Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong xu hướng phát triển của y học hiện đại kết hợp với y học cổ truyền, việc nghiên cứu, chiết tách và tiêu chuẩn hóa các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu tự nhiên giữ vai trò thiết yếu trong việc nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe. Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., họ Cúc - Asteraceae) là vị thuốc cổ truyền được sử dụng phổ biến để trừ phong thấp, lợi gân cốt, chữa đau lưng mỏi gối, tê bại khớp, mụn nhọt và kinh nguyệt không đều. Nhiều công trình nghiên cứu dược lý hiện đại đã chứng minh dịch chiết hy thiêm có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, chống nhiễm khuẩn, ức chế miễn dịch, điều hòa lipid máu và chống oxy hóa mạnh. Về mặt hóa học, các hợp chất phenolic gồm acid hydroxycinnamic (acid chlorogenic, acid caffeic) và flavonoid (rutin) là những thành phần quan trọng tạo nên hoạt tính sinh học và khả năng dọn gốc tự do của dược liệu.

Mặc dù có giá trị ứng dụng cao và xuất hiện trong nhiều chế phẩm thương mại điều trị bệnh khớp và gút (như Traly Gout, Gút Tuệ Linh, Hoàng Thấp Linh), chuyên luận Hy thiêm trong Dược điển Việt Nam V hiện chưa có chỉ tiêu định lượng cụ thể cho các hoạt chất acid chlorogenic, acid caffeic và rutin. Nhằm xây dựng cơ sở khoa học phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa, kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào cho sản xuất thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe, khóa luận đặt ra các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu sau:

  1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic và rutin trong dược liệu hy thiêm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  2. Ứng dụng phương pháp đã thiết lập để phân tích, xác định hàm lượng ba hoạt chất trên trong các mẫu dược liệu hy thiêm thu hái tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là phần trên mặt đất (thân, cành, lá) phơi hoặc sấy khô của cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.). Mẫu nghiên cứu dùng để khảo sát xây dựng quy trình phân tích được thu thập tại huyện Tân Sơn, tỉnh Phú Thọ (ký hiệu HT-PT.01). Phạm vi khảo sát mở rộng gồm các mẫu dược liệu hy thiêm được thu hái đồng loạt vào tháng 4 năm 2022 tại 8 điểm thuộc 5 tỉnh của Việt Nam: Phú Thọ (Tân Sơn, Việt Trì, Thanh Thủy, Hạ Hòa), Yên Bái, Sơn La, Hòa Bình và Thanh Hóa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận vận dụng các nguyên lý phân tích hiện đại và hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm quốc tế để xây dựng và thẩm định quy trình định lượng:

  • Cơ sở lý thuyết phân tích: Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) kết hợp đầu dò chuỗi diode quang (DAD). Phương pháp định lượng áp dụng là phương pháp chuẩn ngoại đa điểm (external standard method), dựa trên mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích pic sắc ký ($S_{pic}$). Đánh giá hiệu năng tách sắc ký dựa trên lý thuyết Van Deemter với các tiêu chí kiểm soát độ phân giải ($1,5 \le R_s \le 2$), hệ số đối xứng pic ($0,8 \le A_s \le 1,5$, tối ưu tiệm cận 1) và thời gian lưu ($t_R$) thích hợp.
  • Khung tiêu chuẩn thẩm định: Quy trình thẩm định phương pháp phân tích tuân thủ đầy đủ các hướng dẫn của Hội đồng Quốc tế về Hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (ICH) và quy định của Hiệp hội các nhà Hóa phân tích chính thức (AOAC). Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm: tính thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu/chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng (hiệu suất thu hồi).
  • Phương pháp xử lý mẫu thực nghiệm: Chiết xuất hoạt chất từ bột dược liệu mịn (qua rây 350, độ ẩm $\le 10%$) bằng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm. Tác giả khảo sát các biến số chiết xuất gồm loại dung môi (MeOH 60%, MeOH 80%, MeOH 100%), thời gian siêu âm (từ 20 đến 60 phút) và nhiệt độ chiết (40°C, 50°C, 60°C).
  • Nguồn dữ liệu và trang thiết bị: Dữ liệu thực nghiệm được thu thập trực tiếp tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm – Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Dược – Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ. Thiết bị sử dụng gồm hệ thống HPLC Agilent 1260 DAD, cột sắc ký Agilent C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}; 5\text{ }\mu\text{m}$), bể siêu âm D-78224 (Đức), cân phân tích Shimadzu AUW220D, cùng hóa chất, dung môi acetonitrile (MeCN), methanol (MeOH) và acid phosphoric ($H_3PO_4$) đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC của hãng Merck (Đức). Các chất chuẩn đối chiếu gồm acid chlorogenic, rutin (độ tinh khiết 98%, HPLC) và acid caffeic (Lot. CFN99190, ChemFaces).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu về thực vật học, thành phần hóa học, dược lý học của hy thiêm và các phương pháp phân tích hoạt chất:

