
• Xử lý số liệu: Thu thập các chỉ tiêu định lượng (tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ bật chồi, hệ số nhân chồi, số rễ, chiều dài rễ, chiều cao cây). Số liệu được xử lý phân tích phương sai ANOVA (1 yếu tố và 2 yếu tố) và kiểm tra sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng trắc nghiệm LSD ở mức ý nghĩa $P < 0,01$ và $P < 0,05$ trên phần mềm chuyên dụng Statgraphics Centurion XV và Excel 2010.

---

Phát hiện chính (400-450 từ)

Nghiên cứu mang lại 4 nhóm kết quả thực nghiệm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc:

Giai đoạn nuôi cấy	Nghiệm thức tối ưu	Chỉ tiêu then chốt	Kết quả đạt được	Mức ý nghĩa ($P$)
1. Khử trùng hạt	NaOCl 2,5% trong 15 phút	Tỷ lệ hạt nảy mầm Tỷ lệ mẫu chết	31,3% (cao nhất) 47,5%	$P < 0,01$
2. Cảm ứng tạo chồi	MS + 1,0 mg/L BA	Tỷ lệ bật chồi Số chồi TB/cụm	86,67% 5,43 chồi/cụm	$P < 0,01$
3. Nhân nhanh cụm chồi	MS + 2,0 BA + 0,25 NAA (mg/L)	Tỷ lệ tạo cụm chồi Hệ số nhân chồi Chất lượng hình thái	73,33% 8,2 lần Loại Tốt (+++)	$P < 0,01$
4. Tái sinh rễ	MS + 1,5 mg/L IBA	Tỷ lệ tạo rễ Thời gian ra rễ Số rễ TB/cây Chiều cao cây	86,25% 14 ngày 3,5 rễ 4,7 cm	$P < 0,01$ $P < 0,01$ $P < 0,01$ $P < 0,05$

1. Cân bằng tối ưu giữa khử trùng vô trùng và sức sống của phôi hạt

Khử trùng hạt trong 15 phút với dung dịch NaOCl 2,5% cho tỷ lệ nảy mầm đạt đỉnh 31,3%, cao hơn gấp 2,5 lần so với xử lý 5 phút (12,5%, nhiễm khuẩn cao tới 35%) và xử lý 20 phút (12,5%, mẫu chết do độc tính hóa chất lên tới 75%). Mặc dù vỏ hạt tiết chất ức chế tự nhiên, thời gian 15 phút là "điểm vàng" bảo toàn sức sống nội nhũ và phôi.

2. Nồng độ BA quyết định khả năng phá ngủ của chồi nách

Bổ sung BA ở nồng độ thấp đến trung bình (0,5–1,0 mg/L) kích thích mạnh mẽ sự bật chồi ngủ với tỷ lệ đạt trên 80%. Trong đó, nồng độ 1,0 mg/L BA cho kết quả tối ưu nhất với 86,67% mẫu tạo chồi và 5,43 chồi/mẫu. Khi nâng nồng độ BA lên trên 2,5 mg/L, xuất hiện hiện tượng ức chế ngược do dư thừa Cytokinin ngoại sinh, tỷ lệ bật chồi giảm mạnh xuống chỉ còn 30% và số chồi dị dạng tăng cao.

3. Sự tương tác hiệp đồng giữa BA và NAA vượt trội so với tổ hợp BA + IBA

Khi kết hợp Cytokinin và Auxin để nhân nhanh cụm chồi, tổ hợp 2,0 mg/L BA + 0,25 mg/L NAA (nghiệm thức AT7) đạt hiệu quả cao nhất với hệ số nhân chồi 8,2 lần, thời gian tạo cụm rút ngắn xuống 28 ngày, chồi mập mạp, phiến lá xanh đậm mở rộng. Ngược lại, việc kết hợp BA với IBA lại gây phản ứng bất lợi: tỷ lệ tạo cụm chồi thấp (<50%), chồi mảnh yếu và hình thành khối mô sẹo bất định dày đặc ở gốc cản trở tái sinh chồi.

