Đồ án: Nghiên cứu khả năng ức chế tyrosinase từ phụ phẩm bơ Việt Nam

Khám phá khả năng ức chế tyrosinase từ phụ phẩm bơ Việt Nam. Luận văn phân tích tiềm năng ứng dụng trong mỹ phẩm làm sáng da, chống sạm nám tự nhiên.

• Tác giả: Nguyễn Minh Tuyền
• Người hướng dẫn: TS. Phan Thị Anh Đào
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học & Thực Phẩm
• Đề tài: Phụ Phẩm Bơ Việt Nam: Khả Năng Ức Chế Tyrosinase Hiệu Quả
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp Đại Học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tyrosinase và cơ chế hoạt động trong quá trình hình thành melanin

Tyrosinase là một enzyme quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình tổng hợp melanin, sắc tố tự nhiên của da. Enzyme này xúc tác phản ứng oxy hóa L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) thành dopaquinone, một bước đầu tiên quan trọng trong pathway chuyển hóa melanin. Cơ chế hoạt động của tyrosinase liên quan đến hai trung tâm đồng (Cu2+) trong cấu trúc protein, cho phép enzyme kích hoạt oxy phân tử và xúc tác các phản ứng oxy hóa. Việc điều hòa hoạt tính của enzyme này là chìa khóa để kiểm soát sản xuất melanin, từ đó ngăn chặn các vấn đề sắc tố da như nám, tàn nhang và các bất thường sắc tố khác. Hiểu rõ cơ chế này giúp phát triển các phương pháp ức chế tyrosinase hiệu quả từ nguồn tự nhiên.

1.1. Cấu trúc và hoạt tính của enzyme tyrosinase

Tyrosinase là một metalloproteins chứa hai nguyên tử đồng ở trung tâm hoạt động. Cấu trúc này cho phép enzyme nhận biết và kích hoạt oxy phân tử, xúc tác phản ứng oxy hóa một cách hiệu quả. Hoạt tính enzyme phụ thuộc vào sự toàn vẹn của cấu trúc protein và sự hiện diện của các cofactor cần thiết.

1.2. Quá trình tổng hợp melanin qua tyrosinase

Melanin được tổng hợp thông qua một loạt phản ứng phức tạp, bắt đầu từ oxy hóa L-DOPA thành dopaquinone. Sau đó, dopaquinone chuyển đổi thành dopachrome, rồi tiếp tục chuyển hóa thành các hợp chất khác cuối cùng tạo thành melanin. Sự ức chế tyrosinase sẽ dừng hoặc giảm chậm quá trình này, từ đó giảm sản xuất melanin.

II. Bơ Việt Nam Giá trị dinh dưỡng và thành phần kháng dưỡng

Bơ Việt Nam là một loại quả đặc biệt chứa hàm lượng cao chất béo không bão hòa, vitamin E, vitamin C và các hợp chất polyphenol có khả năng chống oxy hóa. Phụ phẩm bơ, bao gồm hạt, vỏ và lá, chứa một lượng lớn các compound sinh học quý giá mà thường bị lãng phí. Các nghiên cứu gần đây cho thấy phụ phẩm bơ có tiềm năng cao trong việc ức chế tyrosinase nhờ thành phần polyphenol phong phú. Các loại bơ phổ biến ở Việt Nam như bơ Hass, bơ Fuerte, bơ Bacon đều chứa lượng hoạt chất sinh học đáng kể. Việc khai thác và ứng dụng giá trị từ phụ phẩm bơ không chỉ tạo ra các sản phẩm chăm sóc da hiệu quả mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

2.1. Thành phần dinh dưỡng chính trong bơ

Trên 100g bơ tươi chứa các chất dinh dưỡng thiết yếu như lipid (14-20g), carbohydrate, protein, vitamin B6, vitamin E và khoáng chất như kali, magiê. Đặc biệt, vitamin E là một chất chống oxy hóa mạnh giúp bảo vệ tế bào, đóng vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khỏe da.

