Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe và dinh dưỡng thể thao, nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng nhằm nâng cao thể lực, cải thiện hiệu suất tập luyện và đẩy nhanh tốc độ hồi phục cơ bắp ngày càng gia tăng. Trong số các hoạt chất được ứng dụng, L-citrullin DL-malat (CM) với tỷ lệ phối hợp 1:1 giữa L-citrullin và acid DL-malic là hợp chất có tiềm năng sinh học nổi bật. CM tham gia vào chu trình urê giúp đào thải amoniac, hỗ trợ con đường tổng hợp nitric oxid (NO) gây giãn mạch, đồng thời cung cấp malat cho chu trình acid tricarboxylic (TCA) để gia tăng sản sinh năng lượng ATP hiếu khí.

Mặc dù các chế phẩm chứa CM xuất hiện ngày càng phổ biến trên thị trường Việt Nam, tại thời điểm thực hiện đề tài, trong nước chưa có công bố khoa học nào về việc kiểm soát chất lượng của nguyên liệu này. Mặt khác, các dược điển lớn trên thế giới như Dược điển Việt Nam V, Dược điển Anh (BP), Dược điển Mỹ (USP), hay Dược điển Châu Âu (EP) đều chưa ban hành chuyên luận chính thức cho L-citrullin DL-malat.

Trong quá trình tổng hợp hóa học nguyên liệu CM từ hai thành phần L-citrullin và acid DL-malic, nguy cơ tồn dư tạp chất liên quan là rất lớn, đặc biệt là acid maleic (AM) và acid fumaric (AF) phát sinh từ nguồn nguyên liệu acid malic. Acid maleic có độc tính cao trên thận, gây hội chứng Fanconi và suy thận cấp do ức chế các enzym chuyển hóa oxy trong ty thể tế bào ống thận. Acid fumaric ở liều cao cũng có thể gây suy thận cấp và rối loạn chức năng gan, da, tiêu hóa. Do đó, việc xây dựng một quy trình phân tích tin cậy để kiểm soát hàm lượng hai tạp chất này là yêu cầu cấp thiết nhằm bảo đảm chất lượng và độ an toàn của nguyên liệu.

Khóa luận xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng phương pháp xác định tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrullin malat bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hai tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrullin malat thực tế do nhà sản xuất cung cấp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng khảo sát: Lô nguyên liệu L-citrullin DL-malat (1:1) của nhà sản xuất Jing Jing Pharmaceutical Co. (Số lô: C562305009; Ngày sản xuất: 19/05/2023; Hạn dùng: 2 năm).
  • Đối tượng nghiên cứu: Hai tạp chất liên quan gồm acid maleic (độ tinh khiết 99,0%, Bidepharmatech) và acid fumaric (độ tinh khiết 99,5%, Shanghai Zhanyun Chemical Co., Ltd).
  • Phạm vi thực hiện: Nghiên cứu thực nghiệm tại Bộ môn Hóa Dược – Khoa Công nghệ Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (hoàn thành tháng 06/2024).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và tiêu chuẩn áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết kiểm nghiệm tạp chất liên quan trong nguyên liệu hóa dược và nguyên lý phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Tác giả tham khảo chuyên luận acid maleic, acid malic và acid fumaric trong Dược điển Mỹ (USP 43) để thiết lập giới hạn chấp nhận cho tạp chất trong CM:

  • Giới hạn acid maleic: $\le 0,025%$ (tính toán dựa trên mức quy định $\le 0,05%$ trong chuyên luận acid malic do acid malic chiếm $50%$ khối lượng CM).
  • Giới hạn acid fumaric: $\le 0,5%$ (tính toán dựa trên mức quy định $\le 1,0%$ trong chuyên luận acid malic).

