Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong hệ thống y học cổ truyền tại nhiều quốc gia châu Á, các loài thực vật thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu - Euphorbiaceae) giữ vai trò dược liệu quan trọng trong điều trị các bệnh lý về gan, thận, đái tháo đường và viêm nhiễm. Tại Việt Nam, hệ thực vật ghi nhận khoảng 44 loài thuộc chi này, trong đó các loài như Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.) và Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) đã được nghiên cứu chuyên sâu. Cây Me rừng (Phyllanthus emblica L., tên gọi khác: chùm ruột núi, du cam tử, ngưu cam tử) là loài cây thân gỗ nhỏ mọc hoang phổ biến tại các vùng đồi trọc, bãi hoang, rừng thưa thuộc vùng núi Tây Bắc và Việt Bắc. Theo kinh nghiệm dân gian và y học cổ truyền, các bộ phận của cây me rừng như quả, rễ, lá và thân được dùng để chữa cảm mạo, phát sốt, ho, viêm họng, khô khát, viêm ruột, tiêu chảy và hạ huyết áp.

Mặc dù các công trình nghiên cứu trên thế giới đã phân lập nhiều nhóm hoạt chất từ rễ, thân và quả của cây me rừng, dữ liệu hóa học về bộ phận lá me rừng vẫn còn hạn chế. Đặc biệt tại thời điểm thực hiện đề tài, nguồn nguyên liệu lá me rừng phân bố tại Việt Nam chưa được khảo sát chi tiết về thành phần các hợp chất hữu cơ thuần khiết.

Đề tài khóa luận được xác định với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

  1. Chiết xuất và điều chế các phân đoạn cao chiết có độ phân cực khác nhau từ lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L.).
  2. Phân lập các hợp chất hữu cơ tinh khiết từ các phân đoạn cao chiết bằng kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
  3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được thông qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR, 2D-NMR và đối chiếu với các tài liệu khoa học chuyên ngành.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L., họ Euphorbiaceae).
  • Phạm vi không gian: Mẫu nguyên liệu thực vật được thu hái tại tỉnh Bình Thuận; quy trình chiết xuất và phân lập thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh; dữ liệu phổ NMR được đo tại Phòng Thí nghiệm Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu lá thu hái vào tháng 5 năm 2014; định danh thực vật bởi TS. Phạm Văn Ngọt; khóa luận hoàn thành vào tháng 5 năm 2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thuộc loại hình nghiên cứu thực nghiệm hóa học (Hóa học các hợp chất thiên nhiên). Cơ sở lý thuyết và các phương pháp khoa học được áp dụng bao gồm:

  • Khung lý thuyết phân loại hợp chất tự nhiên: Nghiên cứu dựa trên cơ sở phân loại và đặc trưng cấu trúc của các nhóm hoạt chất thứ cấp trong thực vật, trọng tâm là nhóm polyphenol (ester của gallic acid), triterpenoid khung oleanan, và steroid dạng glucoside liên kết chuỗi acid béo (acyl sterol glucoside).
  • Phương pháp xử lý và chiết xuất mẫu thực vật: Phương pháp ngâm dầm (maceration) bột lá khô trong dung môi ethanol $96^\circ$ ở nhiệt độ phòng để trích ly toàn bộ hoạt chất; phương pháp cô quay chân không thu hồi dung môi dưới áp suất giảm; phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane và ethyl acetate để làm giàu và phân đoạn nhóm chất.
  • Phương pháp sắc ký phân tách và tinh chế:
    • Sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) pha thường (normal phase) sử dụng chất nhồi silica gel 60 ($0{,}06\text{ mm}$, Merck) và silica gel $0{,}063\text{ mm}$ (Ấn Độ).
    • Sắc ký cột pha đảo (Reversed Phase CC) sử dụng silica gel RP-18 (Merck).
    • Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) pha thường (Kieselgel $60\text{F}_{254}$) và pha đảo (RP-18), soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng $254\text{ nm}$ và hiện màu bằng dung dịch thuốc thử acid sulfuric ($\text{H}_2\text{SO}_4$) 20% gia nhiệt.
    • Các hệ dung môi giải ly phân đoạn gồm: hexane:ethyl acetate (H:EA), ethyl acetate:methanol (EA:Me), dichloromethane:methanol (DCM:Me), hexane:dichloromethane (H:DCM), chloroform:ethyl acetate:acetone:methanol (C:EA:Ac:Me), và acetone:nước ($\text{Ac}:\text{H}_2\text{O}$).
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Phân tích các thông số chuyển dịch hóa học ($\delta$, ppm), độ bội mũi phổ (s, d, t, dd, m) và hằng số ghép spin ($J$, Hz) trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ($^1\text{H}$-NMR đo ở tần số $500\text{ MHz}$, $^{13}\text{C}$-NMR đo ở tần số $125\text{ MHz}$) và hai chiều (HSQC, HMBC) được ghi trên thiết bị Bruker Avance, kết hợp so sánh cấu trúc với các tài liệu công bố quốc tế.
  • Nguồn dữ liệu: Dữ liệu thực nghiệm phân lập trực tiếp từ $7{,}2\text{ kg}$ bột lá khô và phổ đồ NMR đo thực tế của các chất tinh chế.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các tài liệu khoa học về thực vật học, dược tính sinh học và thành phần hóa học của cây me rừng:

