Khóa luận: Hoàn thiện tách chiết Metagenomics DNA và khuếch đại gen Laccase

Khóa luận hoàn thiện phương pháp tách chiết metagenomics DNA từ đất rừng. Nghiên cứu xác định hoạt tính và thử khuếch đại gen quy định enzyme laccase.

• Tác giả: La Tuấn Đại
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Quốc Khánh
• Trường học: Đại học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Vi Sinh
• Đề tài: Hoàn thiện phương pháp tách chiết Metagenomics DNA, xác định hoạt tính và thử khuếch đại gen quy định Laccase từ đất rừng
• Loại tài liệu: Báo cáo khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: TP.HCM

Tóm tắt

I. Khái niệm và tầm quan trọng của Metagenomics DNA

Metagenomics DNA là một phương pháp tiên tiến trong sinh học phân tử, cho phép tách chiết và phân析 toàn bộ vật liệu di truyền từ các mẫu môi trường mà không cần nuôi cấy vi sinh vật. Trong bối cảnh các nghiên cứu về gen Laccase từ đất rừng, metagenomics đóng vai trò quan trọng trong việc khám phá các gen mới và hiểu rõ hơn về đa dạng sinh học vi khuẩn. Phương pháp này giúp các nhà khoa học truy cập vào tài nguyên di truyền khổng lồ từ môi trường tự nhiên, mở ra những cơ hội mới cho phát triển công nghệ sinh học ứng dụng. Đất rừng, đặc biệt là đất rừng Nam Cát Tiên và rừng ngập mặn Cần Giờ, chứa đựng một cộng đồng vi sinh vật phong phú với tiềm năng tạo ra các enzyme có giá trị công nghiệp cao như Laccase.

1.1. Định nghĩa Metagenomics và các bước cơ bản

Metagenomics là kỹ thuật phân tích toàn bộ bộ gene từ một mẫu môi trường phức tạp. Quá trình bao gồm: (1) tách chiết Genomic DNA từ đất, (2) tinh sạch DNA bằng phương pháp khoét giếng hoặc các kỹ thuật tiên tiến, (3) khảo sát các yếu tố ảnh hưởng như nồng độ SDS và thời gian ủ proteinase K, (4) xác định hoạt tính enzyme thông qua đo OD260 và OD280, (5) khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR để phát hiện các gen mã hóa Laccase.

1.2. Tầm quan trọng của tách chiết DNA từ môi trường tự nhiên

Việc tách chiết DNA từ đất rừng giúp khám phá các vi sinh vật chưa được biết đến và các gen chức năng như gen quy định Laccase. Phương pháp này vượt qua giới hạn của nuôi cấy truyền thống, cho phép tiếp cận 99% vi khuẩn trong tự nhiên không thể nuôi trong phòng thí nghiệm. Hoạt tính enzyme Laccase được xác định thông qua các mẫu đất khác nhau, cung cấp dữ liệu quý báu cho việc phát triển các enzyme tái tổ hợp có ứng dụng trong công nghiệp giấy, nhuộm và xử lý chất thải.

II. Phương pháp tách chiết và tinh sạch Metagenomics DNA

Phương pháp tách chiết Metagenomics DNA từ đất rừng là bước quan trọng nhất trong nghiên cứu gen Laccase. Quá trình bắt đầu với việc lấy mẫu từ đất rừng Nam Cát Tiên ở các độ sâu khác nhau và rừng ngập mặn Cần Giờ, tiếp theo là tách chiết Genomic DNA theo Protocol chuẩn sử dụng các hóa chất như CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) và SDS (Sodium dodecyl sulfate). Sau đó, DNA được tinh sạch bằng phương pháp khoét giếng để loại bỏ các tạp chất protein và polysaccharide. Quá trình này yêu cầu khảo sát các yếu tố như nồng độ SDS, thời gian ủ proteinase K, và sử dụng lysozyme để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn. Kết quả hàm lượng DNA được xác định bằng cách đo quang mật độ OD260 và OD280, từ đó tính toán hàm lượng trong 5g mẫu đất.

2.1. Quy trình tách chiết DNA theo Protocol chuẩn

Tách chiết Genomic DNA từ đất rừng tuân theo quy trình chuẩn với các bước: (1) Chuẩn bị mẫu đất từ Nam Cát Tiên và Cần Giờ, (2) Lysis tế bào bằng SDS và proteinase K, (3) Khuếch đại quá trình phá vỡ với lysozyme, (4) Sử dụng EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) để bảo vệ DNA, (5) Kết tủa DNA bằng isopropanol hoặc ethanol. Việc tối ưu nồng độ SDS và thời gian ủ là chìa khóa để đạt được hàm lượng DNA cao nhất.