             HỆ SỐ NHÂN CHỒI TƯƠNG QUAN THEO CHẤT ĐIỀU HÒA
  
  [MS + 2,0 BA + 0,25 NAA]  ████████████████████ 8,2 (Chồi khỏe +++)
  [MS + 2,0 BA + 0,75 NAA]  ████████████████████ 8,3 (Chồi mảnh +)
  [MS + 2,0 BA đơn lẻ]      █████████████ 5,6 (Chồi TB ++)
  [MS + 1,0 BA + 1,0 IBA]   █████████ 4,0 (Tạo mô sẹo +)
  [MS Đối chứng không đh]   ████ 2,2 (Thấp)

4. IBA kích thích hệ rễ hoàn chỉnh vượt trội so với NAA

IBA thể hiện tính ưu việt tuyệt đối trong giai đoạn tạo rễ tái sinh cây. Trên môi trường MS + 1,5 mg/L IBA, 86,25% chồi ra rễ chỉ sau 14 ngày, tạo trung bình 3,5 rễ to khỏe/cây, rễ dài 2,85 cm cân đối hoàn hảo với chiều cao cây đạt 4,7 cm. Trong khi đó, việc sử dụng NAA tuy có kích thích ra rễ nhưng rễ ngắn, giòn, mảnh và xuất hiện biến dị hình thái, khó thích nghi khi chuyển ra vườn ươm.

---

Đóng góp khoa học (250-300 từ)

Đóng góp về mặt lý thuyết và học thuật

• Làm sáng tỏ cơ chế đáp ứng hormone: Công trình cung cấp dẫn liệu khoa học định lượng đầu tiên tại Việt Nam về sự tương tác giữa Cytokinin (BA) và hai loại Auxin kinh điển (NAA, IBA) trên đối tượng Glycyrrhiza glabra L., bổ sung vào kho tàng sinh lý học thực vật in vitro của cây dược liệu họ Đậu.
• Giải mã hiện tượng ức chế mô sẹo: Phát hiện cơ chế hình thành mô sẹo bất lợi khi kết hợp BA và IBA ở nồng độ cao trong giai đoạn nhân chồi, định hướng cho các nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào và phôi vô tính sau này.

                           ĐÓNG GÓP TOÀN DIỆN CỦA ĐỀ TÀI
                           
[LÝ THUYẾT & HỌC THUẬN]     [QUY TRÌNH KỸ THUẬT]           [HIỆU QUẢ KINH TẾ]
• Cơ chế phản ứng hormone   • Quy trình 4 bước chuẩn hóa   • Hạ giá thành: ~1.900 đ/cây
• Dữ liệu nuôi cấy in vitro • Cây giống sạch 100% bệnh     • Tự chủ dược liệu trong nước
• Tương tác BA/NAA/IBA      • Hệ số nhân giống cao (8,2)   • Thay thế giống nhập khẩu

Đổi mới phương pháp và ứng dụng thực tiễn

• Xây dựng quy trình chuẩn hóa từ hạt: Thiết lập thành công một quy trình hoàn chỉnh từ khâu khử trùng hạt đến tạo cây con hoàn chỉnh đủ tiêu chuẩn xuất vườn (cao 4–5 cm, 2–3 rễ khỏe), khắc phục nhược điểm phụ thuộc vào cây mẹ của phương pháp giâm hom.
• Hạch toán kinh tế rõ ràng: Nghiên cứu tiên phong đưa ra bảng định mức chi phí sản xuất: tổng chi phí cho 1.000 cây giống in vitro chỉ khoảng 1.900.000 VNĐ (~1.900 VNĐ/cây). Với giá thành bán ra dự kiến 3.000 – 3.500 VNĐ/cây sau giai đoạn thuần dưỡng ngoài vườn ươm, quy trình chứng minh tính khả thi thương mại rất cao cho các doanh nghiệp nông nghiệp công nghệ cao.

---

Đối tượng quan tâm (200-250 từ)

Báo cáo nghiên cứu này mang lại giá trị ứng dụng trực tiếp cho nhiều nhóm đối tượng:

• Các viện nghiên cứu & trường đại học: Nguồn tài liệu tham khảo chuẩn xác về công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, cung cấp cơ sở dữ liệu để mở rộng nghiên cứu sản xuất hoạt chất thứ cấp (Glycyrrhizin, Glabridin) thông qua nuôi cấy bioreactor hoặc phôi soma.
• Doanh nghiệp dược phẩm và chiết xuất thảo dược: Tiếp cận quy trình công nghệ chuyển giao để chủ động vùng nguyên liệu sạch, đồng nhất về hàm lượng hoạt chất, đạt tiêu chuẩn GACP-WHO, giảm phụ thuộc vào nguồn dược liệu nhập khẩu không rõ nguồn gốc.
• Các trung tâm ươm tạo & phòng thí nghiệm giống thương mại: Tài liệu hướng dẫn kỹ thuật chi tiết cùng bảng phân tích định mức chi phí giúp tối ưu hóa dây chuyền nhân giống công nghiệp, nâng cao hệ số nhân giống và gia tăng tỷ lệ sống sót của cây con.
• Hợp tác xã nông nghiệp & nông dân vùng cao: Cơ hội tiếp cận giống cây dược liệu có giá trị kinh tế cao, mở rộng mô hình chuyển đổi cơ cấu cây trồng tại các vùng khí hậu ôn hòa (Tây Bắc, Tây Nguyên).

