Xác định Biotin bằng HPLC và Cột ái lực miễn dịch - Khóa luận Trần Thị Mai Hoa

Khóa luận Dược sĩ xây dựng phương pháp xác định biotin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp cột ái lực miễn dịch.

• Tác giả: Trần Thị Mai Hoa
• Người hướng dẫn: Vũ Thị Trang
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Biotin trong thực phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết hợp với làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Biotin và tầm quan trọng xác định hàm lượng

Biotin là một vitamin B hòa tan trong nước, còn được gọi là vitamin B7 hoặc vitamin H, đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong các quá trình chuyển hóa năng lượng và duy trì sức khỏe tóc, da, móng và hệ thần kinh. Xác định hàm lượng biotin trong thực phẩm là một yêu cầu thiết yếu để đảm bảo chất lượng các sản phẩm dinh dưỡng và thực phẩm chức năng trên thị trường. Phương pháp phân tích cần đạt tiêu chuẩn quốc tế về độ chính xác, độ lặp lại và khả năng phát hiện. Việc lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp giúp kiểm soát chất lượng hiệu quả, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và tuân thủ các quy định pháp luật về kiểm nghiệm thực phẩm.

1.1. Tính chất và vai trò của Biotin

Biotin là một coenzyme thiết yếu cho sự hoạt động của các carboxylase, tham gia vào quá trình tổng hợp axit béo, glucose và amino acid. Hàm lượng biotin không đủ có thể dẫn đến các vấn đề về da, tóc yếu và rối loạn chuyển hóa. Sinh vật sống không thể tự tổng hợp biotin, nên phải lấy từ thực phẩm hoặc thực phẩm bổ sung.

1.2. Nhu cầu khuyến cáo và nguồn cung cấp

Lượng hấp thụ đầy đủ (AI) của biotin theo khuyến cáo là 30 µg/ngày cho người trưởng thành. Các nguồn thực phẩm giàu biotin bao gồm trứng, cá hồi, thịt nạc, các loại hạt, rau xanh và nấm. Xác định chính xác hàm lượng biotin giúp người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng cá nhân.

II. Phương pháp HPLC PDA xác định Biotin

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với detector mảng diod (PDA) là phương pháp tiêu chuẩn quốc tế được công nhận bởi AOAC để xác định hàm lượng biotin trong thực phẩm. Phương pháp này cung cấp độ chính xác cao, khả năng phân tách tốt và giới hạn phát hiện thấp. HPLC-PDA cho phép phát hiện và định lượng biotin với độ nhạy cao thông qua đo hấp thụ tia UV-Vis. Detector PDA có khả năng ghi lại phổ tại nhiều bước sóng khác nhau, giúp xác minh sạch mẫu và độ chân thực của tín hiệu. Phương pháp này được khuyến nghị cho kiểm nghiệm các sản phẩm dinh dưỡng chất lượng cao.

2.1. Nguyên lý hoạt động HPLC PDA

HPLC hoạt động dựa trên nguyên lý phân tách các hợp chất trong pha động (chất lỏng) qua một cột chứa pha tĩnh (hạt nhỏ). Biotin được phân tách theo độ ái lực khác nhau với các hợp chất trong mẫu. Detector PDA đo cường độ hấp thụ ánh sáng của biotin tại các bước sóng cụ thể, tạo ra tín hiệu tỷ lệ với nồng độ biotin trong mẫu.

2.2. Ưu điểm của phương pháp HPLC PDA

Phương pháp HPLC-PDA mang lại độ chính xác cao, độ lặp lại tốt (RSD < 5%), thời gian phân tích nhanh (khoảng 15-20 phút), có thể xác định biotin ở nồng độ rất thấp (LOD < 0.1 µg/mL). Phương pháp này không yêu cầu điều kiện đặc biệt phức tạp và phù hợp cho kiểm nghiệm hàng loạt.

III. Chuẩn bị mẫu bằng cột ái lực miễn dịch IAC

Cột ái lực miễn dịch (IAC) là công nghệ tiên tiến nhất để làm sạch mẫu trước khi phân tích biotin bằng HPLC. Cột IAC chứa các kháng thể đặc hiệu gắn với biotin, giúp loại bỏ các chất nhiễu từ mẫu thực phẩm phức tạp. Quy trình làm sạch bằng IAC giúp tăng độ chính xác và độ lặp lại của phép đo, đồng thời giảm thời gian phân tích. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả cho các mẫu thực phẩm có thành phần phức tạp như sữa bột, thực phẩm bổ sung và các sản phẩm dinh dưỡng đặc biệt. Việc kết hợp IAC với HPLC-PDA tạo thành một hệ thống phân tích toàn diện, được các cơ quan kiểm nghiệm quốc tế khuyên dùng.

3.1. Nguyên lý hoạt động cột IAC

Cột ái lực miễn dịch hoạt động dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa các kháng thể với biotin. Khi dung dịch mẫu đi qua cột IAC, biotin sẽ bị giữ lại trong khi các tạp chất khác đi qua. Sau đó, bằng việc sử dụng dung dịch lỏi thích hợp, biotin được rửa trôi ra khỏi cột IAC ở dạng nồng độ cao, sạch tạp chất.

3.2. Quy trình xử lý mẫu với IAC

Mẫu thực phẩm được chiết bằng dung dịch đệm phosphat ở pH thích hợp để giải phóng biotin từ mẫu. Sau đó, dung dịch được đưa qua cột ái lực miễn dịch để làm sạch. Eluate thu được sau cột IAC sẽ được phân tích bằng HPLC-PDA. Quy trình này giúp cải thiện đáng kể độ sạch của mẫu so với các phương pháp truyền thống.

IV. Thẩm định phương pháp và ứng dụng thực tiễn

Thẩm định phương pháp HPLC-PDA kết hợp IAC bao gồm các thông số quan trọng như độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ chính xác và độ ổn định. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đạt tiêu chuẩn quốc tế với hệ số tương quan R² > 0.99, RSD < 5%, độ phục hồi từ 95-105%. Phương pháp này đã được ứng dụng thành công để xác định hàm lượng biotin trong nhiều sản phẩm thực phẩm dinh dưỡng và thực phẩm chức năng trên thị trường Việt Nam. Các kết quả phân tích cho thấy hàm lượng biotin trong các sản phẩm có sự biến động, một số sản phẩm có hàm lượng thấp hơn so với khai báo trên nhãn, yêu cầu kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt hơn.

4.1. Các thông số thẩm định quan trọng

Độ tuyến tính được xác định trong khoảng nồng độ 0.1-10 µg/mL với R² > 0.99. Giới hạn phát hiện (LOD) khoảng 0.05 µg/mL, giới hạn định lượng (LOQ) khoảng 0.15 µg/mL. Độ lặp lại và độ chính xác trung gian đều đạt RSD < 5%. Độ ổn định hệ thống được kiểm tra định kỳ để đảm bảo độ tin cậy của kết quả phân tích.

4.2. Ứng dụng trong kiểm nghiệm thực phẩm

Phương pháp HPLC-PDA kết hợp IAC được ứng dụng để xác định biotin trong sữa bột, thực phẩm bổ sung, các sản phẩm dành cho phụ nữ mang thai, cho con bú. Kết quả phân tích giúp các nhà sản xuất kiểm soát chất lượng, và các cơ quan quản lý có cơ sở để giám sát sản phẩm trên thị trường, bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Biotin hay còn gọi là vitamin B7, vitamin H được sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng và thực phẩm chức năng do vai trò thiết yếu của nó đối với sức khỏe con người. Chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh học của cơ thể, bao gồm chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein [1] [2]. Biotin đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của cơ thể, giúp duy trì sức khỏe của da, tóc và móng. Thiếu hụt biotin có thể dẫn đến các vấn đề như rụng tóc, viêm da, suy giảm chức năng thần kinh và một số vấn đề khác.

Do đó, việc bổ sung biotin thông qua các loại thực phẩm và thực phẩm bổ sung là cần thiết để duy trì sức khỏe toàn diện. Hiện nay, việc xác định hàm lượng biotin trong các sản phẩm dinh dưỡng vẫn còn gặp nhiều thách thức do nồng độ biotin thường rất thấp, nền mẫu phức tạp và quy trình phân tích đòi hỏi nhiều kỹ thuật. Phương pháp AOAC 2016.02, sử dụng cột ái lực miễn dịch kết hợp với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), được xem là một trong những phương pháp chính xác và nhạy nhất để định lượng biotin [3]. Cột ái lực miễn dịch giúp tách chọn lọc và làm giàu biotin, đảm bảo độ chính xác cao ngay cả trong các nền mẫu phức tạp và có hàm lượng biotin thấp.

Trong khi đó, HPLC cung cấp khả năng phân giải cao, độ nhạy tốt và độ chính xác vượt trội, giúp xác định hàm lượng biotin một cách nhanh chóng và đáng tin cậy. Tuy nhiên quy trình này chưa thực sự tối ưu vì thời gian xử lý mẫu dài và khó áp dụng rộng rãi bởi sử dụng cột sắc ký chuyên biệt (cột Kinetex Phenyl-Hexyl). Nghiên cứu này nhằm cải tiến phương pháp AOAC 2016.02 để đơn giản hóa quy trình và dễ áp dụng hơn tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Việc tối ưu hóa phương pháp định lượng biotin không chỉ giúp nâng cao hiệu quả phân tích mà còn tạo nền tảng vững chắc cho việc kiểm soát chất lượng, đảm bảo độ chính xác của hàm lượng biotin trong các sản phẩm trên thị trường, góp phần nâng cao sức khỏe người tiêu dùng.

Vì vậy, đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng biotin trong thực phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết hợp với làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch” được nghiên cứu và thực hiện với mục đích sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng biotin trong thực phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch 2. Ứng dụng phương pháp xây dựng xác định hàm lượng biotin trong một số sản phẩm dinh dưỡng trên thị trường.1 Tổng quan về biotin Biotin (thường gọi là vitamin B7 hay vitamin H) là một hợp chất dị vòng gồm vòng imidazolidon nối với một vòng tetrahydrothiophen gắn với gốc acid valeric. Biotin được cấu tạo bởi 3 carbon bất đối do đó tồn tại 8 đồng phân lập thể, trong đó chỉ có một đồng phân biotin được tìm thấy trong tự nhiên và có hoạt tính sinh học là D(+)biotin [3] [4] [5].

Trong cơ thể, biotin là một cofactor thiết yếu cho năm loại carboxylase là propionyl-CoA carboxylase, pyruvate carboxylase, methylcrotonyl-CoA carboxylase, acetyl-CoA carboxylase 1 và acetyl-CoA carboxylase 2; tham gia vào nhiều phản ứng chuyển hóa của cơ thể để tạo ra glucose, acid béo và protein [2] [6] [7] [8].1 Tổng quan về biotin Một số đặc điểm và tính chất vật lý, hoá học của biotin được thể hiện trong Bảng 1.1 Tổng quan về Biotin Công thức cấu tạo CTPT C10H16N2O3S Tên thường gọi biotin; d-biotin; vitamin H; vitamin B7; bioepiderm; coenzyme R; Bios II Tên IUPAC 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a- hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid CAS 58-85-5 Khối lượng phân tử 244,31 g/mol 2 Bảng 1.2 Tính chất vật lý, hóa học Biotin Cảm quan Bột tinh thể màu trắng Điểm nóng chảy 232 °C Độ tan trong nước 220 mg/L (ở 25 °C) LogP 0,3 pKa 4,5 1.2 Tác dụng đối với cơ thể Biotin là một vitamin tan trong nước, đóng vai trò thiết yếu cho cơ thể con người. Tên gọi "biotin" xuất phát từ tiếng Hy Lạp "biotos", mang ý nghĩa là "nuôi dưỡng" hoặc "ban sự sống" [9] phần nào thể hiện tầm quan trọng của loại vitamin này đối với cơ thể. Biotin có nhiều tác dụng sinh học quan trọng, bao gồm: Biotin hỗ trợ chuyển hóa năng lượng. Biotin tham gia vào quá trình chuyển đổi thức ăn thành năng lượng, kích hoạt các enzym xúc tác các phản ứng quan trọng trong quá trình tân tạo glucose, tổng hợp axit béo và phân hủy axit amin.

Ngoài ra, biotin cũng có thể đóng vai trò trong quá trình tổng hợp protein từ ADN, ARN và điều hòa hoạt động enzyme gan [10] [2]. Biotin hỗ trợ sức khỏe da, tóc và móng. Biotin còn được gọi là vitamin H: "H" xuất phát từ các từ tiếng Đức , "Haar" và "Haut" có nghĩa là tóc và da, phản ánh vai trò quan trọng của nó trong việc duy trì sức khỏe của tóc và da. Ở tóc, việc bổ sung biotin giúp tóc chắc khỏe giảm thiểu tình trạng rụng tóc, gãy tóc và chẻ ngọn.

Đối với da, thiếu hụt biotin có thể gặp các vấn đề về da, bao gồm phát ban đỏ, có vảy. Ảnh hưởng của vitamin trên da có thể bắt nguồn từ tác dụng của nó đối với quá trình chuyển hóa chất béo - điều này rất quan trọng để duy trì làn da khỏe mạnh và quá trình đó có thể bị suy giảm ở những người có hàm lượng biotin thấp [10] [11]. Tình trạng chẻ móng, giòn móng được cải thiện khi bổ sung đầy đủ biotin từ đó giúp móng tay dày, cứng và dài hơn. Mặc dù cho đến nay các nghiên cứu đã cho thấy bằng chứng chắc chắn việc thiếu hụt biotin có thể dẫn đến tình trạng rụng tóc và các vấn đề về da, móng; tuy nhiên bằng chứng về việc bổ sung biotin giúp tăng sức khỏe da, tóc, mòng ở người khỏe mạnh bình thường vẫn chưa đầy đủ [2] [9] [12] [13].

Bổ sung biotin hợp lý có thể giúp giảm nguy cơ dị tật bẩm sinh. Trong thai kỳ, tình trạng thiếu hụt biotin nhẹ thường xảy ra mà không gây ra triệu chứng rõ ràng ở người mẹ. Tuy nhiên, điều này có thể làm tăng nguy cơ dị tật bẩm sinh như hở hàm ếch và bất thường về chi ở thai nhi [14]. 3 Biotin có thể hỗ trợ kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường type 1 và 2.

Thiếu hụt biotin làm gián đoạn quá trình điều chỉnh lượng đường trong máu. Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng việc bổ sung biotin kết hợp với crom piccolinat có thể giúp chuột mắc bệnh tiểu đường loại 2 giảm hấp thu glucose đáng kể, đồng thời ngăn ngừa sự phát triển của tình trạng kháng insulin bằng cách tăng cường vận chuyển glucose thông qua protein GLUT4 [15] [16]. Một nghiên cứu khác năm 2016 [17], chỉ ra biotin liều cao có tiềm năng trong việc điều trị bệnh tiểu đường loại 1, cải thiện kiểm soát đường huyết và ngăn ngừa hay kiểm soát một số biến chứng bệnh tiểu đường [10]. Biotin có thể giảm đau, giảm tổn thương thần kinh ở những người mắc bệnh tiểu đường hoặc những người bệnh thận phải lọc máu.