2.2. Tinh sạch DNA và xác định chất lượng

Tinh sạch DNA bằng phương pháp khoét giếng loại bỏ các tạp chất và nâng cao độ tinh khiết. Chất lượng DNA được đánh giá qua các chỉ số OD260/OD280 tối ưu (1.8-1.9), cho biết DNA có bị ô nhiễm protein hay không. Việc khảo sát các yếu tố như thời gian ủ SDS, nồng độ SDS khác nhau giúp xác định điều kiện tối ưu nhất cho tách chiết DNA từ các loại đất rừng khác nhau, từ đó cải thiện hiệu suất nhận được DNA chất lượng cao phục vụ cho khuếch đại gen Laccase.

III. Xác định hoạt tính enzyme Laccase trong mẫu đất

Xác định hoạt tính enzyme Laccase là bước then chốt để đánh giá tiềm năng vi sinh vật trong đất rừng. Enzyme Laccase là một oxidase có chứa copper, được sản xuất bởi nhiều vi khuẩn và nấm trong tự nhiên. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Laccase sử dụng ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) như là chất cơ chất, và đo sự thay đổi quang mật độ tại bước sóng cụ thể. Hoạt tính enzyme Laccase được tính toán dựa trên tốc độ tạo thành sản phẩm trong thời gian phản ứng. Các mẫu đất từ Nam Cát Tiên và rừng ngập mặn Cần Giờ ở các độ sâu khác nhau cho thấy hoạt tính enzyme khác nhau, phản ánh sự khác biệt trong cộng đồng vi sinh vật và điều kiện môi trường.

3.1. Cấu trúc và cơ chế xúc tác của Laccase

Cơ chế xúc tác của Laccase liên quan đến trung tâm hoạt động chứa 4 nguyên tử copper. Cơ chế xúc tác diễn ra qua nhiều bước: (1) Liên kết chất cơ chất vào trung tâm hoạt động, (2) Chuyển electron từ chất cơ chất sang copper, (3) Khử oxi thành nước. Laccase có khả năng xúc tác oxy hóa một loạt các chất, bao gồm các chất thải dye, phenols, và các hợp chất lignin. Tính chất hóa sinh của Laccase làm cho nó trở thành một công cụ lý tưởng cho các ứng dụng công nghiệp như xử lý nước thải và sản xuất giấy.

3.2. Ứng dụng của Laccase và ý nghĩa công nghiệp

Ứng dụng của Laccase rất đa dạng trong công nghiệp hiện đại. Enzyme Laccase được sử dụng trong: (1) Công nghiệp giấy để tẩy trắng và cải thiện tính chất sợi, (2) Xử lý nước thải để phân hủy các chất gây ô nhiễm, (3) Công nghiệp dệt để điều khiển màu sắc. Việc khám phá gen quy định Laccase từ metagenomics đất rừng mở ra cơ hội để tạo ra enzyme tái tổ hợp với các tính chất cải thiện, giúp tối ưu hóa các ứng dụng công nghiệp này.

IV. Kỹ thuật khuếch đại gen Laccase bằng PCR

Khuếch đại gen quy định Laccase bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là bước tiếp theo sau khi tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu đất rừng. Quá trình PCR sử dụng các cặp primer đặc hiệu được thiết kế dựa trên các gen Laccase đã biết từ các vi sinh vật khác. Khuếch đại gen bao gồm 30-35 chu kỳ với các bước: biến tính DNA ở 94°C, gắn primer ở 55-60°C, và kéo dài chuỗi ở 72°C. Sau PCR, các sản phẩm được kiểm tra bằng điện di gel agarose để xác nhận kích thước và độ tinh khiết của gen Laccase được khuếch đại. Các gen được phát hiện này có thể được sử dụng để tạo dòng và tạo ra enzyme tái tổ hợp cho mục đích nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp.