2.2. Các hợp chất polyphenol và khả năng ức chế tyrosinase

Phụ phẩm bơ, đặc biệt là hạt bơ, chứa mức độ cao của polyphenol, flavonoid và tanin. Những hợp chất này sở hữu khả năng ức chế tyrosinase thông qua cơ chế liên kết với copper trong enzyme hoặc điều tiết trực tiếp hoạt tính catalytic. Giá trị này làm cho phụ phẩm bơ trở thành nguồn nguyên liệu quý báu cho công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế tyrosinase từ phụ phẩm bơ

Việc điều chế cao trích từ phụ phẩm bơ Việt Nam được thực hiện thông qua phương pháp chiết dung môi (ethanol) để tách chiết các hợp chất sinh học quan trọng. Sau đó, khả năng ức chế tyrosinase được đánh giá bằng phương pháp in vitro sử dụng enzyme tyrosinase tinh khiết. Phương pháp này dựa trên việc đo lường sự thay đổi màu sắc (thông qua độ hấp thụ ánh sáng) của sản phẩm phản ứng L-DOPA. Ngoài ra, khả năng khử Cu2+ cũng được khảo sát để hiểu rõ cơ chế ức chế tyrosinase, vì đồng là cofactor cần thiết cho hoạt tính enzyme. Các mẫu cao trích được đánh giá so sánh với acid kojic – một chất ức chế tyrosinase tham chiếu, để xác định hiệu quả tương đối.

3.1. Quy trình chiết tách và điều chế cao trích

Các mẫu phụ phẩm bơ được rửa sạch, sấy khô và nghiền nhỏ. Sau đó, tiến hành chiết dung môi ethanol với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nhất định. Dịch chiết được lọc, cô quay dưới chân không để loại bỏ dung môi, thu được cao trích chứa các hợp chất sinh học tập trung. Qui trình này cho phép tách riêng các thành phần hoạt tính quan trọng từ phụ phẩm bơ.

3.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế tyrosinase

Phương pháp in vitro sử dụng enzyme tyrosinase tinh khiết được ủ cùng L-DOPA và các mẫu cao trích trong đệm MOPS. Phản ứng enzyme tạo sản phẩm dopachrome màu nâu đỏ. Độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 490nm được đo sau khoảng thời gian xác định. Phần trăm ức chế tyrosinase được tính toán bằng cách so sánh mẫu kiểm soát (không có chất ức chế) với mẫu chứa cao trích.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng tiềm năng trong chăm sóc da

Các kết quả thực nghiệm từ nghiên cứu khóa luận cho thấy một số loại phụ phẩm bơ Việt Nam thể hiện khả năng ức chế tyrosinase đáng kể, với một số mẫu cao trích đạt hiệu quả ức chế lên tới 70-80% so với đối chứng. Mẫu cao từ hạt bơ Hass cho thấy hoạt tính ức chế tyrosinase cao nhất, vượt trội so với các loại bơ khác. Ngoài ra, các mẫu này cũng thể hiện khả năng khử Cu2+, xác nhận rằng cơ chế ức chế liên quan đến việc chelate đồng. Kết quả định danh thành phần hóa học sơ bộ xác nhận sự hiện diện của các polyphenol, flavonoid và các hợp chất thơm. Những phát hiện này mở ra triển vọng ứng dụng phụ phẩm bơ trong phát triển các sản phẩm chống nám, tàn nhang và các sản phẩm dưỡng da sáng da tự nhiên.

4.1. So sánh hiệu quả ức chế tyrosinase của các loại bơ Việt Nam

Kết quả cho thấy bơ Hass có khả năng ức chế tyrosinase cao nhất (75-80%), tiếp theo là bơ Fuerte (65-70%) và bơ Bacon (55-65%). Sự khác biệt này có liên quan đến nồng độ polyphenol trong từng loại bơ. Mẫu cao từ hạt bơ cho kết quả tốt hơn so với vỏ và lá, do hạt chứa nồng độ hoạt chất sinh học cao hơn, làm cho nó trở thành phụ phẩm có giá trị khai thác cao.

4.2. Ứng dụng trong phát triển sản phẩm chăm sóc da

Với khả năng ức chế tyrosinase hiệu quả, phụ phẩm bơ Việt Nam có tiềm năng lớn trong phát triển các sản phẩm chống nám, tàn nhang, sáng da tự nhiên. Điều này mở ra cơ hội cho các công ty mỹ phẩm Việt Nam phát triển dòng sản phẩm chuyên biệt, thân thiện với môi trường, thay thế các nguyên liệu hóa học tổng hợp. Nghiên cứu thêm về độc tính, khả năng thẩm thấu qua da sẽ giúp đưa các sản phẩm này nhanh chóng ra thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1.1 Tổng quan về tyrosynase và vai trò của nó 1.1 Tyrosynase Tyrosynase là một enzyme tham gia quá trình hình thành melanin, được phát hiện ở hầu hết các thực vật, nấm, động vật [1]. Tyrosynase là một trong ba loại enzyme thuộc polyphenol oxidase ( bao gồm tyrosynase, catechol oxidase, laccase), enzyme này chủ yếu tham gia vào hai quá trình chuyển hóa melanin chính [2, 3] (hình 1. Thứ nhất, sự hydroxyl hóa một monophenol thành diphenol (monophenol oxidase, cresolase hoạt hóa). Thứ hai, sự chuyển đổi một diphenol thành o-quinone tương ứng (diphenoloxidase, catecholase hoạt hóa).

O-quinone trải qua một số phản ứng để cuối cùng tạo thành melanin [4]. Cụ thể, theo sau hai phản ứng này là quá trình polyme hóa của các quione làm tăng sắc tố melanin, và các phản ứng này không có sự xúc tác của enzyme [5]. Khi cả hai phản ứng oxy hóa monophenol và diphenol diễn ra đồng thời, tỷ lệ của monophenol với diphenol là 1:10 hay lên tới 1:40 [6]. Chính thành phần melanin là nguyên nhân gây nên sự hình thành sắc tố tối màu [7].1 Phản ứng dưới xúc tác tyrosynase Cấu trúc tổng thể của tyrosynase được chia làm 3 phần: N-ternimal, C-ternimal và vị trí trung tâm hoạt động.

Tại vị trí trung tâm hoạt động là sự hiện diện của 2 ion đồng cùng với 6 histidine, mỗi nguyên tử đồng liên kết với 3 histidine (hình 1.2 Cấu trúc tổng thể tyrosynase Mỗi enzyme có một trung tâm hoạt động nhất định và điều quan trọng để ức chế enzyme đó là làm cho trung tâm hoạt động đó bị bất hoạt đi. Đối với tyrosynase, ion hydroxyl ban đầu được liên kết với cả hai ion Cu2+. Quá trình oxy- hóa catechol dẫn đến tyrosynase rơi vào trạng thái deoxy, lúc này cả hai ion đồng đều bị khử thành Cu+. Tiếp đến, trạng thái deoxy sẽ liên kết với phân tử O2 để trở thành trạng thái oxy khi cả hai nguyên tử oxi trong cấu hình peroxy đều liên kết với ion Cu2+.

Tiếp đó, quá trình oxy hóa catechol bằng cơ chế oxy hóa phenolic góp phần làm cho ion đồng bị chuyển hóa thành Cu, lúc này tyrosynase bị bất hoạt [9]. Quá trình chuyển hóa tyrosynase được thể hiện trong hình 1. Qua đó cho thấy, trung tâm hoạt động của enzyme, ion Cu2+ bị bất hoạt hoặc ít nhất bị chuyển hóa sang dạng Cu+ nhờ sự có mặt của các nhóm hydroxy. Theo một số nghiên cứu cho rằng, các hợp chất có khả năng ức chế enzyme này hiện này gồm có polyphenol, nhiều aldehyd và các hợp chất khác.

Kubo và cộng sự (2000) [10] cho rằng tất cả các polyphenol chứa nhóm hydroxyl có khả năng ức chế tyrosynase là do chúng có khả năng tạo phức chelate tại trung tâm hoạt động của enzyme này.3 Sơ đồ cơ chế chuyển hóa tyrosynase Gần đây, Badria và cộng sự (2001) [11] đã phát hiện rằng, flavonoid có chứa nhóm ketone có hoạt tính ức chế tyrosynase mạnh. Điều này có thể giải thích sự tương đồng của nhóm dihydroxyphenyl trong L-DOPA và nhóm ketone trong flavonoid. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy một nhóm chức đã ức chế tyrosynase mạnh và tiếp tục được kiểm tra trong việc chữa nám da. Trong nghiên cứu khác của Kubo và cộng sự năm 1994 [12] đã chỉ ra trong cấu trúc hợp chất, khi thêm nhóm hydroxy thì hoạt tính ức chế sẽ tăng nhưng khi thêm nhóm alkyl thì hoạt tính ức chế sẽ giảm.