  • Đặc điểm thực vật và phân bố: Cây gỗ nhỏ cao khoảng $3\text{ m}$, phân cành nhiều, cành nhỏ mềm có lông; lá xếp hai dãy sít nhau dạng lá kép lông chim; hoa nhỏ đơn tính cùng gốc mọc ở nách lá; quả mọng hình cầu mang hạt hình ba cạnh màu hồng nhạt. Cây mọc hoang nhiều tại các vùng khí hậu nhiệt đới như Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ.
  • Dược tính theo y học cổ truyền và nghiên cứu hiện đại: Quả me rừng có hàm lượng vitamin C cao gấp 20 lần quả cam; dịch chiết và các hợp chất cô lập có tác dụng chống oxy hóa mạnh (geraniin có $\text{IC}{50} = 4{,}7\ \mu\text{M}$ đối với gốc tự do DPPH), ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi HELF (hợp chất isocorilagin có $\text{IC}{50} = 51\ \mu\text{g/ml}$), kháng virus Herpes simplex loại 1 và 2 ($1,2,4,6\text{-tetra-}O\text{-galloyl-}\beta\text{-D-glucose}$ có $\text{IC}_{50} = 10{,}0\ \mu\text{g/ml}$), hạ men gan và phục hồi chức năng gan trên chuột ở liều $75\text{ mg/kg/ngày}$, cải thiện tổn thương tinh hoàn do tác dụng phụ của thuốc động kinh valproic acid.
  • Tổng quan thành phần hóa học: Tổng hợp cấu trúc của 74 hợp chất từng được công bố trên thế giới từ các bộ phận quả, rễ, thân và vỏ của cây Phyllanthus emblica, bao gồm các dẫn xuất sesquiterpenoid (phyllaemblic acid, phyllaemblicin A–D), hydrolysable tannin (corilagin, geraniin, phyllanemblinin A–F, chebulagic acid), flavonoid (rutin, quercetin, kaempferol glucosides) và nhóm phytosterol.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình xử lý nguyên liệu, chiết xuất phân đoạn và quá trình sắc ký cô lập các chất:

  • Thu hái và chiết xuất ban đầu: $7{,}2\text{ kg}$ bột lá khô thu hái tại Bình Thuận được ngâm dầm trong dung môi ethanol $96^\circ$, lọc và cô quay thu được $285{,}5\text{ g}$ cao ethanol thô. Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân đoạn cao ethanol với hexane và ethyl acetate, thu được $22{,}1\text{ g}$ cao hexane, $143{,}1\text{ g}$ cao ethyl acetate và $77{,}8\text{ g}$ cao cặn còn lại.
  • Phân lập từ cao hexane ($22{,}1\text{ g}$):
    • Sắc ký cột silica gel pha thường giải ly bằng hệ H:EA ($0\rightarrow 100%$ EA) và EA:Me ($0\rightarrow 100%$ Me), thu được 6 phân đoạn (H1 đến H6).
    • Phân đoạn H5 ($0{,}94\text{ g}$) được sắc ký cột với hệ DCM:Me ($4\rightarrow 100%$ Me) thu 3 phân đoạn phụ (H5.1–H5.3). Phân đoạn H5.2 ($170{,}9\text{ mg}$) qua sắc ký cột lặp lại nhiều lần bằng hệ C:EA:Ac:Me ($8:0{,}2:0{,}2:0{,}2$) cô lập được hợp chất PEA-N3 ($7\text{ mg}$, dạng bột vô định hình, không màu).
    • Phân đoạn H6 ($1{,}83\text{ g}$) được sắc ký cột với hệ H:DCM ($50\rightarrow 100%$ DCM) và DCM:Me ($0\rightarrow 100%$ Me) thu 4 phân đoạn phụ (H6.1–H6.4). Phân đoạn H6.2 ($118{,}1\text{ mg}$) sắc ký cột nhiều lần với hệ H:DCM ($1:1$) cô lập được hợp chất PEHC ($6\text{ mg}$, dạng bột màu trắng).
  • Phân lập từ cao ethyl acetate ($143{,}1\text{ g}$):
    • Sắc ký cột silica gel hệ H:EA ($80\rightarrow 100%$ EA) và EA:Me ($5\rightarrow 100%$ Me) thu được 5 phân đoạn (EA1 đến EA5).
    • Phân đoạn EA4 ($33{,}4\text{ g}$) sắc ký cột tiếp thu được 8 phân đoạn phụ (EA4.1–EA4.8).
    • Phân đoạn phụ EA4.1 ($0{,}67\text{ g}$) được sắc ký cột với hệ DCM:Me ($0\rightarrow 100%$ Me) thu 7 phân đoạn nhỏ (EA4.1.1–EA4.1.7). Phân đoạn EA4.1.2 ($78{,}0\text{ mg}$) tiếp tục sắc ký cột pha đảo RP-18 nhiều lần với hệ dung môi giải ly $\text{Ac}:\text{H}_2\text{O}$ ($2:3$) cô lập được hợp chất PEA-N2 ($10\text{ mg}$, chất rắn màu trắng, kết tinh trong acetone).
Phân đoạn cao chiết Khối lượng cao (g) Phân đoạn sắc ký trung gian Hệ dung môi phân lập tinh chế Ký hiệu chất Khối lượng tinh chế (mg)
Cao ethyl acetate $143{,}1$ EA4 $\rightarrow$ EA4.1 $\rightarrow$ EA4.1.2 RP-18 ($\text{Ac}:\text{H}_2\text{O}\ 2:3$) PEA-N2 $10$
Cao hexane $22{,}1$ H6 $\rightarrow$ H6.2 Silica gel (H:DCM $1:1$) PEHC $6$
Cao hexane $22{,}1$ H5 $\rightarrow$ H5.2 Silica gel (C:EA:Ac:Me $8:0{,}2:0{,}2:0{,}2$) PEA-N3 $7$

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 biện luận chi tiết cấu trúc hóa học của 3 hợp chất dựa trên dữ liệu phổ NMR và so sánh tài liệu:

  • Khảo sát cấu trúc hợp chất PEA-N2 (ethyl gallate):

    • Trạng thái: Hợp chất màu trắng, TLC 1 vết tròn ($R_f$ xác định trong hệ hexane:acetone:acetic acid $3:2:0{,}02$), hiện vết tím dưới đèn UV $254\text{ nm}$ và vết hồng khi hiện màu bằng $\text{H}_2\text{SO}_4$ 20%.
    • Phổ $^1\text{H}$-NMR ($\text{acetone-}d_6$): Tín hiệu 2 proton vòng thơm đối xứng tại $\delta_{\text{H}}\ 7{,}052\text{ ppm}$ ($2\text{H}$, s, H-2, H-6); nhóm ethyl đặc trưng gồm 1 mũi tứ bội $-\text{CH}2-$ tại $\delta{\text{H}}\ 4{,}23\text{ ppm}$ ($2\text{H}$, q, $J = 7{,}0\text{ Hz}$, H-8) và 1 mũi ba $-\text{CH}3$ tại $\delta{\text{H}}\ 1{,}30\text{ ppm}$ ($3\text{H}$, t, $J = 7{,}0\text{ Hz}$, H-9).
    • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR ($\text{acetone-}d_6$): Xuất hiện 7 tín hiệu carbon gồm nhóm carbonyl ester tại $\delta_{\text{C}}\ 166{,}7\text{ ppm}$ (C-7); các carbon thơm gồm $\delta_{\text{C}}\ 146{,}0\text{ ppm}$ (C-3, C-5), $138{,}8\text{ ppm}$ (C-4), $122{,}2\text{ ppm}$ (C-1), $109{,}9\text{ ppm}$ (C-2, C-6); nhóm ethyl gồm $\delta_{\text{C}}\ 60{,}9\text{ ppm}$ (C-8) và $14{,}7\text{ ppm}$ (C-9).
    • Kết luận cấu trúc: PEA-N2 là ethyl gallate (ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate).