Quy trình phân tích được thẩm định theo các yêu cầu kỹ thuật quy định tại:

  • Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích (Phụ lục 1 - Thông tư 32/2018/TT-BYT của Bộ Y tế).
  • Hướng dẫn hiệu năng phương pháp phân tích chuẩn của AOAC (Guidelines for Standard Method Performance Requirements - 2016).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp phân tích: Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) ghép nối đầu dò tử ngoại - khả kiến (UV-Vis).
  • Phương pháp khảo sát và tối ưu hóa: Khảo sát lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại qua phổ quét UV; khảo sát hệ pha động gradient rửa giải (acetonitril và đệm phosphat); khảo sát ảnh hưởng của pH đệm phosphat (khảo sát ở pH 2,3 và pH 2,0) nhằm tách hoàn toàn pic phân tích khỏi nền mẫu nguyên liệu CM.
  • Phương pháp xử lý mẫu: Mẫu thử và mẫu chuẩn được hòa tan trong dung môi pha mẫu gồm acetonitril : đệm phosphat (tỷ lệ 2:98 v/v), hỗ trợ hòa tan bằng bể siêu âm trong thời gian 15 đến 45 phút, sau đó lọc qua màng lọc cellulose acetat kích thước lỗ $0,45\ \mu\text{m}$.
  • Phương pháp thẩm định quy trình phân tích: Đánh giá đầy đủ các chỉ tiêu thực nghiệm:
    • Độ phù hợp hệ thống: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp.
    • Độ đặc hiệu: So sánh sắc ký đồ mẫu dung môi, dung dịch chuẩn đơn, dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử thêm chuẩn; đánh giá hệ số trùng khớp phổ UV (Match factor).
    • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Xác định dựa trên tỷ số tín hiệu trên nhiễu đường nền ($S/N \approx 3$ đối với LOD và $S/N \approx 10$ đối với LOQ).
    • Khoảng tuyến tính: Xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn qua 8 mức nồng độ, đánh giá hệ số tương quan ($r$) và độ chệch (bias).
    • Độ đúng: Phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ ($30%$, $100%$, $110%$ so với nồng độ giới hạn), mỗi mức phân tích 3 mẫu độc lập, tính tỷ lệ thu hồi ($%$).
    • Độ chính xác: Đánh giá độ lặp lại ($n=6$) và độ chính xác trung gian qua 2 ngày phân tích khác nhau và 2 kiểm nghiệm viên khác nhau ($n=18$).

Thiết bị và nguồn dữ liệu

  • Hệ thống thiết bị: Hệ thống HPLC Agilent 1290/6460 Infinite tích hợp đầu dò UV-Vis; cột sắc ký Shim-pack GIST C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, kích thước hạt $5\ \mu\text{m}$); cân phân tích Mettler Toledo XPE 105; máy đo pH Eutech; máy siêu âm Sonorex Bandelin.
  • Thuốc thử và dung môi: Acetonitril dùng cho HPLC (Fisher - Hàn Quốc), kali dihydrophosphat ($99,5%$, Xilong), acid phosphoric đậm đặc ($85,0%$, Guangdong Guanghua), nước cất 2 lần từ máy cất Hamilton.
  • Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được thu thập từ phần mềm sắc ký và xử lý thống kê bằng Microsoft Excel 2016.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các kiến thức lý thuyết về kiểm soát tạp chất trong nguyên liệu hóa dược, bao gồm phân loại tạp chất (vô cơ, hữu cơ, dung môi tồn dư) và các kỹ thuật phân tích hiện đại (TLC, GC, HPLC). Tác giả đi sâu phân tích cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa và cơ chế tác dụng sinh học của L-citrullin DL-malat:

  • Cấu trúc: Muối tạo bởi L-citrullin và acid DL-malic (tỷ lệ 1:1), công thức phân tử $\text{C}{10}\text{H}{19}\text{N}_3\text{O}_8$, khối lượng phân tử $309,27\text{ g/mol}$, danh pháp IUPAC: (2S)-2-amino-5-(carbamoylamino)pentanoic acid; 2-hydroxybutanedioic acid.
  • Cơ chế sinh học: Hiệp đồng tác dụng của L-citrullin (tăng tổng hợp L-arginin và nitric oxid giúp giãn mạch; giải độc amoniac qua chu trình urê) và malat (chất trung gian chu trình TCA giúp sản sinh ATP hiếu khí).