4.1. Thiết kế primer và điều kiện PCR tối ưu

Thiết kế primer cho khuếch đại gen Laccase dựa trên các gen Laccase được công bố từ các vi khuẩn như Marinobacter hydrocarbonoclasticus. Primer phải được thiết kế để có độ chuyên biệt cao và tránh sự sai khớp không mong muốn. Điều kiện PCR bao gồm: (1) Biến tính ở 94°C trong 30 giây, (2) Gắn primer ở 55-58°C trong 30 giây tùy theo Tm của primer, (3) Kéo dài ở 72°C trong 1-2 phút tùy theo kích thước gen cần khuếch đại. Tối ưu hóa nồng độ Mg2+, nồng độ dNTPs, và số chu kỳ PCR là quan trọng để đạt hiệu suất khuếch đại cao nhất.

4.2. Xác nhận kết quả và phía tới ứng dụng

Kết quả PCR được xác nhận bằng điện di gel agarose 1-1.5% để quan sát các băng DNA tương ứng với gen Laccase được khuếch đại. Phía tới ứng dụng của gen Laccase bao gồm: (1) Xác định chủng vi sinh vật sản xuất Laccase thông qua sắc ký gen và phân tích chuỗi, (2) Tạo dòng gen vào các plasmid biểu hiện để tạo ra enzyme tái tổ hợp, (3) Khảo sát đặc tính của enzyme Laccase tái tổ hợp và tiên lợi công nghiệp của nó trong các ứng dụng công nghiệp thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Đất rừng là một hệ sinh thái tự nhiên có tính đa dạng sinh học cao chứa rất nhiều vi sinh vật. Hệ vi sinh vật trong đất có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme được ứng dụng rộng rãi trong cuộc sống. Nguồn gen từ hệ vi sinh vật này trong đất là rất lớn và việc khai thác nguồn gen này hiện đang là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng. Việc tách chiết và tinh sạch DNA từ hệ vi sinh vật này là bước khởi đầu cơ bản để thu nhận được nguồn gen qua đó có thể tổng hợp protein tái tổ hợp để sản xuất enzyme.

Quá trình tách chiết DNA thường trải qua nhiều bước, qua mỗi bước thì lượng DNA lại giảm hoặc có thể bị đứt gãy. Việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết DNA sẽ giúp tăng hàm lượng cũng như độ tinh sạch DNA thu được Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học đặc biệt trong lĩnh vực sinh học phân tử, bằng công nghệ protein tái tổ hợp đã sản xuất được các enzyme có hoạt tính sinh học cao nhờ đó đã thay thế phần nào các enzyme hóa học nên đã hạn chế được các chất thải ra môi trường. Các enzyme được sử dụng rộng rãi do có nhiều ưu điểm nổi bật: hoạt động được ở nhiệt độ và áp suất thấp, có thể hoạt động trong môi trường kiềm hoặc acid mạnh. Cùng với các enzyme như protease, lipase, cellulose,…laccase cũng là một enzyme đã được sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp.

Enzyme laccase có thể phân hủy các hợp chất có chứa phenol nên rất hữu hiệu trong việc phân hủy các chất thải của các quá trình sản xuất khác nhau như hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ,…thuốc trừ sâu như DDT góp phần bảo vệ cho môi trường. Việc xác định hoạt tính enzyme laccase từ đất sẽ giúp đánh giá về hàm lượng enzyme này trong đất từ đó hướng tới việc ứng dụng nguồn gen quy định enzyme này để sản xuất trong công nghiệp. Trong giới hạn của đề tài này tôi đã tiến hành “Hoàn thiện phương pháp tách chiết metagenomic DNA, xác định hoạt tính và thử khuếch đại gen quy định laccase từ đất rừng”. Nội dung của đề tài như sau: 6 ➢ Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu đất rừng ➢ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết DNA như: thời gian ủ và nồng độ SDS, thời gian ủ proteinase K, so sánh tác động giữa enzyme proteinase K và lysozyme ➢ Xác định hoạt tính enzyme laccase ➢ Khuếch đại gen quy định enzyme laccase dựa vào trình tự 16s rDNA 7 PHẦN 1: TỔNG QUAN 8 I.

METAGENOMICS LÀ GÌ ? Metagenomics là ngành nghiên cứu về metagenome, vật liệu di truyền được thu nhận một cách trực tiếp từ mẫu môi trường thay vì nuôi cấy. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng chỉ có 0,001-0,1% của tổng số vi khuẩn trong nước biển, 0,25% trong nước ngọt, 0,25% trong trầm tích và chỉ 0,3% vi sinh vật đất là có thể nuôi cấy được trong ống nghiệm, còn lại là không thể nuôi cấy được[2]. Nghiên cứu về metagenomics giúp cho việc nuôi cấy các vi sinh vật từ các môi trường trở nên dễ dàng hơn và có thể ứng dụng chúng trong việc phát triển các sản phẩm mới. Hiện nay việc nghiên cứu metagenomics phát triển mạnh do đã tạo ra được các vector tạo dòng hiệu quả như chromosomes nhân tạo của vi khuẩn (BACs), cosmids [26] cho phép ta tạo dòng và biểu hiện một lượng lớn các đoạn DNA phức tạp, nhờ đó tạo được thư viện metagenome chứa toàn bộ DNA của vi sinh vật lấy từ môi trường nghiên cứu 2.