---

FAQ - Các câu hỏi thường gặp (250-300 từ)

1. Phát hiện quan trọng nhất của nghiên cứu này là gì?

Nghiên cứu đã xác định được công thức môi trường tối ưu cho từng giai đoạn, đặc biệt là sự kết hợp giữa 2,0 mg/L BA + 0,25 mg/L NAA giúp đạt hệ số nhân chồi cao kỷ lục (8,2 lần) và 1,5 mg/L IBA giúp tái sinh rễ hoàn hảo (86,25%, 3,5 rễ/cây sau 14 ngày) cho cây Cam thảo bắc.

2. Phương pháp nhân giống in vitro có gì đặc biệt so với gieo hạt truyền thống?

Nhân giống in vitro loại bỏ hoàn toàn các mầm bệnh truyền qua đất/hạt, khắc phục lớp vỏ hạt cứng gây ức chế nảy mầm, đồng thời tạo ra hàng loạt cây con có phẩm chất di truyền đồng đều 100%, tăng tốc độ nhân giống gấp hàng chục lần so với gieo hạt tự nhiên.

3. Kết quả của quy trình này có thể áp dụng ở quy mô công nghiệp được không?

Hoàn toàn khả thi. Quy trình sử dụng các hóa chất thông dụng (môi trường MS, đường, agar, BA, NAA, IBA) với chi phí sản xuất thấp (~1.900 VNĐ/cây), các thông số kỹ thuật được kiểm chứng qua phân tích ANOVA đạt độ tin cậy $P < 0,01$, rất thuận lợi cho việc chuẩn hóa quy mô công nghiệp.

4. Những bước nghiên cứu tiếp theo cần thực hiện là gì?

Cần tiếp tục hoàn thiện quy trình huấn luyện cây con hậu cấy mô (acclimatization) tại nhà lưới, thử nghiệm các loại giá thể vườn ươm, và đánh giá khả năng sinh trưởng, tích lũy hoạt chất Glycyrrhizin ngoài đồng ruộng ở các vùng sinh thái khác nhau.

5. Tại sao nên chọn IBA thay vì NAA cho giai đoạn ra rễ?

Thực nghiệm chứng minh môi trường chứa 1,5 mg/L IBA cho hệ rễ thẳng, mập, nhiều rễ phụ và cân đối với thân cây. Ngược lại, NAA kích thích ra rễ chậm hơn, rễ mảnh, dễ gãy và xuất hiện nhiều biến dạng hình thái làm giảm tỷ lệ sống khi ra đất.

---

Kết luận (150 từ)

Nghiên cứu của ThS. Nguyễn Ngọc Ánh và ThS. Phan Thị Hồng Thủy (Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM) đã giải quyết trọn vẹn bài toán nhân giống cây Cam thảo bắc (Glycyrrhiza glabra L.) bằng con đường nuôi cấy mô in vitro. Với quy trình 4 bước chuẩn hóa, hệ số nhân chồi đạt 8,2 lần và tỷ lệ ra rễ đạt trên 86%, công trình đã sản xuất thành công lô cây giống in vitro đạt tiêu chuẩn chất lượng cao với giá thành cạnh tranh.

Đây là tiền đề vững chắc để tiến tới thương mại hóa công nghệ, hoàn thiện khâu thuần dưỡng hậu cấy mô và quy hoạch các vùng trồng dược liệu chuyên canh tại Việt Nam. Các đơn vị nghiên cứu, doanh nghiệp dược phẩm quan tâm đến việc chuyển giao công nghệ và hợp tác phát triển vùng trồng có thể kết nối trực tiếp với cơ quan chủ trì để hiện thực hóa tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu quý này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Tổng quan về cây Cam thảo bắc Cam thảo bắc có tên khoa học Glycyrrhiza glabra L. là cây nhỏ mọc nhiều năm, có một hệ thống rễ và thân ngầm rất phát triển. Thân ngầm dưới đất có thể đâm ngang đến 2 m. Từ thân ngầm này lại mọc lên các thân cây khác.