  • Tổng quan về hy thiêm: Trình bày vị trí phân loại của chi Siegesbeckia, đặc điểm hình thái thực vật, vùng phân bố tự nhiên (chủ yếu tại các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc và Tây Nguyên), mùa thu hái và bộ phận dùng. Phân tích chi tiết thành phần hóa học đặc trưng gồm diterpenoid nhóm ent-pimaran (như kirenol, hythiemosid B, daturosid, orientin) và các flavonoid/phenolic. Tổng hợp các nghiên cứu chứng minh tác dụng chống viêm (ức chế phù bàn chân chuột, giảm $\gamma$-globulin huyết thanh), chống oxy hóa (thu dọn gốc tự do $\cdot OH$ và $O_2^{\cdot-}$), ức chế miễn dịch (giảm nồng độ IgG, IgG1, IgG2b), chống dị ứng (ức chế tiết IgE và histamin), hạ lipid máu và ức chế dòng tế bào u hắc sắc tố B16.
  • Tổng quan về các chất phân tích: Nêu rõ công thức phân tử, khối lượng phân tử, danh pháp IUPAC, tính chất lý hóa, độ tan và tác dụng dược lý của 3 chất:
    • Acid chlorogenic (CGA): $C_{16}H_{18}O_9$ ($354,31\text{ g/mol}$), có hoạt tính dọn gốc hydroxyl với hằng số tốc độ $7,73 \times 10^9\text{ M}^{-1}\text{s}^{-1}$, bảo vệ gan, điều hòa chuyển hóa qua hoạt hóa AMPK, tăng biểu hiện GLUT4 và giảm men G6Pase.
    • Rutin: $C_{27}H_{30}O_{16}$ ($610,5\text{ g/mol}$), bioflavonoid có tác dụng chống oxy hóa qua nhân aglycone quercetin, ức chế $\alpha$-glucosidase/$\alpha$-amylase, hạ huyết áp, cải thiện tính thấm mao mạch và ức chế protein gây viêm HMGB1.
    • Acid caffeic (CA): $C_9H_8O_4$ ($180,16\text{ g/mol}$), dẫn xuất hydroxycinnamic có khả năng ức chế VEGF, giảm MMP-2, MMP-9 và điều hòa quá trình tái tạo xương.
  • Tổng quan phương pháp phân tích: So sánh các kỹ thuật định lượng (TLC, HPTLC, HPLC, LC-MS/MS), khẳng định phương pháp HPLC là lựa chọn tối ưu về độ chọn lọc, độ chính xác và khả năng phân tích đồng thời nhiều hợp chất phân cực trong nền mẫu dược liệu phức tạp.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu, thiết lập điều kiện đo đạc sắc ký và các bước thẩm định:

  • Chuẩn bị dung dịch: Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp ($1000\text{ }\mu\text{g/mL}$) được pha trong MeOH 60%, từ đó pha loãng thành các dãy chuẩn làm việc từ $1,0$ đến $100,0\text{ }\mu\text{g/mL}$. Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị bằng cách cân chính xác $1,0\text{ g}$ bột dược liệu, chiết siêu âm với $50\text{ mL}$ MeOH 60% ở 60°C trong 45 phút, sau đó lọc qua màng lọc PTFE $0,22\text{ }\mu\text{m}$.
  • Khảo sát điều kiện sắc ký: Thiết lập và đánh giá 4 chương trình rửa giải gradient (P1, P2, P3, P4) trên hệ pha động gồm acid phosphoric 0,1% (A) và acetonitrile (B).
  • Quy trình thẩm định: Thiết lập các thử nghiệm xác định tính thích hợp hệ thống (tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn $50\text{ }\mu\text{g/mL}$), tính đặc hiệu (so sánh sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và độ chồng phổ DAD), khoảng tuyến tính (6 mức nồng độ: $1,0; 2,0; 10,0; 20,0; 50,0; 100,0\text{ }\mu\text{g/mL}$), độ lặp lại ($n=6$), độ chính xác trung gian (2 kiểm nghiệm viên phân tích khác ngày) và độ đúng qua tỷ lệ thu hồi tại 3 mức nồng độ thêm chuẩn.
  • Công thức tính hàm lượng: Hàm lượng hoạt chất $X$ (tính bằng $\text{mg/g}$ hoặc $%$ theo dược liệu khô tuyệt đối) được tính theo công thức: $$X = \frac{C \times V}{10 \times m \times (100 - B)}$$ (Trong đó: $C$ là nồng độ tính từ đường chuẩn tính bằng $\mu\text{g/mL}$, $V$ là thể tích dịch chiết tính bằng $\text{mL}$, $m$ là khối lượng mẫu thử tính bằng $\text{g}$, $B$ là độ ẩm của mẫu tính bằng $%$).