  • Khảo sát cấu trúc hợp chất PEHC (oleanolic acid):

    • Trạng thái: Bột màu trắng, TLC hệ H:DCM ($1:1$) cho 1 vết duy nhất hiện màu tím với $\text{H}_2\text{SO}_4$ 20%.
    • Phổ $^1\text{H}$-NMR ($\text{DMSO-}d_6$): Proton acid carboxylic tại $\delta_{\text{H}}\ 12{,}0\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, br s, $-\text{COOH}$); proton olefin tại $\delta_{\text{H}}\ 5{,}16\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, br s, H-12); proton methine liên kết C-18 tại $\delta_{\text{H}}\ 2{,}74\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, dd, $J = 13{,}5\text{ Hz},\ 3{,}5\text{ Hz}$); 7 nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp ở vùng trường cao ($\delta_{\text{H}}\ 1{,}10;\ 0{,}90;\ 0{,}88;\ 0{,}87;\ 0{,}86;\ 0{,}72;\ 0{,}67\text{ ppm}$).
    • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR ($\text{DMSO-}d_6$): Có đủ 30 tín hiệu carbon của khung triterpenoid oleanan, nổi bật với carbon carbonyl acid tại $\delta_{\text{C}}\ 178{,}6\text{ ppm}$ (C-28); 2 carbon liên kết đôi tại $\delta_{\text{C}}\ 143{,}9\text{ ppm}$ (C-13) và $121{,}5\text{ ppm}$ (C-12); carbon mang nhóm hydroxy tại $\delta_{\text{C}}\ 76{,}9\text{ ppm}$ (C-3).
    • Kết luận cấu trúc: PEHC là oleanolic acid ($3\beta\text{-hydroxyolean-12-en-28-oic acid}$).

  • Khảo sát cấu trúc hợp chất PEA-N3 (dẫn xuất của $\beta$-sitosterol):

