Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin trong viên nén

Khóa luận dược sĩ trình bày phương pháp định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin trong viên nén bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

• Tác giả: Trần Thị Huyền Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Thuận
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Đồng Thời Metformin Và Vildagliptin Trong Viên Nén Hỗn Hợp Metformin Và Vildagliptin
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Metformin và Vildagliptin

Metformin và Vildagliptin là hai hoạt chất dược học quan trọng trong điều trị bệnh tiểu đường type 2. Metformin hydroclorid có công thức hóa học C₄H₁₁N₅·HCl, hoạt động bằng cách giảm sản xuất glucose ở gan và cải thiện độ nhạy insulin của cơ thể. Vildagliptin với công thức C₁₇H₂₅N₃O₂ là một chất ức chế DPP-4, giúp tăng tiết insulin phụ thuộc vào glucose. Sự kết hợp hai hoạt chất này trong viên nén hỗn hợp Galvus Met mang lại hiệu quả điều trị vượt trội. Việc xác định chính xác nồng độ từng hoạt chất trong dạng dược học là yêu cầu quan trọng để đảm bảo chất lượng, an toàn và hiệu quả dược phẩm.

1.1. Đặc điểm hóa học và cơ chế tác dụng

Metformin là một biguanide với cơ chế tác dụng chính là ức chế gluconeogenesis gan và tăng uptake glucose ở cơ bắp. Vildagliptin thuộc nhóm DPP-4 inhibitors, ức chế enzyme dipeptidyl peptidase-4, từ đó tăng nồng độ incretin GLP-1 và GIP. Hai hoạt chất này có tính chất hóa học khác biệt, với Metformin có tính yếu base mạnh trong khi Vildagliptin có tính alpha-ketonitrile đặc trưng.

1.2. Ý nghĩa của phương pháp định lượng đồng thời

Phương pháp định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin giúp kiểm soát chất lượng dược phẩm một cách hiệu quả. Phương pháp này giảm thời gian phân tích, tiết kiệm chi phí và tăng độ chính xác so với các phương pháp riêng biệt. Việc áp dụng HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) là giải pháp tối ưu cho định lượng đồng thời hai hoạt chất trong viên nén.

II. Các phương pháp phân tích định lượng

Các phương pháp định lượng Metformin và Vildagliptin đã được phát triển dựa trên nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chủ yếu được sử dụng do tính chọn lọc cao, độ chính xác tốt và khả năng định lượng đồng thời. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV-VIS) cũng được áp dụng nhưng thường dùng cho các hoạt chất riêng biệt. Sắc ký phân bố cặp ion (ion pair chromatography) là kỹ thuật tiên tiến cho phép tách biệt hiệu quả giữa Metformin và Vildagliptin, đặc biệt khi chúng có tính chất điện tích khác nhau.

2.1. Phương pháp HPLC định lượng đồng thời

HPLC là phương pháp phổ biến nhất cho định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin. Phương pháp này sử dụng cột C18, pha động gradient gồm buffer phosphate và acetonitril. Detektor UV được cài đặt ở bước sóng phù hợp để phát hiện hai hoạt chất. Thời gian phân tích ngắn, độ phân giải tốt và độ lặp lại cao là những ưu điểm chính.

2.2. Sắc ký phân bố cặp ion

Sắc ký cặp ion sử dụng tác nhân cặp ion (tetrabutylammonium hay triethylammonium) để tạo thành phức ion với các hoạt chất. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả cho Metformin do tính chất base mạnh. Nó cải thiện độ giữ lại, độ phân giải và cho phép định lượng chính xác cả hai hoạt chất.

III. Quy trình thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp là bước quan trọng theo các hướng dẫn ICH và USP để đảm bảo phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại và tuyến tính. Các tiêu chí thẩm định bao gồm: độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ bền ổn định. Quá trình này được thực hiện bằng cách khảo sát các điểm chuẩn trong khoảng nồng độ định trước, tính toán hệ số tương quan (R > 0.99) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD < 2%).

3.1. Độ phù hợp hệ thống và tuyến tính

Độ phù hợp hệ thống được kiểm tra bằng cách chạy chuẩn hỗn hợp Metformin và Vildagliptin, đánh giá độ phân giải, hình dáng peak và baseline. Khoảng tuyến tính được xác định trong phạm vi 50-150% nồng độ dự kiến, với hệ số tương quan R > 0.999 đảm bảo mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak.

3.2. Độ chính xác và độ lặp lại

Độ chính xác được đánh giá qua độ thu hồi (recovery) ở ba mức nồng độ (80%, 100%, 120%), mục tiêu là 98-102%. Độ lặp lại (intra-day precision) và độ chính xác trung gian (inter-day precision) được tính từ 6 lần lặp lại, với RSD < 2% được chấp nhận. Các thử nghiệm này đảm bảo phương pháp định lượng ổn định và tin cậy.

IV. Ứng dụng thực tế và kết quả phân tích

Phương pháp định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin đã được ứng dụng thành công cho viên nén Galvus Met 50mg/850mg. Kết quả phân tích cho thấy nồng độ Metformin trong khoảng 98.5-102.0% và Vildagliptin trong khoảng 99.0-101.5% so với nồng độ ghi trên nhãn, nằm trong giới hạn chấp nhận (95-105%). Phương pháp này không bị ảnh hưởng bởi các chất phụ trong công thức, đặc biệt là các chất t賦形. Độ ổn định mẫu dưới các điều kiện khác nhau (nhiệt độ phòng, 4°C, 40°C/75% độ ẩm) được kiểm tra trong 24-48 giờ, cho kết quả RSD < 2%.

4.1. Kết quả định lượng viên nén Galvus Met

Phân tích 10 viên nén Galvus Met 50mg/850mg sử dụng phương pháp HPLC đã được xây dựng cho thấy nồng độ Metformin trung bình 850.5 ± 12.3 mg/viên (100.1%) và Vildagliptin trung bình 50.2 ± 0.8 mg/viên (100.4%). Các giá trị này chứng minh phương pháp định lượng có độ chính xác cao và phù hợp cho kiểm soát chất lượng dược phẩm công nghiệp.

4.2. Độ ổn định và ứng dụng mở rộng

Phương pháp phân tích cho thấy độ ổn định tốt của Metformin và Vildagliptin dưới các điều kiện bảo quản khác nhau. Phương pháp này có thể mở rộng ứng dụng cho các viên nén hỗn hợp khác chứa hai hoạt chất này với nồng độ khác nhau, và có tiềm năng áp dụng cho phân tích trong sinh học lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hóa, tăng glucose huyết mạn tính do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Đái tháo đƣờng typ 2 thƣờng gặp ở ngƣời trƣởng thành, chiếm 90-95% các trƣờng hợp ĐTĐ, là tình trạng thiếu hụt tƣơng đối insulin do bài tiết insulin giảm hoặc do các mô không đáp ứng với insulin [2]. Các thuốc chống ĐTĐ đƣợc sử dụng khi chế độ ăn và tập luyện không đủ để kiểm soát đƣợc đƣờng huyết. Do bản chất đa dạng của cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 2, việc phối hợp thuốc sẽ mang lại hiệu quả giảm glucose huyết tốt hơn, đồng thời giảm tác dụng phụ khi tăng liều.

Với nguyên tắc không phối hợp 2 loại thuốc trong cùng 1 nhóm, liệu pháp kết hợp Metformin (MET) và chất ức chế DPP-4 nhƣ Vildagliptin (VIL) đang đƣợc quan tâm trong điều trị ĐTĐ typ 2 vì ƣu điểm không làm tăng cân hay tăng nguy cơ hạ đƣờng huyết [12]. Hiện nay, trên thị trƣờng mới chỉ có chế phẩm viên nén bao phim kết hợp 2 dƣợc chất Metformin và Vildagliptin ở các hàm lƣợng khác nhau của công ty Dƣợc phẩm Novartis. Vì Vildagliptin là chất mới nên trong các dƣợc điển có thể tra cứu đƣợc (dƣợc điển Việt Nam (DĐVN), dƣợc điển Anh (BP), dƣợc điển Mỹ (USP), dƣợc điển châu Âu (EP), dƣợc điển Nhật (JP)) vẫn chƣa có chuyên luận nào định lƣợng Vildagliptin cũng nhƣ định lƣợng đồng thời Metformin và Vildagliptin. Do vậy, việc xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 2 chất trên là rất cần thiết.

Từ đó chúng tôi thực hiện đề tài ―Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Metformin và Vildagliptin trong viên nén hỗn hợp Metformin và Vildagliptin‖ với mục đích: 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Metformin và Vildagliptin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Áp dụng phƣơng pháp đã thẩm định, định lƣợng viên nén 2 thành phần Metformin và Vildagliptin trên thị trƣờng. Tổng quan về Metformin hydroclorid 1.

Cấu tạo hóa học [21] - Công thức cấu tạo:. Công thức cấu tạo của Metformin Hydroclorid - Tên khoa học: 1,1-Dimethylbiguanid monohydroclorid - Công thức phân tử: C4H11N5.HCl - Trọng lƣợng phân tử: 165,6 g/mol 1. Tính chất [8] Bột kết tinh màu trắng hoặc tinh thể màu trắng. Tan tốt trong nƣớc, tan vừa trong ethanol, thực tế không tan trong aceton và diclorometan.

Cơ chế tác dụng và tác dụng dược lý [2], [8] Metformin là thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm biguanid. Cơ chế tác dụng ngoại biên của Metformin là làm tăng sử dụng glucose ở tế bào, cải thiện liên kết của insulin với thụ thể, ức chế tổng hợp glucose ở gan và giảm hấp thu glucose ở ruột. Ngoài tác dụng chống đái tháo đƣờng, Metformin phần nào có ảnh hƣởng tốt trên chuyển hóa lipoprotein (là chất thƣờng bị rối loạn ở ngƣời bệnh đái tháo đƣờng không phụ thuộc insulin). Dược động học [2], [24] - Hấp thu: Metformin hấp thu chậm và không hoàn toàn ở đƣờng tiêu hóa, đạt nồng độ tối đa trong huyết tƣơng (Cmax) sau khoảng 2,5 giờ sau khi uống.

Thức ăn làm chậm tốc độ hấp thu và giảm mức độ hấp thu của Metformin. - Phân bố: 2 Metformin liên kết yếu với protein huyết tƣơng, phân bố nhanh chóng vào các mô và dịch. - Chuyển hóa: Metformin không bị chuyển hóa ở gan, và không bài tiết qua mật. - Thải trừ: Metformin thải trừ chủ yếu qua thận ở dạng không bị biến đổi.

Sau khi dùng đƣờng uống, thời gian bán thải khoảng 6,5 giờ. Chỉ định [2], [8] - Metformin là lựa chọn đầu tay để điều trị ĐTĐ typ II ở các bệnh nhân thừa cân, béo phì. - Ðiều trị bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin (typ II): Ðơn trị liệu, khi không thể điều trị tăng glucose huyết bằng chế độ ăn đơn thuần. - Có thể dùng Metformin đồng thời với một sulfonylurea khi chế độ ăn và khi dùng Metformin hoặc sulfonylurea đơn thuần không có hiệu quả kiểm soát glucose huyết một cách đầy đủ.

Các phương pháp định lượng Metformin Do Metformin có tính base (pKa = 12,4) nên có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp chuẩn độ bằng acid trong môi trƣờng khan, chỉ thị đo điện thế nhƣ trong DĐVN V và BP 2020. Metformin còn có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp đo quang do tính chất hấp thụ UV của nó. Tuy nhiên, phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay là sắc ký phân bố pha đảo. Dƣới đây là một số phƣơng pháp nghiên cứu định lƣợng Metformin.

Một số phương pháp định lượng Metformin Tài Phƣơng Nồng độ Chế phẩm Điều kiện phân tích liệu pháp phân 3 phân tích tích - Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong 4 ml acid formic khan thêm 80 ml acetonitril. Chuẩn độ ngay lập Chuẩn độ tức bằng dung dịch acid Nguyên liệu bằng acid [3] percloric 0,1 N. 1,25 Metformin trong môi [10] - Xác định điểm kết thúc bằng mg/ml Hydroclorid trƣờng phƣơng pháp chuẩn độ đo điện khan thế. - 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N tƣơng đƣơng với 16,56 mg C4H12C1N5 - Dung môi pha mẫu: H2O [3] Viên nén UV - VIS - λ = 232 nm 10 µg/ml [10] Metformin - A (1%,1cm) = 798 - Dung môi pha mẫu: H2O Viên nén - λ = 232 nm [21] UV - VIS 10 µg/ml Metformin - Dung dịch chuẩn Metformin hydroclorid.

- Dung môi pha mẫu: dung dịch acetonitril (ACN) 2,5% pha trong H2O Viên nén - Dung dịch đệm: 0,5g/l NaCl và [3] Glybenclamid HPLC 0,5 g/l Natri heptansulfonat, pH 50 µg/ml và Metformin = 3,85 (điều chỉnh bằng acid phosphoric) - Pha động: đệm - ACN (90 : 10) - Cột C18 ( 300 x 3,9 mm, 10 4 µm) - Nhiệt độ cột: 30°C - λ = 218 nm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl - Dung môi pha mẫu: ACN - H2O (1 : 40) - Dung dịch đệm: 0,5 g/l Natri heptansulfonat, pH = 3,85 (điều chỉnh bằng acid phosphoric) và Viên nén 0,5g/l NaCl 250 [21] Glyburid và HPLC - Pha động: đệm : ACN (90 :10) µg/ml Metformin - Cột C18 ( 300 x 3,9 mm, 10 µm) - Nhiệt độ cột: 30°C - λ = 218 nm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 5 µl - Dung dịch A: Natri hexansulfonat 0,05 M, pH = 2 (điều chỉnh bằng acid trifloroacetic) Viên nén - Dung dịch B: ACN - H2O [3] 100 Glipizid và HPLC (40:60) [21] µg/ml Metformin - Dung môi pha mẫu: ACN - dung dịch A - H2O (7 : 30 : 63) - Pha động: dung dịch A - dung dịch B - H2O (30 : 20 : 50) - Cột phenyl (150 x 4,6 mm, 3,5 5 µm) - Nhiệt độ cột: 30°C - λ = 218 nm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 25 µl Đối với chế phẩm 1 thành phần, phƣơng pháp đƣợc sử dụng để định lƣợng Metformin thƣờng đơn giản nhƣ đo quang, chuẩn độ bằng acid trong môi trƣờng khan. Đối với chế phẩm nhiều thành phần, thƣờng sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, với đệm là các muối alkyl sulfonat (natri heptansulfonat, natri hexansulfonat) hoặc sử dụng cột phenyl khi định lƣợng Metformin. Điều này liên quan đến tính chất phân cực mạnh của nó. Tổng quan về Vildagliptin 1.

Cấu tạo hóa học [8], [23] - Công thức cấu tạo: Hình 1. Công thức cấu tạo của Vildagliptin - Tên khoa học: (2S)-1-[2-[(3-hydroxy-1-adamantyl) amino] acetyl] pyrrolidin-2-carbonitril - Công thức phân tử: C17H25N3O2 - Trọng lƣợng phân tử: 303,4 g /mol 1. Tính chất [8] Bột kết tinh màu trắng. Độ tan: 1,75 mg trong 1 ml H2O 6 1.

Cơ chế tác dụng và tính chất vật lý [12], [ 14] Vildagliptin ức chế có chọn lọc hoạt động của DPP-4, dẫn đến làm tăng nồng độ của 2 hormon GLP-1 và GIP. Điều này làm tăng hoạt tính và tăng cƣờng khả năng đáp ứng của tế bào α và tế bào β đảo tụy đối với glucose, từ đó giúp kiểm soát đƣờng huyết sau ăn và lúc đói tốt hơn do kích thích bài tiết insulin, giảm tiết glucagon, cải thiện độ nhạy insulin, cải thiện chuyển hóa lipid và lipoprotein sau ăn, đồng thời giảm glucose và HbA1c lúc đói và lúc ăn. Dược động học [8], [24] - Hấp thu: Vildagliptin hấp thu nhanh ở đƣờng tiêu hóa, đạt nồng độ cao nhất trong huyết tƣơng sau khoảng 1,7 giờ. Thức ăn làm giảm tốc độ hấp thu nhƣng không làm thay đổi AUC (diện tích dƣới đƣờng cong) của thuốc.

Sinh khả dụng khoảng 85% - Phân bố: Vildagliptin liên kết với protein huyết tƣơng thấp (9,3%) - Chuyển hóa: Khoảng 69% liều dùng đƣợc chuyển hóa, chủ yếu bằng cách thủy phân ở thận. Chất chuyển hóa chính là LAY 151, Vildagliptin không bị chuyển hóa bởi các enzym CYP 450. - Thải trừ: Khoảng 85% liều dùng đƣợc bài tiết qua nƣớc tiểu (23% ở dạng còn hoạt tính) và 15% qua phân. Thời gian bán thải của Vildagliptin là khoảng 2 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch và khoảng 3 giờ sau khi uống.

Chỉ định: [8], [24] Vildagliptin đƣợc chỉ định trong điều trị đái tháo đƣờng typ II ở ngƣời lớn. Liều tối đa một ngày không đƣợc quá 100 mg. Các phương pháp định lượng Vildagliptin Vildagliptin là thuốc mới, đƣợc cơ quan dƣợc phẩm châu Âu (EMA) chấp nhận năm 2007. Tuy nhiên, Vildagliptin chƣa đƣợc cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kì (FDA) cấp phép lƣu hành.

Vì vậy các nghiên cứu về định 7 lƣợng Vildagliptin còn hạn chế. Hiện tại vẫn chƣa có các chuyên luận định lƣợng Vildagliptin trong các dƣợc điển nhƣ DĐVN, USP, EP, JP. Sau đây là 1 số phƣơng pháp định lƣợng Vildagliptin mà chúng tôi tham khảo đƣợc trong các nghiên cứu. Một số phương pháp định lượng Vildagliptin Phƣơng Nồng độ Tài Chế phẩm pháp Điều kiện phân tích phân liệu phân tích tích - Dung môi pha mẫu: H2O Viên nén [7] UV - VIS - λ = 197 nm 20 µg/ml Vildagliptin - Dung dịch chuẩn Vildagliptin - Dung dịch đệm: Kali hydrogen phthalat, Tetra butyl ammonium hydroxyd, acid phosphoric điều chỉnh về pH 8,2.

- Pha động: đệm - ACN - MeOH Viên nén (450 : 480 : 70) [16] HPLC 70 µg/ml Vildagliptin - Dung môi pha mẫu: pha động - Cột C18 (150 x 4,6mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - λ = 254 nm - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Thể tích tiêm: 10 µl - Dung dịch A: 0,025% NH4OH, điều chỉnh về pH 9,5 bằng dung dịch H3PO4.