Nghiên cứu [18] đã chỉ ra sử dụng biotin ngay sau chấn thương thần kinh, và trong một khoảng thời gian đủ, có thể cải thiện hành tình trạng đau của cơn đau thần kinh. Biotin hỗ trợ điều trị bệnh đa xơ cứng (Multiple Sclerosis-MS). Đây là một bệnh tự miễn ảnh hưởng đến hệ thần kinh gây yếu cơ và nhiều vấn đề khác. Ở người mắc bệnh, hệ thống miễn dịch bị đánh lừa nên tấn công và làm hỏng lớp phủ bảo vệ (myelin) của các sợi thần kinh trong não, tủy sống và mắt.

Trong khi đó, biotin có vai trò quan trọng trong việc kích thích các enzym sản xuất myelin giúp làm chậm tiến trình của bệnh [19].3 Nguồn cung cấp biotin. Tuy nhiên, mức độ hấp thụ biotin từ hệ vi sinh vật đường ruột vẫn chưa được xác định rõ ràng, và phần lớn biotin cần thiết vẫn phải được cung cấp từ chế độ ăn uống hàng ngày [23]. Các nguồn thực phẩm giàu biotin bao gồm thịt nội tạng (gan, thận), lòng đỏ trứng, cá, các loại hạt như hạnh nhân, đậu phộng, hạt hướng dương, và một số rau củ như khoai lang, rau bina và bông cải xanh [2]. Trong đó, gan động vật, đặc biệt là gan bò, có hàm lượng biotin cao nhất, với 187,2 µg biotin trên mỗi 100 g, đáp ứng hơn 600% nhu cầu hàng ngày.

Lòng đỏ trứng cũng là một nguồn cung cấp biotin dồi dào với khoảng 10 µg biotin trong mỗi quả trứng nấu chín, chiếm khoảng 33% nhu cầu hàng ngày [24]. Đảm bảo bổ sung đủ biotin từ thực phẩm giúp hỗ trợ quá trình chuyển hóa và duy trì sức khỏe tổng thể. Biotin không chỉ có trong thực phẩm tự nhiên mà còn được bổ sung vào nhiều sản phẩm bổ sung, đặc biệt là sữa bột. Sữa bột dành cho trẻ em, phụ nữ mang thai và người cao tuổi thường được tăng cường biotin để hỗ trợ quá trình chuyển hóa năng lượng, duy 4 trì sức khỏe da, tóc, móng và hỗ trợ chức năng thần kinh.

Hàm lượng biotin trong sữa bột có thể dao động tùy theo công thức, nhưng thường được điều chỉnh để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của từng nhóm đối tượng. Ví dụ, sữa công thức cho trẻ sơ sinh có thể chứa biotin để hỗ trợ sự phát triển toàn diện, trong khi sữa dành cho người cao tuổi có thể giúp duy trì sức khỏe thần kinh và giảm nguy cơ tổn thương thần kinh [18]. Ngoài ra, biotin cũng được bổ sung vào sữa bột dành cho bệnh nhân tiểu đường để hỗ trợ kiểm soát đường huyết và giảm nguy cơ biến chứng thần kinh [10]. Việc lựa chọn sản phẩm có bổ sung biotin phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng của từng đối tượng là rất quan trọng để tối ưu hóa lợi ích sức khỏe.4 Tình trạng thiếu hoặc thừa biotin Tình trạng thiếu hụt biotin rất hiếm khi xảy ra ở những người khỏe mạnh ăn chế độ ăn đa dạng bình thường [24].

Người nghiện rượu có khả năng thiếu hụt biotin cao hơn bởi rượu có thể ngăn chặn sự hấp thụ của biotin và nhiều chất dinh dưỡng khác, và cũng vì lạm dụng rượu thường liên quan đến chế độ ăn uống kém. Khoảng một phần ba phụ nữ mang thai bị thiếu hụt biotin nhẹ mặc dù ăn đủ lượng và lý do chính xác của điều này vẫn chưa được xác định. Dấu hiệu thiếu hụt biotin bao gồm rụng tóc, kèm theo phát ban đỏ có vảy xuất hiện quanh mắt, mũi, miệng và vùng sinh dục.