Về hai tạp chất nghiên cứu:

  • Acid maleic (đồng phân cis): $\text{C}_4\text{H}4\text{O}4$, phân tử lượng $116,07\text{ g/mol}$, $\text{p}K{a1} = 1,94$, $\text{p}K{a2} = 6,22$, $\log P = -0,48$, độc tính gây hội chứng Fanconi và tổn thương ống thận.
  • Acid fumaric (đồng phân trans): $\text{C}_4\text{H}4\text{O}4$, phân tử lượng $116,07\text{ g/mol}$, $\text{p}K{a1} = 3,03$, $\text{p}K{a2} = 4,54$, $\log P = 0,46$, độ tan trong nước kém ($0,63\text{ g}/100\text{ ml}$ ở $25^\circ\text{C}$), có thể gây suy thận cấp ở liều cao.

Chương này cũng tổng hợp các nghiên cứu phân tích AM và AF trước đây trên thế giới, qua đó làm cơ sở lựa chọn điều kiện HPLC pha đảo sử dụng cột C18 (L1) thay thế cho cột trao đổi ion (L17) để phù hợp với điều kiện trang thiết bị thực tế.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết thông tin về nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị, quy trình chuẩn bị các dung dịch mẫu (chuẩn gốc, chuẩn làm việc, chuẩn hỗn hợp, mẫu thử CM, mẫu thử thêm chuẩn) và nội dung khảo sát, thẩm định phương pháp.

Các điều kiện sắc ký cố định ban đầu gồm:

  • Cột phân tích: Shim-pack GIST C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$).
  • Tốc độ dòng pha động: $0,8\text{ ml/phút}$.
  • Thể tích tiêm mẫu: $10\ \mu\text{l}$.
  • Nhiệt độ cột: $25^\circ\text{C}$.
  • Dung môi pha mẫu: Hỗn hợp Acetonitril : Đệm phosphat ($2:98\text{ v/v}$).

Chương này quy định chi tiết tiêu chuẩn chấp nhận cho từng chỉ tiêu thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ASEAN và AOAC.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình khảo sát tối ưu hóa điều kiện sắc ký, kết quả thẩm định phương pháp và ứng dụng phân tích mẫu thực tế.

1. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký

  • Bước sóng phát hiện: Quét phổ UV cho thấy AM có cực đại hấp thụ tại $210\text{ nm}$ và AF tại $208\text{ nm}$. Bước sóng $210\text{ nm}$ được lựa chọn vì AM có giới hạn kiểm soát thấp hơn ($0,025%$) và hạn chế nhiễu đường nền so với $208\text{ nm}$.
  • Chương trình gradient dung môi: Khảo sát 2 chương trình gradient giữa kênh A (ACN) và kênh B (đệm phosphat $\text{KH}_2\text{PO}_4\ 3,3\text{ mM}$). Chương trình 2 được chọn do tách hoàn toàn pic AM khỏi pic tạp của nền mẫu CM ($R_s$ với pic phía trước $= 2,96$; $R_s$ với pic phía sau $= 4,15$).
  • Khảo sát pH đệm: So sánh giữa pH 2,3 và pH 2,0. Tại pH 2,0, pic AF tách hoàn toàn khỏi tạp chất liền kề trong nền mẫu CM với độ phân giải đạt $R_s = 3,2$ và pic đối xứng ($T_f = 1,1$), AM đạt $R_s = 1,6$.

Bảng chương trình gradient pha động tối ưu:

Thời gian (phút) Kênh A - Acetonitril (%) Kênh B - Đệm $\text{KH}_2\text{PO}_4\ 3,3\text{ mM}$ pH 2,0 (%)
$0 \rightarrow 10$ $1$ $99$
$10 \rightarrow 15$ $1 \rightarrow 25$ $99 \rightarrow 75$
$15 \rightarrow 22$ $25$ $75$

2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích

Độ phù hợp hệ thống ($n=6$):

  • Acid maleic ($2,5\ \mu\text{g/ml}$): Thời gian lưu trung bình $t_R = 9,576\text{ phút}$ ($\text{RSD} = 1,2%$); Diện tích pic $S = 155,78\text{ mAU}\cdot\text{s}$ ($\text{RSD} = 0,9%$); Số đĩa lý thuyết $N = 17404$; Hệ số đối xứng $T_f = 1,11$; Độ phân giải $R_s = 11,64$.
  • Acid fumaric ($50\ \mu\text{g/ml}$): Thời gian lưu trung bình $t_R = 13,746\text{ phút}$ ($\text{RSD} = 0,5%$); Diện tích pic $S = 3577,54\text{ mAU}\cdot\text{s}$ ($\text{RSD} = 0,1%$); Số đĩa lý thuyết $N = 17392$; Hệ số đối xứng $T_f = 1,08$; Độ phân giải $R_s = 11,64$.

Độ đặc hiệu: Mẫu dung môi không xuất hiện pic tại thời gian lưu của AM và AF. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn cho pic AM và AF trùng khớp về thời gian lưu và phổ hấp thụ UV so với dung dịch chuẩn. Hệ số tương đồng phổ (Match factor) đạt $0,9977$ đối với AM và $0,9997$ đối với AF (đều $> 0,99$).

Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ):

  • Acid maleic: $\text{LOD} = 0,03\ \mu\text{g/ml}$ ($S/N = 2,9$); $\text{LOQ} = 0,10\ \mu\text{g/ml}$ ($S/N = 11,6$).
  • Acid fumaric: $\text{LOD} = 0,03\ \mu\text{g/ml}$ ($S/N = 2,6$); $\text{LOQ} = 0,10\ \mu\text{g/ml}$ ($S/N = 9,6$).

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn:

  • Acid maleic: Tuyến tính trong khoảng $0,10 - 3,61\ \mu\text{g/ml}$, phương trình hồi quy $y = 65,885x - 4,877$, hệ số tương quan $r = 0,9999$, độ chệch tại các điểm trong khoảng $-7,5%$ đến $+2,4%$.
  • Acid fumaric: Tuyến tính trong khoảng $0,10 - 70,06\ \mu\text{g/ml}$, phương trình hồi quy $y = 71,563x - 1,074$, hệ số tương quan $r = 0,9999$, độ chệch tại các điểm trong khoảng $-1,8%$ đến $+4,4%$.

Độ đúng (Tỷ lệ thu hồi):

Hợp chất Nồng độ thêm vào ($\mu\text{g/ml}$) Tỷ lệ thu hồi trung bình (%) RSD (%) Tiêu chuẩn chấp nhận
Acid maleic $0,75$ $100,1$ $1,1$ $90,0 - 107,0%$; $\text{RSD} \le 5,3%$
$2,50$ $101,6$ $0,7$
$2,75$ $101,5$ $0,6$
Acid fumaric $15,0$ $102,5$ $1,1$ $95,0 - 105,0%$; $\text{RSD} \le 3,7%$
$50,0$ $101,1$ $0,4$
$55,0$ $100,6$ $0,1$

Độ chính xác:

  • Độ lặp lại ($n=6$): Hàm lượng AM trung bình là $0,0088%$, $\text{RSD} = 1,4%$; hàm lượng AF trung bình là $0,4427%$, $\text{RSD} = 0,7%$.
  • Độ chính xác trung gian (2 ngày, 2 kiểm nghiệm viên, tổng số $n=18$): Hàm lượng AM trung bình là $0,0088%$, $\text{RSD} = 0,9%$; hàm lượng AF trung bình là $0,4411%$, $\text{RSD} = 0,8%$.

3. Ứng dụng phân tích mẫu nguyên liệu thực tế

Phương pháp được ứng dụng để định lượng tạp chất trên lô nguyên liệu L-citrullin DL-malat (Số lô: C562305009, Jing Jing Pharmaceutical Co.), phân tích lặp lại 3 lần độc lập:

Lần thử Khối lượng cân mẫu (g) Hàm lượng Acid Maleic (%) Hàm lượng Acid Fumaric (%)
1 $0,2502$ $0,0099$ $0,4585$
2 $0,2503$ $0,0100$ $0,4647$
3 $0,2499$ $0,0101$ $0,4675$
Trung bình — $0,0100$ $0,4636$
Giới hạn quy định — $\le 0,025%$ $\le 0,5%$
Đánh giá — Đạt Đạt

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Chương 4 tổng kết các mục tiêu đã hoàn thành của khóa luận về việc thiết lập điều kiện sắc ký, xử lý mẫu, thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu kỹ thuật và ứng dụng phân tích mẫu thật. Tác giả nêu 2 đề xuất phục vụ công tác kiểm soát chất lượng thực tế.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  1. Thiết lập thành công quy trình phân tích đồng thời 2 tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu L-citrullin DL-malat bằng phương pháp HPLC-UV sử dụng cột thông dụng C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$), pha động gradient acetonitril - đệm $\text{KH}_2\text{PO}_4\ 3,3\text{ mM}$ điều chỉnh về pH 2,0 bằng acid phosphoric, phát hiện ở bước sóng $210\text{ nm}$.
  2. Thẩm định đầy đủ phương pháp theo tiêu chuẩn ASEAN và AOAC:
    • Giới hạn phát hiện ($\text{LOD} = 0,03\ \mu\text{g/ml}$) và giới hạn định lượng ($\text{LOQ} = 0,10\ \mu\text{g/ml}$) cho cả hai chất.
    • Khoảng tuyến tính rộng ($0,10 - 3,61\ \mu\text{g/ml}$ đối với AM và $0,10 - 70,06\ \mu\text{g/ml}$ đối với AF) với hệ số tương quan $r = 0,9999$.
    • Độ đúng cao với tỷ lệ thu hồi đạt $100,1 - 101,6%$ (AM) và $100,6 - 102,5%$ (AF).
    • Độ chính xác cao với $\text{RSD}$ trung gian đều $< 1,0%$ ($0,9%$ với AM và $0,8%$ với AF, $n=18$).
  3. Định lượng thực tế trên lô nguyên liệu CM của Jing Jing Pharmaceutical Co. (Số lô: C562305009) cho thấy hàm lượng AM là $0,0100%$ và AF là $0,4636%$, đều đáp ứng giới hạn an toàn đề xuất ($\text{AM} \le 0,025%$; $\text{AF} \le 0,5%$).

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Kiến nghị đưa chỉ tiêu giới hạn tạp chất acid maleic ($\le 0,025%$) và acid fumaric ($\le 0,5%$) vào tiêu chuẩn cơ sở để kiểm soát chất lượng nguyên liệu L-citrullin DL-malat dùng trong sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng.
  • Kiến nghị tăng cường số lượng lô nguyên liệu khảo sát từ các nhà sản xuất khác nhau nhằm đánh giá toàn diện hơn mức độ biến thiên tạp chất trên thị trường.

Đóng góp về mặt học thuật và thực tiễn

  • Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh quy trình định lượng tạp chất liên quan acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu L-citrullin DL-malat.
  • Cung cấp giải pháp phân tích kinh tế và khả thi khi sử dụng cột sắc ký pha đảo C18 thông dụng trong các phòng kiểm nghiệm thay vì các loại cột trao đổi ion chuyên dụng đắt tiền (như L17).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi ứng dụng thực tế mới chỉ thực hiện trên 01 lô nguyên liệu đơn lẻ của một nhà sản xuất (Jing Jing Pharmaceutical Co., số lô C562305009).
  • Đề tài tập trung kiểm soát 2 tạp chất có nguồn gốc từ phần acid malic (AM và AF), chưa mở rộng khảo sát các tạp chất liên quan phát sinh từ phần L-citrullin (như N-acetylornithin theo chuyên luận L-citrullin của USP 43).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Triển khai ứng dụng quy trình phân tích trên nhiều lô nguyên liệu CM từ các nhà cung cấp khác nhau trên thị trường để thẩm định tính đại diện.
  • Nghiên cứu tích hợp phương pháp phân tích đồng thời các tạp chất của cả hai phần cấu tử (L-citrullin và acid malic) trong cùng một quy trình kiểm nghiệm.
  • Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở hoàn chỉnh cho nguyên liệu L-citrullin DL-malat phục vụ đăng ký lưu hành và sản xuất.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên ngành Dược học, Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc: Cung cấp tài liệu tham khảo về quy trình tối ưu hóa điều kiện sắc ký HPLC pha đảo đối với các hợp chất acid hữu cơ phân cực mạnh có cấu trúc đồng phân hình học (cis-trans), cũng như cách thức thiết kế và báo cáo thực nghiệm thẩm định quy trình phân tích theo tiêu chuẩn ASEAN và AOAC.
  • Cán bộ kiểm nghiệm tại các trung tâm kiểm nghiệm, phòng kiểm tra chất lượng (QC) và nghiên cứu phát triển (R&D) của nhà máy dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Cung cấp quy trình phân tích cụ thể (thông số pha động, pH, chuẩn bị mẫu, công thức tính toán) có thể triển khai ngay trên các hệ thống HPLC-UV phổ biến mà không đòi hỏi đầu tư cột tách đặc thù.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn bước sóng phát hiện 210 nm thay vì cực đại 208 nm của acid fumaric?

