Đặt vấn đề Công tác bảo tồn chọn giống ngày càng cần thiết do quá trình thoái hóa diễn ra ngày càng nhanh và phức tạp vì vậy đòi hỏi phải có nhiều công cụ, phƣơng pháp đắc lực hỗ trợ. Hiện nay, SSR đã và đang là 1 trong những công cụ đắc lực phục vụ cho qui trình này việc phát triển maker SSR rất cần thiết Tình hình bệnh ở cây trồng diễn biến ngày càng phức tạp, nghiêm trọng. Chúng ta phải sử dụng các lọai marker khác nhau để chuẩn đoán, phát hiện bệnh sớm nhằm tìm biện pháp khắc phục.Hiện nay, maker có độ tin cậy cao nhất là Microsatellite. SSR đƣợc phân lập theo phƣơng pháp truyền thống từ thƣ viện cDNA hay thƣ viện Genomic rất tốn kém, do phải sàng lọc từ các mẫu dò một cách mò mẫm.
Trong khi đó, phƣơng pháp mới dùng để phân lập SSR từ nguồn dữ liệu ESTs có chi phí thấp và tƣơng đối dễ thực hiện, do trình tự ESTs luôn sẵn có và ta có thể sử dụng miễn phí Lƣợng trình tự EST đƣợc giải mã và công bố ngày càng nhiều, tính đến nay có khỏang 46159508 trình tự EST đƣợc công bố (theo NCBI) Hiện nay các cây thuộc họ chi cam chanh đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều do những giá trị mà nó mang lại nhƣ giá trị thƣơng phẩm, dƣợc phẩm… 1.Mục tiêu của khóa luận Xây dựng cơ sở dữ liệu Microsatellite để phục vụ cho việc tìm hiểu đa dạng và quan hệ di truyền, phân biệt loài và cá thể, lập bản đồ di truyền, xác định gen, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 Vì vậy, khóa luận “KHAI THÁC DỮ LIỆU ESTs (EXPRESSED SEQUENCE TAGs) Ở CHI CAM CHANH (CITRUS) CHO VIỆC PHÁT TRIỂN MARKER PHÂN TỬ SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS)” đƣợc thực hiện với các mục tiêu lần lƣợt nhƣ sau: 1. Thu nhận trình tự EST của chi cam chanh từ CSDL ESTs đƣợc lấy tại trang chính NCBI. Dùng Egassembler để để phân tích làm sạch trình tự, dấu những vùng lập lại, dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors, dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan, sắp gióng cột và assembly các đọan ESTs 3.
Dùng Perl script thu nhận các SSR có trong cơ sở dữ liệu ESTs vừa thu đƣợc từ đó thiết kế mồi trên vùng FLANKING của SSRs 4. Kéo dài các EST-SSR và xác định các trình tự bảo tồn bằng cách thực hiện BLAST trên các Contigs (thu nhận đƣợc bằng assembly ở Website Egassembler) 5. Tìm kiếm những SSR có độ tƣơng đồng cao so với các SSR có trong các gene kháng bệnh ở thực vật 6. Xây dựng CSDL và công cụ để giúp ngƣời dùng có thể khai thác tốt dữ liệu.
Dùng giao diện web để truy xuất thông tin về cơ sở dữ liệu và thực hiện việc chia sẻ thông tin đó, giúp cho việc tìm kiếm, quản lý thông tin đƣợc tốt hơn. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về chi cam chanh Chi Cam chanh (Citrus) là một chi thực vật có hoa trong họ Cửu lý hƣơng (Rutaceae), có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới ở đông nam châu Á. Các loại cây trong chi này là các cây bụi lớn hay cây thân gỗ nhỏ, cao tới 5-15 m tùy loại, với thân cây có gai và các lá thƣờng xanh mọc so le có mép nhẵn. Hoa mọc đơn hay thành ngù hoa nhỏ, mỗi hoa có đƣờng kính 2-4 cm với 5 (ít khi 4) cánh hoa màu trắng và rất nhiều nhị hoa.