    • Trạng thái: Bột vô định hình không màu, hiện màu đỏ tím với $\text{H}_2\text{SO}_4$ 20%.
    • Phổ $^1\text{H}$-NMR ($\text{CDCl}3$): Proton olefin steroid tại $\delta{\text{H}}\ 5{,}36\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, m); các proton của nhóm oxymethylen của phân tử đường bị ester hóa tại $\delta_{\text{H}}\ 4{,}40\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, dd, $J = 12{,}0\text{ Hz},\ 2{,}5\text{ Hz}$, H-6'a) và $4{,}26\text{ ppm}$ (H-6'b); tín hiệu methyl cuối chuỗi acid béo tại $\delta_{\text{H}}\ 0{,}87\text{ ppm}$ ($3\text{H}$, t).
    • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR, HSQC và HMBC ($\text{CDCl}3$): Tín hiệu carbon carbonyl ester của chuỗi acyl tại $\delta{\text{C}}\ 174{,}8\text{ ppm}$; các carbon nối đôi tại $\delta_{\text{C}}\ 140{,}4\text{ ppm}$ (C-5), $122{,}0\text{ ppm}$ (C-6) và hai carbon olefin chuỗi béo tại $\delta_{\text{C}}\ 128\text{ ppm}$ và $130\text{ ppm}$; carbon anomer của phần đường tại $\delta_{\text{C}}\ 101{,}4\text{ ppm}$ (C-1'); carbon C-3 khung steroid dịch chuyển xuống vùng trường yếu $\delta_{\text{C}}\ 79{,}4\text{ ppm}$ chứng tỏ có liên kết glycoside; carbon C-6' của phân tử đường chuyển dịch về $\delta_{\text{C}}\ 63{,}4\text{ ppm}$ chứng minh vị trí gắn chuỗi acyl ester.
    • Tương quan phổ 2D: HMBC cho thấy tương quan từ proton $\delta_{\text{H}}\ 1{,}85\text{ ppm}$ (H-1) đến carbon $\delta_{\text{C}}\ 79{,}4\text{ ppm}$ (C-3).
    • Kết luận cấu trúc: PEA-N3 được xác định sơ bộ là dẫn xuất steroid khung stigmastan mang 1 phân tử đường tại vị trí C-3 và gắn nhóm alkenoyl ($\text{CH}_3(\text{CH}_2)_m\text{CH}=\text{CH}(\text{CH}_2)_n\text{CO}-$) tại vị trí C-6' của phân tử đường ($\beta\text{-sitosterol 3-}O\text{-}\beta\text{-D-(6'-}O\text{-alkenoyl)glucopyranoside}$).
Hợp chất Công thức cấu trúc đề nghị Dạng tồn tại / Màu sắc Khối lượng (mg) Tín hiệu phổ đặc trưng ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$-NMR)
PEA-N2 Ethyl gallate Tinh thể trắng $10$ $\delta_{\text{H}}\ 7{,}052$ (s, $2\text{H}$); $\delta_{\text{C}}\ 166{,}7$ ($>\text{C}=\text{O}$); $146{,}0$; $138{,}8$; $60{,}9$; $14{,}7$
PEHC Oleanolic acid Bột trắng $6$ $\delta_{\text{H}}\ 12{,}0$ (br s); $5{,}16$ (br s); $\delta_{\text{C}}\ 178{,}6$ ($-\text{COOH}$); $143{,}9$; $121{,}5$; $76{,}9$
PEA-N3 Dẫn xuất $\beta$-sitosterol acyl hóa Bột vô định hình không màu $7$ $\delta_{\text{H}}\ 5{,}36$; $4{,}40$; $\delta_{\text{C}}\ 174{,}8$ (ester); $140{,}4$; $122{,}0$; $101{,}4$ (anomer); $79{,}4$; $63{,}4$

Chương 4: Kết luận và đề xuất

  • Kết luận: Đã xử lý $7{,}2\text{ kg}$ nguyên liệu bột lá me rừng thu tại Bình Thuận, điều chế thành công 3 phân đoạn cao chiết và phân lập được 3 hợp chất hữu cơ tinh khiết. Cấu trúc của các chất được làm sáng tỏ là ethyl gallate, oleanolic acid và một dẫn xuất của $\beta$-sitosterol gắn đường và acid béo không no.
  • Đề xuất: Tiếp tục thực hiện phân lập các phân đoạn còn lại của cao hexane, cao ethyl acetate và nghiên cứu mở rộng trên cao butanol nhằm tìm kiếm thêm các hợp chất mới, đồng thời đo thêm các phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều nâng cao để định danh tuyệt đối chiều dài chuỗi carbon và vị trí nối đôi của hợp phần alkenoyl trong hợp chất PEA-N3.