Chương 3: Kết quả

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tối ưu hóa và thẩm định:

  • Tối ưu hóa điều kiện chiết và sắc ký: Xác định điều kiện chiết xuất tối ưu là dung môi MeOH 60%, nhiệt độ siêu âm 60°C, thời gian siêu âm 45 phút. Chương trình rửa giải gradient P4 được lựa chọn do các pic phân tách hoàn toàn, cân đối, hệ số đối xứng đạt yêu cầu và thời gian chạy ngắn (15 phút).
  • Kết quả thẩm định phương pháp: Tất cả các chỉ tiêu thẩm định đều đáp ứng đầy đủ các tiêu chí chấp nhận của ICH và AOAC (trình bày chi tiết tại bảng số liệu ở mục kết quả).
  • Kết quả phân tích mẫu thực tế: Ứng dụng quy trình định lượng trên các mẫu hy thiêm thu thập tại các địa phương, ghi nhận sự khác biệt rõ nét về hàm lượng hoạt chất giữa các vùng địa lý.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 phân tích, so sánh các phát hiện nghiên cứu với các tài liệu đã công bố trong và ngoài nước:

  • So sánh kết quả định lượng với nghiên cứu của Pradhan và cộng sự tại Bắc Ấn Độ (sử dụng HPTLC xác định CGA dao động từ $0,0045 - 1,191\text{ mg/g}$ và CA từ không phát hiện đến $0,328\text{ mg/g}$). Hàm lượng CGA trong nghiên cứu này cao hơn CA, phù hợp với xu hướng chung của các công bố quốc tế.
  • So sánh với nghiên cứu phân tích phân đoạn D101 của cao chiết hy thiêm (định lượng rutin đạt $0,24 \pm 0,02%$).
  • Khẳng định tính ưu việt của quy trình HPLC pha đảo được xây dựng: thời gian rửa giải ngắn ($15\text{ phút}$), điều kiện xử lý mẫu đơn giản, độ lặp lại và độ thu hồi cao, tiết kiệm dung môi và hóa chất độc hại, có khả năng áp dụng trực tiếp tại các phòng kiểm nghiệm dược liệu.

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chính

Phương pháp định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic và rutin bằng HPLC đã được thẩm định hoàn chỉnh với các thông số kỹ thuật chi tiết như sau:

Thông số thẩm định Acid chlorogenic (CGA) Acid caffeic (CA) Rutin
Bước sóng phát hiện ($\lambda$) $320\text{ nm}$ $320\text{ nm}$ $360\text{ nm}$
Thời gian lưu ($t_R$, phút) $6,169 \pm 0,007$ $8,760 \pm 0,011$ $11,634 \pm 0,016$
RSD thời gian lưu / Diện tích pic (%) $0,111% / 0,506%$ $0,120% / 0,447%$ $0,133% / 0,835%$
Hệ số tương đồng phổ DAD $0,999$ $0,999$ $0,999$
Phương trình đường chuẩn $Y = 15,805x - 0,7734$ $Y = 7,299x - 1,0865$ $Y = 33,913x + 6,5303$
Hệ số tương quan ($R^2$) $0,9998$ $0,9997$ $0,9993$
Khoảng tuyến tính ($\mu\text{g/mL}$) $1,0 - 100,0$ $1,0 - 100,0$ $1,0 - 100,0$
Giới hạn phát hiện (LOD, $\mu\text{g/mL}$) $0,036$ $0,076$ $0,150$
Giới hạn định lượng (LOQ, $\mu\text{g/mL}$) $0,120$ $0,250$ $0,500$
Độ lặp lại (RSD hàm lượng, %) $1,15%$ $0,91%$ $1,31%$
Độ chính xác trung gian (RSD, %) $< 2,0%$ $< 2,0%$ $< 2,0%$
Hiệu suất thu hồi (Độ đúng, %) $98,7% - 103,3%$ $96,6% - 103,8%$ $97,7% - 101,6%$

Kết quả phân tích hàm lượng ba hoạt chất trong các mẫu dược liệu hy thiêm thu hái thực tế tại các vùng miền Việt Nam được tổng hợp tại bảng dưới đây:

Ký hiệu mẫu Nguồn gốc thu hái Hàm lượng CGA (mg/g) Hàm lượng CA (mg/g) Hàm lượng Rutin (mg/g)
HT-PT.01 Tân Sơn, Phú Thọ $8,21 \pm 0,09$ ($0,82%$) $0,83 \pm 0,01$ ($0,08%$) $4,93 \pm 0,06$ ($0,49%$)
HT-PT.04 Hạ Hòa, Phú Thọ $0,09 \pm 0,03$ $0,05 \pm 0,00$ $0,07 \pm 0,04$
HT-HB Hòa Bình $0,25 \pm 0,03$ $0,02 \pm 0,02$ $0,40 \pm 0,06$
HT-SL Sơn La $0,52 \pm 0,01$ $0,21 \pm 0,03$ $0,32 \pm 0,04$
HT-TH Thanh Hóa $0,38 \pm 0,06$ $0,11 \pm 0,03$ $0,52 \pm 0,02$
HT-YB Yên Bái $0,34 \pm 0,05$ $0,06 \pm 0,01$ $0,12 \pm 0,03$

Khoảng biến thiên tổng thể của các hoạt chất trong dược liệu hy thiêm tại Việt Nam:

  • Acid chlorogenic: $0,09% - 0,82%$ (cao nhất tại Tân Sơn - Phú Thọ, thấp nhất tại Hạ Hòa - Phú Thọ).
  • Acid caffeic: $0,02% - 0,21%$ (cao nhất tại Sơn La, thấp nhất tại Hòa Bình).
  • Rutin: $0,07% - 0,52%$ (cao nhất tại Thanh Hóa, thấp nhất tại Hạ Hòa - Phú Thọ).

Đóng góp khoa học và thực tiễn

  • Đóng góp học thuật: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam công bố phương pháp định lượng đồng thời cả 3 hoạt chất acid chlorogenic, acid caffeic và rutin trong dược liệu hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) bằng kỹ thuật HPLC. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm có giá trị về sự phân bố hàm lượng các dẫn xuất phenolic và flavonoid theo vùng địa lý.
  • Kiến nghị ứng dụng: Đề xuất áp dụng quy trình phân tích vào việc kiểm tra, đánh giá chất lượng nguyên liệu hy thiêm trong các cơ sở sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng. Kiến nghị tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô thu thập mẫu ở các thời điểm thu hái và các vùng sinh thái khác để tối ưu hóa tiêu chuẩn nguyên liệu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Bộ mẫu khảo sát thực tế mới dừng lại ở các mẫu thu thập tại một số tỉnh miền Bắc và miền Trung (Phú Thọ, Yên Bái, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa) vào một thời điểm duy nhất (tháng 4/2022), chưa đánh giá được toàn diện sự biến thiên hàm lượng hoạt chất theo các mùa sinh trưởng trong năm cũng như các vùng thổ nhưỡng khác như Tây Nguyên.
    • Phương pháp chỉ tập trung định lượng nhóm phenolic và flavonoid (CGA, CA, rutin), chưa tích hợp đồng thời định lượng nhóm diterpenoid (như kirenol) trong cùng một chu trình sắc ký do sự khác biệt lớn về tính chất lý hóa và độ hấp thụ quang phổ.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Mở rộng khảo sát định lượng trên số lượng mẫu lớn hơn, thu thập tại nhiều vùng địa lý và theo các tháng thu hái khác nhau trong năm để xác định chính xác thời điểm thu hoạch cho hàm lượng hoạt chất cao nhất.
    • Tiếp tục nghiên cứu khảo sát các điều kiện sắc ký cải tiến nhằm xây dựng phương pháp phân tích dấu vân tay sắc ký (chromatographic fingerprinting) hoặc tích hợp định lượng thêm các diterpenoid đặc trưng của cây hy thiêm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao đối với các nhóm đối tượng và mục đích nghiên cứu sau:

  • Sinh viên, học viên chuyên ngành Dược học, Hóa dược và Hóa phân tích: Tham khảo phương pháp luận thiết kế thực nghiệm chiết xuất dược liệu có hỗ trợ siêu âm; quy trình tối ưu hóa các thông số sắc ký gradient pha đảo và phương pháp luận thẩm định quy trình định lượng theo chuẩn ICH/AOAC.
  • Kiểm nghiệm viên và phòng kiểm nghiệm dược phẩm: Sử dụng trực tiếp quy trình phân tích đã được thẩm định đầy đủ để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, kiểm tra chất lượng dược liệu hy thiêm thô và các cao chiết, chế phẩm thành phẩm có chứa hy thiêm.
  • Các nhà nghiên cứu phát triển sản phẩm dược liệu: Tham khảo số liệu hàm lượng hoạt chất theo từng vùng địa lý phục vụ công tác quy hoạch vùng trồng, lựa chọn vùng nguyên liệu đạt chuẩn cho sản xuất thuốc điều trị bệnh xương khớp và gút.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao khóa luận lại lựa chọn định lượng đồng thời 3 hoạt chất acid chlorogenic, acid caffeic và rutin?
Trả lời: Acid chlorogenic, acid caffeic (nhóm acid phenolic) và rutin (nhóm flavonoid) là những hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm và dọn gốc tự do mạnh, đóng góp chính vào tác dụng trị bệnh xương khớp của hy thiêm. Đồng thời, chuyên luận Hy thiêm trong Dược điển Việt Nam V hiện chưa có chỉ tiêu định lượng cho 3 hoạt chất này, do đó việc xây dựng phương pháp định lượng đồng thời là cần thiết để tiêu chuẩn hóa dược liệu.

2. Quy trình xử lý mẫu tối ưu được xác định trong khóa luận gồm những thông số nào?
Trả lời: Cân chính xác khoảng $1,0\text{ g}$ bột dược liệu mịn (hàm ẩm $\le 10%$), chiết bằng phương pháp siêu âm với $50\text{ mL}$ dung môi methanol 60% ($\text{MeOH } 60%$), ở nhiệt độ 60°C trong thời gian 45 phút, sau đó lọc qua màng lọc $0,22\text{ }\mu\text{m}$ trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.

3. Điều kiện sắc ký HPLC được tối ưu hóa như thế nào?
Trả lời: Sử dụng cột Agilent C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}; 5\text{ }\mu\text{m}$), nhiệt độ cột $25 \pm 0,1^\circ\text{C}$, tốc độ dòng $1,0\text{ mL/phút}$, thể tích tiêm $20\text{ }\mu\text{L}$. Pha động gồm acid phosphoric 0,1% trong nước (kênh A) và acetonitrile (kênh B) chạy theo chương trình gradient nồng độ trong 15 phút. Phát hiện bằng đầu dò DAD tại bước sóng $320\text{ nm}$ cho CGA và CA, và $360\text{ nm}$ cho rutin.

4. Phương pháp phân tích có đáp ứng đầy đủ độ đúng và độ lặp lại theo tiêu chuẩn quốc tế không?
Trả lời: Có. Phương pháp đạt độ lặp lại cao với RSD hàm lượng của cả 3 chất đều $< 1,5%$ (tiêu chuẩn AOAC yêu cầu $\le 2,0%$). Độ đúng của phương pháp qua hiệu suất thu hồi ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn đạt từ $96,6%$ đến $103,8%$, nằm hoàn toàn trong giới hạn cho phép ($80,0% - 115,0%$) theo quy định của AOAC.

5. Hàm lượng các hoạt chất trong các mẫu hy thiêm thu hái tại Việt Nam dao động như thế nào?
Trả lời: Hàm lượng biến thiên đáng kể theo vị trí địa lý: CGA dao động từ $0,09%$ đến $0,82%$ (cao nhất tại Tân Sơn - Phú Thọ); CA dao động từ $0,02%$ đến $0,21%$ (cao nhất tại Sơn La); rutin dao động từ $0,07%$ đến $0,52%$ (cao nhất tại Thanh Hóa). Mẫu có hàm lượng hoạt chất thấp nhất ghi nhận tại Hạ Hòa - Phú Thọ.

Kết luận

Khóa luận đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic và rutin trong dược liệu hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) bằng phương pháp HPLC-DAD theo đúng hướng dẫn của ICH và AOAC. Quy trình phân tích có độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính rộng ($1,0 - 100,0\text{ }\mu\text{g/mL}$), độ lặp lại tốt ($\text{RSD} < 1,5%$), độ thu hồi đạt từ $96,6%$ đến $103,8%$ và thời gian sắc ký ngắn ($15\text{ phút}$). Ứng dụng thực tế trên các mẫu thu hái tại 8 địa điểm thuộc 5 tỉnh ở Việt Nam cho thấy hàm lượng các hoạt chất có sự dao động rõ rệt giữa các vùng sinh thái, trong đó mẫu tại Tân Sơn (Phú Thọ) đạt hàm lượng CGA cao nhất ($0,82%$) và mẫu Thanh Hóa đạt hàm lượng rutin cao nhất ($0,52%$). Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng, đóng góp trực tiếp vào công tác kiểm tra chất lượng và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu hy thiêm phục vụ sản xuất dược phẩm.