Tác giả lựa chọn bước sóng $210\text{ nm}$ vì hai lý do: thứ nhất, acid maleic có cực đại hấp thụ tại $210\text{ nm}$ và có mức giới hạn quy định thấp hơn nhiều so với acid fumaric ($0,025%$ so với $0,5%$), do đó cần ưu tiên độ nhạy phát hiện cho acid maleic; thứ hai, bước sóng $210\text{ nm}$ giúp giảm thiểu hiện tượng nhiễu đường nền từ các tạp chất khác so với bước sóng thấp hơn ($208\text{ nm}$).

2. Giới hạn cho phép của acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrullin malat được xác định dựa trên căn cứ nào?

Do chưa có chuyên luận chính thức cho citrullin malat, giới hạn được tính toán dựa trên chuyên luận acid malic trong USP 43. Vì nguyên liệu citrullin malat có tỷ lệ phối hợp $1:1$ (acid malic chiếm $50%$ khối lượng), giới hạn cho phép của từng tạp chất trong CM được giảm một nửa so với trong acid malic: acid maleic quy định $\le 0,025%$ (so với $\le 0,05%$ trong acid malic) và acid fumaric quy định $\le 0,5%$ (so với $\le 1,0%$ trong acid malic).

3. Việc điều chỉnh pH đệm phosphat từ 2,3 xuống 2,0 có ý nghĩa gì đối với hiệu quả tách sắc ký?

Trong khảo sát ban đầu tại pH 2,3, pic của acid fumaric chưa tách được hoàn toàn khỏi pic tạp chất liền kề của nền mẫu CM ($R_s = 1,01$). Khi điều chỉnh pH đệm phosphat xuống 2,0, độ ion hóa của các acid phân tích thay đổi, giúp pic acid fumaric tách hoàn toàn khỏi các pic tạp nền phía trước với độ phân giải cao ($R_s = 3,2$), đồng thời pic acid maleic cũng đạt độ phân giải $R_s = 1,6$ và dạng pic cân đối ($T_f = 1,1$).

4. Kết quả định lượng trên lô nguyên liệu thực tế cho thấy hàm lượng tạp chất là bao nhiêu?

Phân tích thực nghiệm trên lô nguyên liệu L-citrullin DL-malat của hãng Jing Jing Pharmaceutical Co. (Số lô: C562305009) xác định hàm lượng trung bình của acid maleic là $0,0100%$ và acid fumaric là $0,4636%$. Cả hai giá trị này đều nằm trong giới hạn cho phép đề xuất ($\le 0,025%$ đối với AM và $\le 0,5%$ đối với AF).

5. Cột sắc ký và hệ pha động tối ưu được sử dụng trong quy trình cuối cùng là gì?

Quy trình sử dụng cột sắc ký pha đảo Shim-pack GIST C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$), rửa giải gradient với pha động gồm Acetonitril (kênh A) và đệm $\text{KH}_2\text{PO}_4\ 3,3\text{ mM}$ chỉnh pH 2,0 bằng $\text{H}_3\text{PO}_4$ (kênh B): từ $0 - 10\text{ phút}$ giữ $1%\text{ A}$, từ $10 - 15\text{ phút}$ tăng tuyến tính lên $25%\text{ A}$, và từ $15 - 22\text{ phút}$ giữ ổn định $25%\text{ A}$, tốc độ dòng $0,8\text{ ml/phút}$ ở $25^\circ\text{C}$.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Hoàng Thị Loan đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-UV) dùng cột pha đảo C18 để xác định đồng thời hai tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu L-citrullin DL-malat. Quy trình phân tích đạt đầy đủ các tiêu chuẩn thẩm định khắt khe theo hướng dẫn của ASEAN và AOAC về độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đúng và độ chính xác. Phương pháp đã được áp dụng thành công để kiểm nghiệm chất lượng trên lô nguyên liệu thực tế, cung cấp cơ sở khoa học tin cậy cho việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và kiểm soát an toàn cho các chế phẩm chứa citrullin malat tại Việt Nam.