Bên cạnh đó, Lim và cộng sự 1999 [13] cũng đã cho rằng sự hiện diện của nhóm hydroxy ở vị trí para làm tăng khả năng ức chế 3 monophenolase và giảm hoạt động ức chế diphenolase và hoạt tính ức chế enzyme mạnh hay yếu do sự hiện diện của các nhóm hydroxy trong vòng.2 Cơ chế hình thành melanin Melanosis được biết đến là sự hình thành sắc tố tối màu chủ yếu ở vùng da và khớp, gây ra bởi quá trình oxy hóa enzyme của các hợp chất phenolic [12]. Cả hai amino acid: dihydroxyphenylalanine (DOPA) và tyrosine đều có thể đóng vai trò là cơ chất khởi đầu cho phản ứng melanosis [13]. Trong thực phẩm, sự hình thành các sắc tố tối màu (melanin) hay các điểm biến đen này không làm ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm nhưng làm cho người tiêu dùng cảm giác sản phẩm đã bị hư hỏng và điều đó dẫn đến việc sản phẩm bị loại bỏ và mất đi giá trị [14]. Melanin là sắc tố quan trọng nhất được tổng hợp thông qua quá trình melanosic và hoạt động của chúng quyết định yếu tố màu tóc và da [15].

Melanin được tiết ra bởi tế bào sắc tố phân bố ở lớp đáy của biểu bì. Vai trò của melanin là bảo vệ da khỏi tác hại của tia tử ngoại, đặc biệt là tia cực tím B bằng cách hấp thụ và tán xạ ánh sáng mặt trời và loại bỏ các gốc oxy hóa tự do. Các rối loạn khác nhau ở da là kết quả của sự tích tụ quá mức sắc tố ở biểu bì. Có hai loại sắc tố melanin cụ thể là eumelanin (màu đen hoặc nâu) không tan trong hầu hết các dung môi, liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng hóa trị và pheolmelanin (màu đỏ hoặc vàng) có bộ khung được tạo bởi các tiểu đơn vị là các benzothiazin và cũng liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng hóa trị.

Cả hai loại này đều ảnh hưởng đến sự biến đổi màu da và tóc ở người [16]. Trong cơ chế hình 1.3 thì tyrosine lần đầu tiên bị oxy hóa thành dopaquinone, hoặc là chu kì để cung cấp dihydroxyindole tiền chất của eumelanin tạo màu đen hoặc nâu hoặc phản ứng với cystein để tạo tiền chất của pheomelanin màu đỏ hoặc vàng[17]. Hoạt động của enzyme này dẫn đến việc sản xuất melanin dẫn đến tăng sắc tố của da và dẫn đến các rối loạn (đốm mất sắc tố trên da) và gây trắng tóc [18]. Cơ chế hình thành sắc tố melanin được chỉ rõ trong hình 1.

Theo đó giai đoạn đầu tiên hình thành sắc tố là sự oxy hóa tyrosin thành dopaquinon. Dopaquinon dưới tác dụng 4 của glutathion tạo nên hợp chất đa chức cysteinyldopa. Hợp chất đa chức này sau quá trình loại CO2 và H2O đóng vòng tạo nên alanyl-hydroxybenzothiazine rồi tạo nên pheo-melanin. Bên cạnh đó, dopaquinon chuyển hóa thành leukodopachrom rồi thành dopachrom.

Hợp chất này dưới tác dụng của tautomerase tạo thành DHICA tiếp đó là indole-5,6-quinon-2- carboxylic acid. Trong trường hợp dopachrom loại bỏ nhóm chức _COOH thì hợp chất DHI được tạo thành và dưới tác dụng của tyrosynase sẽ tạo thành indole-5,6-quinon. Hai hợp chất quinon này đã tạo nên eu-melanin.4 Cơ chế hình thành melanin [8] Như vậy, tyrosynase tham gia vào phản ứng đầu của quá trình hình thành sắc tố da melanin. Chính vì thế mà các chất ức chế tyrosynase đã và đang được sử dụng rất rộng trong điều trị các bệnh tăng sắc tố và trong mỹ phẩm như một yếu tố làm trắng da.