CÁC ỨNG DỤNG CỦA METAGENOMICS Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất thải, tạo ra các loại thuốc mới, sản xuất các nhựa thân thiện với môi trường, hoặc thậm chí được dùng làm thức ăn. Nghiên cứu về metagenomics có thể cải thiện các chiến lược để theo dõi ảnh hưởng của các chất gây ô nhiễm trên các hệ sinh thái và từ đó có các biện pháp thích hợp để xử lý môi trường. Việc thu nhận được nguồn gen từ những vi sinh vật không nuôi cấy được đã dẫn đến sự phát hiện ra các gen mới, các enzyme và các sản phẩm mới từ đó tác động đến sự phát triển trong các lĩnh vực hóa chất, nông nghiệp và dược phẩm. Khám phá ra những enzyme mới cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học, hoặc hỗ trợ việc tìm hiểu động lực học của quần thể vi sinh vật ảnh hưởng tới sự lây lan nguồn bệnh, vệ sinh an toàn thực phẩm, hiệu quả thức ăn và sự thải khí nhà kính.

Một số ứng dụng cụ thể của metagenomics: 2.1 Thuốc kháng sinh và dược phẩm Nguồn genome từ đất là tiềm năng to lớn tác động đến việc sản xuất thuốc đặc biệt là thuốc kháng sinh. Một dòng được phát hiện trong thư viện metagenomics từ đất sản xuất được deoxyviolacein và kháng sinh phổ rộng 9 violacein [4]. Thư viện metagenomics cũng được dùng để tách các gen đề kháng với các thuốc kháng sinh tự nhiên 2.2 Oxidoreductases/dehydrogenases Một nghiên cứu metagenomics về sự đa dạng của vi khuẩn trong môi trường có khả năng sử dụng 4-hydroxybutyrate đã phát hiện ra 5 dòng biểu hiện được enzyme 4-hydroxybutyrate dehydrogenase dưới dạng hoạt động [10]. Chất xúc tác sinh học alcohol oxidoreductases có khả năng oxy hóa những chuỗi polyols ngắn rất hữu ích trong công nghiệp dùng để sản xuất các ester chiral hydroxyl, hydroxyl acid, amino acid và cồn [13] 2.3 Amidases Trong một nghiên cứu về sự sàng lọc thư viện metagenomics từ đất đã phát hiện ra một dòng amidase dương tính [22].

Amidase được dùng trong sinh tổng hợp các kháng sinh β-lactam. Một phương pháp nghiên cứu chuyên biệt về amidases bằng cách làm giàu metagenome từ đất đã phát hiện ra 7 dòng amidase dương tính, một trong số đó mã hóa cho enzyme penicillin acylase [9] 2.4 Sinh tổng hợp Vitamin Nghiên cứu về metagenomic từ đất đã được áp dụng để tìm kiếm các gen mới mã hóa tổng hợp các Vitamin như biotin [9]. 7 cosmid đã được phát hiện trong thư viện metagenomics sau khi làm giàu avidin từ các mẫu môi trường và trong nghiên cứu này đã phát hiện ra một cosmid thu được từ đất rừng sản xuất được lượng biotin cao nhất [9] 2.5 Giảm mạch polysaccharide/biến đổi enzyme/gen thủy phân tinh bột: Cellulase có rất nhiều ứng dụng trong các nghành công nghiệp: hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, bia rượu, thức ăn chăn nuôi, dệt may và quần áo, giấy và bột giấy, nông nghiệp. Chọn lọc trong thư viện metagenomics từ đất đã xác định ra 8 dòng cellulolytic, một trong số đó đã được tinh sạch và đặc trưng [23].