Kết quả và đóng góp

  • Kết quả thực nghiệm định lượng:
    1. Chiết xuất thành công từ $7{,}2\text{ kg}$ lá me rừng khô thu được $285{,}5\text{ g}$ cao ethanol thô.
    2. Phân tách lỏng - lỏng thu được $22{,}1\text{ g}$ cao hexane ($0{,}31%$ so với lá khô) và $143{,}1\text{ g}$ cao ethyl acetate ($1{,}99%$ so với lá khô).
    3. Phân lập thành công 3 hợp chất hữu cơ tinh khiết:
      • PEA-N2 ($10\text{ mg}$): Phân lập từ phân đoạn cao ethyl acetate, xác định cấu trúc là ethyl gallate.
      • PEHC ($6\text{ mg}$): Phân lập từ phân đoạn cao hexane, xác định cấu trúc là triterpenoid acid oleanolic acid.
      • PEA-N3 ($7\text{ mg}$): Phân lập từ phân đoạn cao hexane, xác định cấu trúc là một steroid glucoside ester hóa với acid béo chưa no ($\beta$-sitosterol derivative).
  • Đóng góp khoa học tự nêu của tác giả:
    • Cung cấp các dẫn liệu hóa thực vật đầu tiên về thành phần hóa học của lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) thu hái tại Việt Nam (tỉnh Bình Thuận).
    • Bổ sung quy trình thực nghiệm chi tiết về sự phân tách sắc ký các phân đoạn cao hexane và ethyl acetate của lá me rừng, đóng góp dẫn liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HSQC, HMBC) của các hợp chất phân lập vào cơ sở dữ liệu nghiên cứu dược liệu tự nhiên trong nước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Nghiên cứu chỉ mới tập trung khảo sát một số phân đoạn phụ từ cao hexane (phân đoạn H5, H6) và cao ethyl acetate (phân đoạn EA4 $\rightarrow$ EA4.1); các phân đoạn khác như H1–H4, EA1–EA3, EA5 và toàn bộ phần cao cặn phân cực còn lại ($77{,}8\text{ g}$) chưa được khảo sát sắc ký triệt để.
    • Cấu trúc của hợp chất PEA-N3 chưa được xác định tuyệt đối do phổ HMBC chưa chỉ rõ tương quan liên kết giữa proton H-3 và nhóm thế, cũng như chưa xác định chính xác số lượng nguyên tử carbon ($m, n$) và cấu hình hình học của liên kết đôi trên chuỗi alkenoyl gắn tại vị trí C-6' của phân tử đường.
    • Khóa luận dừng lại ở mức độ phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chưa thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, kháng khuẩn, gây độc tế bào) trên các hợp chất tinh chế được.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Mở rộng khảo sát hóa học trên các phân đoạn sắc ký còn lại của cao hexane, cao ethyl acetate và phân đoạn cao butanol.
    • Sử dụng các phương pháp phân tích chuyên sâu (khối phổ phân giải cao HR-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D chuyên biệt, phản ứng thủy phân cắt chuỗi acid béo) để xác định trọn vẹn công thức cấu tạo của hợp chất PEA-N3.
    • Triển khai thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro của các phân đoạn cao chiết và các hợp chất tinh khiết nhằm đối chiếu với công dụng chữa bệnh dân gian của lá me rừng.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng:
    • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Hóa thực vật.
    • Các nhóm nghiên cứu đang thực hiện đề tài về chiết xuất, sàng lọc hoạt chất và tiêu chuẩn hóa dược liệu từ các loài thuộc chi Phyllanthus (họ Euphorbiaceae).
  • Phần nội dung có giá trị tham khảo cao:
    • Bảng dữ liệu tổng hợp 74 hợp chất tự nhiên từng phân lập từ cây me rừng cùng hệ thống công thức cấu tạo chi tiết tại Chương 1.
    • Quy trình chiết phân đoạn và hệ dung môi sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18 để tinh chế ethyl gallate, oleanolic acid và phytosterol glucoside tại Chương 2.
    • Phương pháp phân tích và đối chiếu độ dịch chuyển hóa học, hằng số tách spin phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR của các khung triterpene oleanan và ester phenolic tại Chương 3.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn mẫu lá me rừng trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và định danh bởi ai?

Mẫu lá cây me rừng phục vụ nghiên cứu được thu hái tại tỉnh Bình Thuận vào tháng 5 năm 2014. Mẫu thực vật đã được TS. Phạm Văn Ngọt (Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh) định danh khoa học chính xác là loài Phyllanthus emblica L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2. Quy trình điều chế các loại cao từ lá me rừng được thực hiện như thế nào và thu được khối lượng bao nhiêu?

Từ $7{,}2\text{ kg}$ bột lá me rừng khô, tác giả tiến hành ngâm dầm trong dung môi ethanol $96^\circ$ ở nhiệt độ phòng, lọc và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được $285{,}5\text{ g}$ cao ethanol thô. Sau đó, cao ethanol được chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với hexane và ethyl acetate, thu được $22{,}1\text{ g}$ cao hexane, $143{,}1\text{ g}$ cao ethyl acetate và $77{,}8\text{ g}$ cao cặn còn lại.

3. Ba hợp chất hữu cơ cô lập được từ lá me rừng có tên gọi và khối lượng là bao nhiêu?

Ba hợp chất tinh khiết được phân lập gồm:

  • Hợp chất PEA-N2 ($10\text{ mg}$): Tinh thể màu trắng, thu được từ cao ethyl acetate, cấu trúc là ethyl gallate.
  • Hợp chất PEHC ($6\text{ mg}$): Bột màu trắng, thu được từ cao hexane, cấu trúc là oleanolic acid ($3\beta\text{-hydroxyolean-12-en-28-oic acid}$).
  • Hợp chất PEA-N3 ($7\text{ mg}$): Bột vô định hình không màu, thu được từ cao hexane, cấu trúc là dẫn xuất $\beta$-sitosterol gắn phân tử đường và chuỗi alkenoyl ($\beta\text{-sitosterol 3-}O\text{-}\beta\text{-D-(6'-}O\text{-alkenoyl)glucopyranoside}$).

4. Dữ liệu phổ nào chứng minh hợp chất PEA-N2 có cấu trúc ethyl gallate?

Phổ $^1\text{H}$-NMR của PEA-N2 ghi nhận tín hiệu mũi đơn của 2 proton vòng thơm đối xứng tại $\delta_{\text{H}}\ 7{,}052\text{ ppm}$ (H-2, H-6) cùng nhóm ethyl gồm 1 mũi tứ bội $-\text{CH}2-$ tại $\delta{\text{H}}\ 4{,}23\text{ ppm}$ ($J = 7{,}0\text{ Hz}$) và 1 mũi ba $-\text{CH}3$ tại $\delta{\text{H}}\ 1{,}30\text{ ppm}$ ($J = 7{,}0\text{ Hz}$). Phổ $^{13}\text{C}$-NMR xuất hiện carbon carbonyl ester tại $\delta_{\text{C}}\ 166{,}7\text{ ppm}$, các carbon vòng thơm mang nhóm oxy tại $\delta_{\text{C}}\ 146{,}0\text{ ppm}$ (C-3, C-5) và $138{,}8\text{ ppm}$ (C-4), cùng hai carbon của nhóm ethyl tại $\delta_{\text{C}}\ 60{,}9\text{ ppm}$ và $14{,}7\text{ ppm}$. Các số liệu này hoàn toàn tương thích với dữ liệu phổ của ethyl gallate trong tài liệu công bố.

5. Vì sao cấu trúc của hợp chất PEA-N3 chưa được xác định hoàn toàn chính xác?

Mặc dù các phổ NMR, HSQC và HMBC đã xác định được khung sườn stigmastan mang liên kết đôi $\text{C}5\text{=C}6$, phân tử đường gắn tại C-3 ($\delta{\text{C}}\ 79{,}4\text{ ppm}$) và nhóm acyl ester tại $\text{C-6'}$ của đường ($\delta{\text{C}}\ 63{,}4\text{ ppm},\ \delta_{\text{C}}\ 174{,}8\text{ ppm}$), phổ đồ HMBC thực tế không quan sát thấy tương quan từ proton H-3 đến gốc thế. Ngoài ra, số liệu phổ chưa cung cấp đủ cơ sở để xác định chính xác chiều dài chuỗi carbon ($m, n$) cũng như vị trí cụ thể của liên kết đôi trên nhánh alkenoyl ($\text{CH}_3(\text{CH}_2)_m\text{CH}=\text{CH}(\text{CH}_2)_n\text{CO}-$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Ngô Hồng Hoài Nam đã hoàn thành việc khảo sát thực nghiệm thành phần hóa học từ lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) thu hái tại tỉnh Bình Thuận. Bằng các kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18, nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất hữu cơ tinh khiết từ các phân đoạn cao chiết hexane và ethyl acetate. Cấu trúc của các hợp chất được làm sáng tỏ bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR gồm ethyl gallate ($10\text{ mg}$), acid triterpenoid oleanolic acid ($6\text{ mg}$) và một dẫn xuất steroid acyl hóa của $\beta$-sitosterol ($7\text{ mg}$). Kết quả nghiên cứu đóng góp những dẫn liệu thực nghiệm có giá trị khoa học vào kho tàng hóa thực vật và dược liệu học của chi Phyllanthus tại Việt Nam.