Hoa thông thƣờng có mùi thơm rất mạnh. Quả là loại quả có múi, một dạng quả mọng đặc biệt, hình cầu hay cầu thuôn dài, chiều dài 4-30 cm và đƣờng kính 4-20 cm, bên trong quả khi bóc lớp vỏ và cùi sẽ thấy lớp vỏ mỏng, dai, màu trắng bao quanh các múi bên trong chứa nhiều tép mọng nƣớc. Chi này là quan trọng về mặt thƣơng mại do nhiều loài (hoặc cây lai ghép) đƣợc trồng để lấy quả. Quả đƣợc ăn tƣơi hay vắt, ép lấy nƣớc.1 Vị trí phân lọai Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Phân lớp Rosidae Bộ Sapindales Họ Rutaceae Chi Citrus LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2 Đặc điểm Quả của chi Citrus đáng chú ý vì mùi thơm của chúng, một phần là do các terpen chứa trong lớp vỏ, và chủ yếu là do nó chứa nhiều nƣớc.
Nƣớc quả có hàm lƣợng axít citric cao, tạo ra hƣơng vị đặc trƣng của chúng. Chúng cũng là nguồn cung cấp vitamin C và các flavonoit đáng chú ý. Sự phân loại nội bộ trong chi này rất phức tạp và hiện nay ngƣời ta vẫn không biết chính xác số lƣợng loài có nguồn gốc tự nhiên, do nhiều loài đƣợc coi là có nguồn gốc lai ghép. Các loại cây trong chi Citrus đƣợc trồng có thể là con cháu của chỉ 3 loài tổ tiên.
Hiện nay có hàng loạt các loại cây lai ghép tự nhiên hay do con ngƣời nuôi trồng, bao gồm nhiều loại quả có giá trị thƣơng mại nhƣ cam ngọt, chanh tây, bƣởi chùm, chanh ta, quít, bƣởi v. Các nghiên cứu gần đây cho rằng các chi có quan hệ họ hàng gần nhƣ Fortunella, và có lẽ cả Poncirus, Microcitrus, Eremocitrus, cần đƣợc gộp lại trong chi Citrus. Citrus sinensis x Poncirus trifoliata Citrus aurantium LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 Citrus Unshiu Citrus x paradisi Citrus Sinensis Citrus Clementina LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.3 Sâu hại và bệnh tật Bệnh do virus Virus citrus là loài rất nhỏ chỉ có thể nhân lên trong tế bào sống. Trong tế bào của citrus, virus di chuyển theo dòng tế bào chất hoặc di chuyển theo dòng nhựa nguyên và nhựa luyện của cây.
Theo các mạch dẫn, virus đƣợc truyền trong cây từ vùng này sang vùng khác và nhờ cầu nối nguyên sinh virus có thể di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác. Virus cũng có thể nhân lên trong cơ thể của aphid hoặc một vài loài khác làm môi giới truyền bệnh (vectơ truyền bệnh). Khi cây nhiễm virus, nó có thể là tác nhân nhiễm bệnh cho các cây khác. Bệnh virus thƣờng không lây qua hạt.
Một vài loài virus chỉ nhiễm trên một vài loài citrus. Virus có thể nhiễm vài tháng hoặc vài năm trƣớc khi có một vài triệu chứng xuất hiện. Virus Tristeza (CTV) Có nguồn gốc từ nhiều năm trƣớc ở Trung Quốc. Tristeza là bệnh tàn phá rất lớn trên citrus ở Bắc và Nam Mỹ, có khoảng phân bố rất rộng trên thế giới, là bệnh nguy hiểm ở Nhật Bản.
Bệnh Tristeza đƣợc xác định là có hiện diện ở nƣớc ta. Virus Tristeza dạng hình sợi dài (2 x 10 – 11 nm), tập trung và làm hỏng mạch dẫn nhựa libe trong cây, xuống rể và làm suy dinh dƣỡng nhƣ rụng lá, chết đọt, lùn cây và thƣờng thối rễ. CTV dƣới KHV điện tử Bệnh có thể lộ ra ở cây con mới trồng hay ở cây lớn bị suy dinh dƣỡng. Cây có mang mầm bệnh có thể vẫn thấy khoẻ mạnh trong liếp ƣơm nhƣng sớm lộ triệu chứng ngay sau khi trồng.
Cây mang bệnh mãn tính sẽ bị lùn, phù gốc do mắt tháp phát triển quá khổ. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 Hầu hết các giống cam quýt đều có triệu chứng sọc lõm ở gỗ thân và cành (stem pitting). Một dạng đặc trƣng của bệnh là triệu chứng tổ ong khi dùng cam chua làm gốc ghép: khi tách vỏ ở vùng bên dƣới mắt tháp sẽ thấy nhiều lỗ nhỏ xếp cụm trong gỗ. Vector chính truyền bệnh do virus Tristeza là loài aphid có tên Toxoptera citricida Kirkaldy.
Kiểm tra thấy rằng nếu có 5 aphid tấn công cây thì 50% cây sẽ bị nhiễm và nếu có 15 aphid tấn công cây thì 70% cây sẽ bị nhiễm. Ngƣời ta cũng nhận thấy rằng các type khác nhau của virus này đều gây bệnh đƣợc. CTV nhiễm trên tất cả các loại (nhân giống và tháp ghép) của cây citrus. Nó đƣợc tìm thấy trên toàn thế giới và có nhiều giống khác nhau, trong các type khác nhau đó có các type tàn phá rất lớn.
Bệnh chịu ảnh hƣởng bởi điều kiện môi trƣờng, các dạng khác nhau của cây citrus và các nòi virus khác nhau. Khi cây đƣợc ghép trên gốc kháng thì nó có khả năng phục hồi lại sau đó.1 Sơ lƣợc về EST Expressed Sequence Tag là một phần nhỏ của toàn bộ gen mà nó có thể đƣợc sử dụng để nhận biết những gen chƣa biết và xác lập vị trí của chúng trong bộ gen. ESTs cung cấp một phƣơng pháp nghiên cứu nhanh chóng và không tốn kém đối với việc khám phá ra các gen mới, tính bảo toàn của gen về biểu hiện và điều khiển hoạt động, và xây dựng bản đồ di truyền.2 Nguồn gốc của EST ESTs là những mảnh nhỏ của cấu trúc DNA (thƣờng có chiều dài từ 200 đến 500 Nucleotide), chúng đƣợc hình thành bởi một phần hay toàn bộ cấu trúc của một gen biểu hiện. Đó là sự kết hợp những phần nhỏ DNA của gen nằm trong các tế bào, mô, cơ quan của những sinh vật khác nhau và sử dụng những “tags” này để thiết lập một gen nằm ngoài vị trí của chromosome bằng cách bắt cặp với các cặp base.
Đây là sự kết hợp khó khăn của những gen đã biết từ các bộ gen khác nhau giữa các loài sinh vật và phụ thuộc vào kích thƣớc của bộ gen khi có mặt hay không LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8 có mặt của các intron, sự can thiệp của cấu trúc DNA làm gián đoạn cấu trúc của gen quy định protein.2: Nguồn gốc của EST 2.Sơ lƣợc về phƣơng pháp Microsatellite (SSR) 2.1Những khái niệm về kỹ thuật microsatellite Microsatellite: Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) (q. Một đoạn DNA đƣợc mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lƣợng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (đƣợc gọi là đơn vị lặp lại, q. Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100 000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí nào (locus), thƣờng xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại.
Những alleles này có thể phát hiện bởi PCR (q.v), sử dụng primers đƣợc thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite. Khi sản phẩm PCR đƣợc chạy trên gel điện di, alleles đƣợc ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại, e.