Thân cây mọc đứng cao 0,5-1,5 m. Thân yếu, lá kép lông chim lẻ, có 9-17 lá chét hình trứng. Hoa hình bướm màu tím nhạt; cụm hoa dày. Quả loại đậu, nhẵn và thẳng.

Cây được trồng ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Mông Cổ, Liên Xô cũ, Hungari… Cam thảo bắc ưa khí hậu ôn hòa hoặc mát lạnh. Cây sống thích hợp ở nhiệt độ 18-20 oC. Những khu vực Cam thảo bắc mọc hoang là những nơi có đất khô, đất có canxi, đất cát, đất cát vàng. Những nơi có đất đen cứng chắc, kiềm tính và ẩm thấp thì chất lượng cam thảo kém hơn, nhiều xơ, ít bột, ít ngọt, rễ mọc cong queo.

Trồng bằng hạt hoặc thân rễ. Gieo hạt vào mùa xuân (tháng 2-3). Sau khi chọn đất thích hợp, làm tơi đất, lên luống cao 40-50 cm, mặt luống rộng 50-60 cm. Gieo 2-3 hàng theo chiều dài luống, hàng cách nhau 25-30 cm.

Mỗi ha bón lót 15-20 tấn phân chuồng mục. Sau khi gieo, lấp đất độ 1cm, sau khoảng 10-15 ngày cây mọc. Khi cây được 3 lá thì bắt đầu tỉa. Cây cách nhau khoảng 3 cm.

Khi cây mọc được 5 lá, tỉa lần cuối và ổn định mật độ, đảm bảo cây cách nhau 15-20 cm. Cần chú ý làm cỏ và vun xới, trung bình 1 tháng 1 lần.Trồng bằng hom vào mùa xuân. Vào tháng 2-3, trước khi cây tái sinh, có thể đào xung quanh gốc cây đã mọc 3 năm để lấy thân ngầm. Chú ý đào cách gốc 25-30 cm.

Cũng có thể kết hợp lấy giống khi thu hoạch dược liệu. Cắt thân ngầm thành từng đoạn 15-20 cm, mỗi hom có 2-3 chồi ngủ. Hom được ươm trong vườn. Trồng theo rạch khoảng cách 10 x 10 cm.

Lấp đất sâu khoảng 5 cm. Nén nhẹ mặt luống cho hom giống ổn định. Hàng ngày tưới nhẹ, đảm 6 bảo đất luôn ẩm và tơi xốp. Sau khi ươm khoảng 20 ngày, cây mọc.

Tháng 5-6, có thể bứng ra trồng ở ruộng sản xuất. Sau khi trồng khoảng 5 năm có thể thu hoạch.1 Cây, quả, hạt và rễ lát mỏng của Cam thảo bắc G.2 Thành phần hóa học của Cam thảo bắc Những nghiên cứu về Cam thảo bắc trên thế giới được thực hiện từ rất sớm vì đây là một vị thuốc truyền thống được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia, đặc biệt ở khu vực châu Á. Hầu hết các nghiên cứu thiên về tìm hiểu các hợp chất có trong rễ cây và tác dụng của các hợp chất này. Trong các loài Cam thảo bắc, Glycyrrhiza glabra là loài được nghiên cứu nhiều nhất về thành phần hóa học và dược tính.

Năm 2012,theo báo cáo tổng hợp của Kumar Anil và Dora Jyotsna từ các nghiên cứu khắp nơi trên thế giới, bằng các phương pháp phân lập, tách chiết sinh hóa, các nhà khoa học đã xác định Cam thảo bắc trưởng thành chứa các thành phần hóa học sau: - Quan trọng nhất là Glycyrrhizin, một saponin thuộc nhóm olean, hàm lượng từ 10-14% trong dược liệu khô, chỉ có trong bộ phận ở dưới mặt đất, có vị rất ngọt (gấp 60 lần đường saccharose). Glycyrrhizin được phân lập thu được dưới dạng mảnh màu vàng. Glycyrrhizin tinh khiết ở dạng bột kết tinh trắng dễ tan trong nước nóng, cồn loãng, không tan trong ether và chloroform. Glycyrrhizin ở trong cây dưới dạng muối Mg và Ca của acid glycyrrhizic (còn gọi là acid glycyrrhizinic) (Robiquet, 1809); 7 - Các dẫn xuất triterpenoid khác như: acid liquiritic, acid 18-alpha-hydroxy- glycyrrhetic, acid 24-hydroxyglycycrrhetic, glabrolid, desoxyglabrolid, isoglabrolid, 24-alpha-hydroxyisoglabrolid, acid liquiridiolic, acid 11- desoxoglycyrrhetic, acid 24-hydroxy 11-desoxoglycyrrhetic; - Các flavonoid là nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai có trong rễ cam thảo với hàm lượng 3-4%.