Do vậy, việc tìm kiếm các chất ức chế tyrosinase ngày càng trở nên quan trọng trong các sản phẩm 5 thuốc và mỹ phẩm sử dụng để ngăn ngừa và điều trị rối loạn sắc tố.2 Tổng quan về bơ 1.1 Phân loại khoa học Bơ (Persea americana Mill.5) là loại trái cây có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ, được trồng hầu hết ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt [19]. Theo phân loại thực vật, bơ thuộc: • Giới (regnum): Plantae • Bộ (ordo): Laurales • Họ (familia): Lauraceate • Chi (genus): Persea • Loài (species): Persea americana Vỏ lụa Thịt bơ Hạt bơ Vỏ bơ Hình 1.2 Thành phần dinh dưỡng của bơ Bơ được biết đến là loại trái cây giàu chất dinh dưỡng. Trong thành phần quả bơ, lượng nước chiếm khoảng 67 đến 78%, hàm lượng lipid dao động từ 12 đến 24%,hàm lượng carbohydrate dao động từ 0,8 đến 4,8%, hàm lượng protein dao động từ 1,0 đến 3,0% [20]. So với một số loại thực phẩm khác, dầu bơ chứa hàm lượng acid béo không bão hòa đơn cao (axit oleic và palmitoleic), lượng acid béo không bão hòa đa thấp (axit linoleic) và một 6 lượng đáng kể axit béo bão hòa (acid palmitic và stearic) [21].

Thành phần các acid béo khác nhau phụ thuộc vào từng loại giống, giai đoạn sinh trưởng và vị trí địa lý sinh trưởng của từng loại bơ. Trong thịt bơ, một lượng lớn khoáng chất được xác định như kali, natri, canxi, photpho và một số như sắt kẽm với thành phần ít hơn (bảng 1. Bên cạnh đó, sự hiện diện của vitamin, chẳng hạn như carotene, vitamin E, retinol, acid ascorbic, thiamine, riboflavin, niacin, pyridoxine và acid folic, có ảnh hưởng rất tốt đối với sức khỏe con người [22]. Ngoài ra, bơ còn là một trong những loại thực phẩm giúp chống ung thư, chứa nhiều chất kháng oxy hóa mạnh như vitamin, chất khoáng, chất xơ và chất béo không bão hòa đơn [23].1 Giá trị dinh dưỡng của bơ trên 100g [24] Giá trị trên Giá trị trên Thành phần Đơn vị Thành phần Đơn vị 100g 100g Năng lượng kcal 160 Xơ tổng g 6.53 Chất khoáng Kali, K mg 485 Natri, Na mg 7 Phospho, P mg 52 Kẽm, Zn mg 0.64 Magie, Mg mg 29 Sắt, Fe mg 0.55 Canxi, Ca mg 12 Vitamin Vitamin C mg 10.738 Folate μg 81 Vitamin B6 mg 0.257 Vitamin A μg 7 Riboflavin mg 0.00 Vỏ và hạt bơ chứa nhiều hợp chất polyphenol là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp 7 trong thực vật.

Nhóm hợp chất này thể hiện những hoạt tính sinh học quan trọng như khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư , có tác động tích cực lên tình trạng sức khỏe ở cả người và động vật [25]. Trong thành phần dinh dưỡng của hạt là nước 54.7%, tổng chất rắn hòa tan 3.5%, trong khi đó vỏ chứa 76.0% chất béo và 0.9% tổng chất răn hòa tan [26]. Cả vỏ và hạt bơ chứa carotenoid 0,815 mg/100g, hợp chất phenolic 410,2 mg/100g và flavonoid 21,9 mg/100g. Liên quan đến nồng độ vitamin C và E, giá trị cao nhất được tìm thấy 5,36 mg/100g vitamin E và 4,1 mg/100g vitamin C.

Các hợp chất carotenoid, hợp chất phenolic và flavonoid được tìm thấy trong các phần phụ phẩm của bơ chứng minh rằng những sản phẩm phụ này có thể là một nguyên liệu thô hiệu quả cho các ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm [27]. Đối với quả bơ, phần thịt quả là phần dùng để ăn và chiết xuất tinh dầu bơ, mang lại nguồn lợi kinh tế cao. Song song đó, vỏ và hạt bơ được xem là phụ phẩm không mang lại giá trị kinh tế, chúng được thải bỏ và một phần nhỏ được sử dụng làm giống. Tuy nhiên, trên thực tế, theo một số nghiên cứu cho thấy hạt bơ có hoạt tính sinh học thậm chí cao hơn phần thịt quả đặc biệt là các hợp chất chống oxy hóa [28].