Enzyme agarase cũng được xác định trong quá trình chọn lọc thư viện metagenomics từ đất, trong đó có 4 dòng agarolytic chứa 12 gen agarase được xác định [22].6 Gen lipolytic Phân tích thư viện metagenome đã phát hiện được một số gen mã hóa cho enzyme lipolytic (esterase và lipase). Esterase EstCE1 bắt nguồn từ metagenome từ đất [7]. Sự ổn định cao của enzyme này rất hữu ích cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ METAGENOMICS Gồm 3 bước chính: 3.

Lấy mẫu và tách chiết nucleic acid Trong quá trình nghiên cứu về metagenomics mẫu thí nghiệm có thể lấy từ các môi trường khác nhau: đất, nước,… Hệ vi sinh vật trong đất rất đa dạng với các thành phần cấu tạo tế bào khác nhau, do đó rất nhạy cảm trong quá trình tách chiết vì vậy cần có các phương pháp tách chiết thích hợp. Mặc dù có rất nhiều bộ kit thương mại dùng để tách chiết DNA từ các mẫu môi trường nhưng cần có các phương pháp tách chiết chuyên biệt được tối ưu hóa nhằm thu được lượng DNA cao nhất. Có 2 phương pháp tách chiết: − tách trực tiếp: ly giải các tế bào trong mẫu đất để thu nhận DNA − tách gián tiếp: thu lấy các tế bào vi sinh vật từ đất sau đó ly giải để thu nhận DNA Đất là môi trường đặc biệt phức tạp, chứa rất nhiều vi sinh vật và các hợp chất khác nhau rất dễ bị ly giải trong quá trình tách chiết ví dụ như acid humic, một chất có thể được thu nhận đồng thời trong quá trình tách chiết DNA. Cần phải loại bỏ acid humic trước khi tiến hành tinh sạch DNA.

Một trong những cách tốt nhất để loại bỏ các tạp chất trong DNA đất là sử dụng cột sắc ký Sephadex G-200 [15]. Gần đây một kỹ thuật khác được sử dụng là dùng gel aragose gồm 2 pha trong đó có 1 pha dùng polyvinylpyrrolidone (PVP) để loại bỏ acid humic [18] 3. Xây dựng thư viện metagenome Ly trích toàn bộ DNA vi sinh vật có trong môi trường nghiên cứu (đất, nước , côn trùng hay người). Dùng enzyme giới hạn cắt DNA thành từng đoạn ngắn, sau đó chèn vào vector thích hợp (plasmid, cosmid, phage, BAC).

Chuyển những vector này vào tế bào ký chủ (thường là E. Tiến hành giải trình tự rồi so sánh tổng hợp các dữ liệu. Kết quả là tạo thư viện metagenome chứa toàn bộ DNA của vi sinh vật lấy từ môi trường nghiên cứu.coli vẫn được chọn là tế bào chủ để tạo dòng và biểu hiện gen. Tuy nhiên gần đây Streptomyces lividans đã được sử dụng để xác định các gen liên quan đến việc sinh tổng hợp các loại thuốc kháng sinh mới [5].

Bên cạnh đó các tế bào chủ Gram âm cũng được sử dụng trong một số phòng thí nghiệm để xây dựng thư viện metagenome. Phân tích thư viện metagenome Có 2 phương pháp được sử dụng để phân tích gen trong thư viện metagenome 11 3. Phân tích dựa trên việc giải trình tự Việc giải trình tự sẽ cung cấp thông tin về chức năng, các đặc điểm di truyền và các yếu tố chuyển gen trong hệ vi sinh vật từ mẫu môi trường. Xác định các dòng dựa trên các phương pháp xác định trình tự đã biết 3.

Phân tích dựa trên chức năng Cho phép phát hiện các enzyme mới, kháng sinh hoặc các loại thuốc mới từ thư viện metagenome. Có 2 phương pháp phân tích: ▪ Biểu hiện heterologous: các dòng biểu hiện các chức năng mong muốn được xác định. Hạn chế của phương pháp này là các tế bào chủ phải có khả năng phiên mã và dịch mã các gen để tạo ra sản phẩm. ▪ Sự chọn lọc các dòng biểu hiện các chức năng mong muốn.

Phương pháp này rất hữu hiệu để phát hiện các dòng hiếm. Ví dụ như sự chọn lọc các đặc điểm đề kháng thuốc kháng sinh và đề kháng kim loại. 12 Chèn dòng lớn Trình tự kết thúc Dòng mục tiêu ngẫu nhiên Hình 1.1 - Các bước trong quá trình nghiên cứu về metagenomics 13 II. Định nghĩa Laccase (p-benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase.