CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Vài nét về xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu 1. Khái niệm tạp chất Tạp chất là bất kỳ thành phần nào không phải hoạt chất và có thể ảnh hưởng đến chất lượng của nguyên liệu. Các tạp chất có thể tồn tại trong nguyên liệu như: + Tạp chất vô cơ: có thể phát sinh từ quá trình sản xuất, từ môi trường như: kim loại nặng, muối vô cơ, thuốc thử, chất xúc tác… + Tạp chất hữu cơ: có thể phát sinh trong quá trình sản xuất hoặc bảo quản nguyên liệu.
Các tạp này có thể được xác định hoặc không xác định, dễ bay hơi hoặc không dễ bay hơi, bao gồm như: sản phẩm phân hủy, chất trung gian, thuốc thử, chất xúc tác, nguyên liệu ban đầu… + Dung môi tồn dư: là những chất lỏng vô cơ hoặc hữu cơ còn tồn dư sau quá trình tổng hợp nguyên liệu. Ảnh hưởng của tạp chất Các tạp chất trong nguyên liệu hóa dược dù rất nhỏ nhưng cũng có thể gây ra các tác động xấu như [1]: + Gây tác hại cho sức khỏe (như tạp chất bari tan, arsen, chì…) + Gây hiện tượng tương kỵ hóa học, ảnh hưởng đến phẩm chất hay độ bền của nguyên liệu. + Một số tạp chất có thể không gây hại nhưng lại là những chất xúc tác đẩy nhanh quá trình phân hủy thuốc (ví dụ: các vết kim loại…) + Một số tạp chất không gây ra các tác động trên nhưng nó biểu thị cho mức độ sạch (mức độ tinh chế) của nguyên liệu. Các phương pháp xác định tạp chất Hầu hết các chuyên luận dược điển hay tiêu chuẩn cơ sở đều quy định về việc xác định các tạp chất (bao gồm tạp vô cơ, hữu cơ, tạp chất liên quan).
Đối với các tạp chất vô cơ là các tạp có nguồn gốc từ môi trường sản xuất, đa số xuất hiện trong các nguyên liệu, phương pháp xác định giới hạn sẽ được quy định trong một chuyên luận chung của dược điển, bằng các phương pháp hóa học, quang phổ, góc quay cực… Các tạp chất liên quan trong nguyên liệu (thường là tạp hữu cơ) có thể xuất hiện trong bước tổng hợp, từ nguyên liệu quan ban đầu, chất trung gian. Các tạp này có thể khác nhau giữa các nguyên liệu, nên các phương pháp xác định thường được quy định trong từng chuyên luận riêng, cụ thể với từng chất. Tạp chất liên quan trong nguyên liệu được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như hóa học, quang phổ tử ngoại… Các phương pháp chủ yếu hay được sử 2 dụng nhất là nhóm các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao. Nhóm phương pháp này có tính ổn định và chính xác cao, có khả năng phân tích được nhiều chất khác nhau, khả năng ứng dụng rộng rãi.
Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký: Sắc ký bao gồm nhiều kỹ thuật phân tách dựa trên sự phân bố hoặc phân chia của mẫu giữa pha chuyển động được gọi là pha động và pha cố định được gọi là pha tĩnh. Sắc ký có thể được xem như một loạt các cân bằng giữa pha động và pha tĩnh. Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác, do đó ái lực của nó với pha tĩnh và pha động khác nhau. • Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [2]: - Nguyên tắc: Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại.
Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định, di chuyển trên bản mỏng dưới tác động của lực mao quản. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động. - Ứng dụng: TLC có thể xác định được nhiều tạp chất có nồng độ cao, có khả năng phát huỳnh quang hoặc thực hiện các phản ứng hiện màu đặc trưng.
Xác định tạp định danh trong nguyên liệu hóa dược bằng cách so sánh với Rf của vết tạp chuẩn làm trên cùng bản mỏng. - Ưu - Nhược điểm của phương pháp: + Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng thực hiện, không cần hệ thống máy móc cầu kỳ. + Chuẩn bị mẫu đơn giản – ít gặp vấn đề về nền mẫu. + Thời gian và chi phí cho phân tích thấp.
+ Độ nhạy của phương pháp thấp, nồng độ tạp chất trong mẫu phải cao. + Đối với hệ TLC đơn giản chỉ có thể định tính chứ không thể định lượng được. • Phương pháp sắc ký khí (GC) [2]: - Nguyên tắc: Pha động trong GC là chất khí. Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ tạo nên hai dạng sắc ký khí tương ứng là sắc ký khí rắn (GSC) và sắc ký khí lỏng (GLC).
Chất phân tích được pha động đưa vào cột dưới dạng hơi. Trong cột xảy ra quá trình tương tác giữa chất phân tích trong pha động (hơi) với pha tĩnh. Thành phần hòa tan nhiều hơn trong pha tĩnh di chuyển chậm hơn trong cột, ngược lại thành phần ít hòa tan hơn trong pha tĩnh di chuyển nhanh hơn. Do 3 đó, các thành phần có trong hỗn hợp mẫu được phân tách theo hệ số phân chia của chúng giữa thành phần trong mẫu và pha tĩnh.