Có 27 chất đã được biết, quan trọng nhất là hai chất liquiritin (hay liquiritirosid) và isoliquiritin (hay isoliquiritirosid). Ngoài ra, còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác: isoflavan (gla-bridin), isoflavon (glabron), isoflaven (glabren); - Hoạt chất estrogen steroid; dẫn chất coumarin: umbelliferon, herniarin, liqcoumarin; - Trong rễ cam thảo còn có 20-25% tinh bột, 3-10% glucose và saccharose. Phần trên mặt đất của cây cam thảo cũng đã xác định được các flavonoid: pinocembrin, prunetin, isomucronulatol.3 Tác dụng dược lý của cây Cam thảo bắc Cây Cam thảo bắc được sử dụng rộng rãi, là vị thuốc có mặt trong nhiều bài thuốc Đông y có tác dụng giải độc, chỉ khái, hóa đàm, chống co thắt cơ trơn, bảo vệ da, gan, hỗ trợ chống ung thư, trị viêm loét, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus… Cam thảo bắc được sử dụng trong một số chế phẩm điều trị như: thuốc chữa ho, thuốc chữa loét dạ dày và ruột, thường hay phối hợp với bismuth nitrat kiềm, magiesium carbonat, calci carbonat, bột vỏ Rhamnus (hoặc đại hoàng), có acid glycyrrhetic nên được dùng làm thuốc chống viêm tại chỗ, dùng làm tá dược điều vị để làm mất các vị khó uống trong các chế phẩm. Vì có tác dụng chống co thắt, Cam thảo bắc còn được phối hợp làm trà nhuận tràng, làm mứt, nước uống, làm thơm thuốc lá.

Năm 2014,theo Muhammad Parvaiz và cộng sự, nhiều nghiên cứu lâm sàng hiện đại đã chứng minh được những dược tính này của Cam thảo bắc. 8 Dịch chiết Cam thảo bắc có tác dụng chống loét dạ dày. Tác dụng đã được chứng minh bằng thí nghiệm trên động vật. Trên chuột lang thì gây loét bằng cách tiêm những liều xác định histamin; trên chó thì gây loét bằng atophan (acid 2- phenyl quinolein 4-carboxylic); trên chuột cống thì thắt u môn.

Động vật thí nghiệm được mổ và quan sát tình trạng tổn thương trên niêm mạc dạ dày. Tác dụng chống co thắt của dịch chiết cam thảo được chứng minh trên ruột cô lập của chuột lang hoặc thỏ thấy có tác dụng đối kháng với histamin, acetylcholin. Tác dụng chống co thắt và tác dụng bảo vệ chống loét dạ dày chủ yếu là do các thành phần flavonoid. Tác dụng long đờm do các saponin.

Tác dụng tương tự như cortison do glycyrrhizin, giữ nước trong cơ thể kèm theo tích các ion Na+ và Cl- và tăng thải ion K+, giảm lượng nước tiểu, tăng huyết áp. Nếu dùng cam thảo một thời gian lâu thì có hiện tượng phù. Trong một số trường hợp thí nghiệm trên động vật cho thấy tác dụng chống viêm bằng 1/5 hydrocortison. Glycyrrhizin làm giảm những tổ chức hạt tạo thành xung quanh viên bông cấy dưới da của chuột cống trắng hoặc làm giảm độ sưng của chân chuột sau khi tiêm formol.

Acid liquiritic cũng có tác dụng chống viêm, chống loét và làm chóng lành sẹo. Tác dụng ức chế enzym monoaminoxydase (MAO) của 2 hoạt chất liquiritigenin và isoliquiritigenin cũng được phát hiện. Chất isoliquiritigenin có tác dụng mạnh hơn. Thí nghiệm trên động vật cho thấy Cam thảo bắc có khả năng giảm độc của morphin, cocain, strychnin, atropin, chloralhydrat, giải độc các độc tố bạch hầu, uốn ván.