Do các chất phân tích khác nhau về tính chất hóa lý, chúng được tách ra khỏi nhau. - Ứng dụng: GC là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, được ứng dụng trong phân tích những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt. Tạp chất phân tích bằng GC gồm sản phẩm phân hủy, tạp chất liên quan, tạp chất bay hơi và dung môi tồn dư. - Ưu - Nhược điểm của phương pháp: + Là phương pháp xanh, do giảm thiểu việc sử dụng các dung môi hữu cơ.
+ Chỉ áp dụng được với các tạp chất có khả năng bay hơi và không bị phân hủy bởi nhiệt. + Đòi hỏi nhiệt độ và áp suất phù hợp cho sự bay hơi của chất phân tích. • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[2]: - Nguyên tắc: Các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động lỏng. Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác do đó ái lực của nó với pha tĩnh dưới tác động của pha động khác nhau.
Các cơ chế tách bằng HPLC có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, ái lực, tách đồng phân đối quang. - Ứng dụng: HPLC được sử dụng để xác định các tạp chất ở trạng thái lỏng hoặc tạp chất rắn có khả năng hòa tan trong dung môi thích hợp. HPLC cho phép phân tích các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt có cấu trúc rất khác nhau, từ những chất có khối lượng phân tử nhỏ đến lớn, các kim loại, anion vô cơ, các chất hữu cơ bao gồm cả những chất có nguồn gốc tự nhiên, sản phẩm sinh học. - Ưu – nhược điểm của phương pháp: + Phạm vi ứng dụng rộng, với khoảng nồng độ có thể phân tích cỡ hàng trăm ppm đến dưới ppb.
+ Phương pháp dễ dàng đáp ứng yêu cầu về độ đúng, độ chính xác, độ chọn lọc cũng như độ nhạy cao ứng với quy trình phân tích tương ứng. + Áp dụng được thử giới hạn và định lượng tạp chất trong nguyên liệu. + Không áp dụng được cho tạp chất rắn không tan. + Giá thành thiết bị, hóa chất tiêu hao cao, yêu cầu chất chuẩn phân tích cao.
Sơ lược về L – citrullin DL – malat (1:1) L – Citrullin DL- malat (CM) là sự kết hợp của hai thành phần L – citrullin và DL – malat (hoặc acid DL – malic) theo tỷ lệ 1:1 [5]. CM là một muối hữu cơ tham gia vào quá trình chuyển hóa của cơ thể tạo ra năng lượng, tăng khả năng cung cấp oxy và dinh dưỡng đến các cơ trong quá trình tập luyện cường độ cao. Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat • Danh pháp IUPAC: (2S) – 2 – amino – 5 – (carbamoylamino)pentanoic acid; 2 – hydroxybutanedioic acid [13]. • Công thức phân tử: C10H19N3O8 [13].
• Trọng lượng phân tử: 309,27 g/mol [13]. Cơ chế sinh học L – Citrullin DL – malat Tác dụng sinh học của CM là do sự hiệp đồng tác dụng của cả L – citrullin và DL – malat ở cơ [19]. L – citrullin là một acid amin không thiết yếu, được sản xuất thông qua hai quá trình trao đổi chất quan trọng: từ glutamin trong đường ruột và từ việc chuyển L – arginin thành nitric oxid (NO) [18]. Tác dụng của CM được thể hiện thông qua tác dụng của L – citrullin bằng 2 cơ chế sau: Thứ nhất, L – Citrullin khi hấp thu vào cơ thể sẽ làm tăng nồng độ L – arginin trong máu khi nghỉ ngơi và khi tập luyện thể dục.
L – arginin là hợp chất chính trong con đường tổng hợp NO. Khi uống L – citrullin có thể gián tiếp làm tăng nồng độ NO trong máu thông qua con đường L – arginin – NO (Hình 1. NO được tổng hợp sẽ tác động lên cơ trơn làm giãn mạch máu, từ đó cải thiện lưu lượng máu đến các cơ bắp đang hoạt động, cung cấp oxy và chất dinh dưỡng, làm giảm đau nhức cơ bắp [11]. Thứ hai, L – citrullin tham gia hỗ trợ quá trình loại bỏ amoniac thông qua chu trình ure (Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn các cơ chế sinh học của L – citrullin (CPS: carbamoyl phosphat synthetase, OTC: ornithin transcarbamylase, ASS: argininosuccinat synthase, ASL: argininosuccinat lyase, NOS: Nitric oxid synthases) Amoniac là một chất thải của quá trình chuyển hóa, nó sản sinh ra nhiều hơn với người tập luyện cường độ cao.
Nồng độ amoniac trong máu tăng cao sẽ cản trở quá trình cung cấp ATP cho cơ xương. Khi tập thể dục cường độ cao, bổ sung L – Citrullin giúp giải độc amoniac trong máu, từ đó làm tăng cường khả năng sử dụng pyruvat hiếu khí và cung cấp ATP cho cơ xương [11].