Nghiên cứu gần đây còn cho thấy Cam thảo bắc có tác dụng nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể. Ngoài ra, Cam thảo bắc còn có mặt trong hơn hai mươi bài thuốc phổ biến chữa các chứng viêm nhiễm, đau dạ dày, lao phổi, viêm gan, rối loạn nhịp tim, addison… Sự có mặt của Cam thảo bắc vừa đóng vai trò chủ trị vừa có tác dụng điều hòa tính vị của các vị thuốc khác trong bài thuốc. Các chế phẩm có chứa thành phần Cam thảo bắc hiện có trên thị trường: thuốc trị dạ dày Vasu Pharma Herbals, Sri Sri Ayurveda; thuốc giải độc phổi, gan và máu 9 Yashti – madhu, thuốc trị ho Yashtimadhu; thực phẩm chức năng hỗ trợ cơ xương Hymalaya Herbals… Bột Cam thảo bắc cũng được sử dụng như một công thức làm đẹp, dưỡng da. Ở Việt Nam, các sản phẩm từ Cam thảo bắc phần lớn đều nhập từ Trung Quốc và Châu Âu.

Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây Cam thảo bắc Trên thế giới, đã có những nghiên cứu vi nhân giống Cam thảo bắc từ rất sớm, khá nhiều nghiên cứu vi nhân giống bằng chồi ngọn và đoạn thân mang chồi. Năm 1980, một báo cáo sơ bộ về vi nhân giống được trình bày bởi Shah và Dalal. Năm 1995, Mareshige Kohjyouma và cộng sự (Nhật Bản) nghiên cứu nhân chồi cây Cam thảo bắc Glycyrrhiza glabra bằng nguồn nguyên liệu là đoạn thân mang chồi ngủ, các đoạn thân này được cắt từ chồi 1 tháng tuổi nảy từ thân ngầm của Cam thảo bắc sau một tháng giâm hom. Nghiên cứu này của các tác giả được thực hiện với 3 đánh giá chính: Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự hình thành chồi, ảnh hưởng của BA đến cảm ứng nhân chồi và sự kích thích tạo rễ.

Ở nội dung đầu tiên, các tác giả bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tổ hợp của cả hai chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA, với NAA ở 4 nồng độ 0 – 0,04 – 0,2 – 1mg/L và BA ở nồng độ 0 – 0,2 – 1 – 5mg/L, kết quả thu nhận được cho thấy những môi trường có BA mà không có NAA cho tỉ lệ mẫu nhân chồi cao, tuy nhiên những chồi này có nhiều biến dị, môi trường bổ sung 5mg/L BA kết hợp với 0 – 0,04 mg/L NAA có sự hình thành nhiều mô sẹo. Ở thí nghiệm tiếp theo, để kiểm tra ảnh hưởng của BA đối với sự nhân chổi, nhóm tác giả đã bổ sung BA với các nồng độ 0– 0,25 – 0,5 – 1 mg/L, kết quả cho thấy rằng khi sử dụng môi trường MS bổ sung 1 mg/L BA cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất, sau 50 ngày thấy xuất hiện cảm ứng tạo chồi với số chồi hình thành cao nhất là 4,6 chồi/cụm. Chồi nhân được sau đó đưa vào cấy trong môi trường MS bổ 10 sung 0,01 – 0,5 mg/L NAA, sau 80 ngày sẽ cảm ứng tạo rễ và thành cây hoàn chỉnh. Năm 1998, Thengane và cộng sự đã mô tả một quy trình từng bước để nhân giống Glycyrrhiza glabra L.

trên môi trường nuôi cấy đơn giản từ nguồn nguyên liệu ban đầu là chồi ngọn và các đoạn thân mang chồi ngủ. Họ quan sát thấy tỉ lệ nhân chồi tăng đáng kể khi bổ sung vào môi trường MS chất điều hòa tăng trưởng BA với hàm lượng 0,2 – 2 mg/L. Sự tái sinh cây con in vitro đạt tỉ lệ cao đối với môi trường MS bổ sung với 0,5 mg/L BA và 0,05 mg/L NAA. Năm 2007, Patel và cộng sự báo cáo rằng môi trường MS bổ sung 2 mg/L BA và 0,05 mg/L NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất, môi trường MS bổ sung 0,5 – 1 mg/L IBA là môi trường thích hợp để rễ Cam thảo bắc phát triển khỏe, bình thường.