Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng mrna e7 human papilloma virus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật real time rt pcr

Tìm hiểu quy trình phát hiện & định lượng mRNA E7 HPV16 bằng Realtime RT-PCR, công cụ chẩn đoán ung thư cổ tử cung hiệu quả. Nghiên cứu khoa học chi tiết.

• Tác giả: Đỗ Ngọc Diễm Trúc
• Người hướng dẫn: TS. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng mRNA E7 Human Papillomavirus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật Realtime RT – PCR
• Loại tài liệu: Khóa luận cử nhân khoa học
• Năm xuất bản: 2009
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
• 1.1.1. Sinh bệnh học
• 1.1.2. Tác nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung
• 1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh
• 1.1.2.2. Đặc điểm của HPV
• 1.1.3. Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam
• 1.1.3.1. Tình hình trên thế giới
• 1.1.3.2. Tình hình ở Việt Nam
• 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
• 1.2.1. Biểu hiện lâm sàng nhiễm HPV
• 1.2.2. Các phương pháp sàng lọc HPV
• 1.2.2.1. Phương pháp Pap’s smears
• 1.2.2.2. Phương pháp VIA
• 1.2.2.3. Phương pháp VILI
• 1.2.2.4. Xét nghiệm HPV
• 1.3. PHƯƠNG PHÁP REALTIME RT – PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
• 1.3.1. Phương pháp PCR
• 1.3.2. Các thành phần trong phản ứng PCR
• 1.3.3. Phương pháp Realtime RT – PCR
• 1.3.3.1. Các khái niệm và thuật ngữ
• 1.3.3.2. Các kiểu phản ứng
• 1.3.4. Cấu trúc – chức năng
• 1.3.5. Ứng dụng phương pháp Realtime RT – PCR trên gene E7 trong chẩn đoán bệnh UTCTC
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. VẬT LIỆU – HÓA CHẤT
• 2.1.1. Vật liệu sinh học
• 2.1.2. Hoá chất dùng cho tách chiết RNA
• 2.1.3. Hoá chất dùng cho một phản ứng RT-PCR
• 2.1.4. Hoá chất dùng cho điện di trên thạch và thang DNA
• 2.1.5. Dụng cụ - thiết bị
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP
• 2.2.1. Phương pháp thiết kế primer
• 2.2.1.1. Các phần mềm máy tính sử dụng
• 2.2.1.2. Phương pháp tiến hành
• 2.2.2. Phương pháp tách chiết RNA
• 2.2.2.1. Phương pháp pha hóa chất
• 2.2.2.2. Phương pháp tiến hành
• 2.2.3. Phương pháp RT
• 2.2.3.1. Cách tiến hành phản ứng RT
• 2.2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.2.4.1. Pha hóa chất điện di
• 2.2.4.2. Phương pháp đổ gel agarose 2%
• 2.2.4.3. Phương pháp điện
• 2.2.5. Phương pháp Realtime RT – PCR
• 2.2.6. Phương pháp khảo sát độ nhạy của quy trình
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT PRIMER, PROBE
• 3.1.1. Khảo sát những đặc tính của Primer
• 3.1.2. Chiều dài của primer và probe
• 3.1.3. Thành phần Nu của các primer
• 3.1.4. Nhiệt độ nóng chảy của primer, probe (Tm)
• 3.1.5. Cấu trúc thứ cấp của primer, probe
• 3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHƯƠNG TRÌNH Realtime RT – PCR
• 3.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH
• 3.3.1. Kiểm tra độ hoạt động của primer, probe bằng Realtime PCR
• 3.3.2. Kết quả tách chiết
• 3.3.3. Khảo sát nhiệt độ lai của primer
• 3.3.4. Khảo sát độ nhạy của primer và probe
• 3.4. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU BỆNH PHẨM
• KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Ung thư Cổ tử cung Tổng quan và Tầm quan trọng 55 ký tự

Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng đối với phụ nữ trên toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Mỗi năm, có khoảng 452.000 ca mắc mới UTCTC trên toàn thế giới, với gần 80% tập trung ở các quốc gia có chương trình tầm soát chưa hiệu quả. UTCTC đứng thứ hai sau ung thư vú về tỷ lệ mắc bệnh và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ ở các nước đang phát triển. Hàng năm, UTCTC cướp đi sinh mạng của 231.000 phụ nữ, hơn 80% trong số đó xảy ra ở các nước đang phát triển. WHO ước tính có đến 50% các trường hợp UTCTC xảy ra ở châu Á. Tại Việt Nam, số người chết vì UTCTC cao hơn nhiều so với HIV. Trong 10 năm qua, có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì UTCTC, gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS. Theo tài liệu gốc, “Nếu chỉ tính riêng UTCTC thì số người chết vì HPV đã cao hơn nhiều so với HIV.” Phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể chữa khỏi hoàn toàn các tổn thương do HPV và ung thư do HPV.

1.1. Sinh bệnh học Ung thư Cổ tử cung Quá trình Phát triển

Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung, hay còn gọi là nghịch sản cổ tử cung (CIN), chỉ những thay đổi của niêm mạc cổ tử cung có tiềm năng ác tính nhưng chưa xâm nhập vào mô đệm. Hầu hết xuất hiện ở vùng chuyển tiếp giữa biểu mô lát và biểu mô tuyến, vùng thường xuyên biến đổi và nhạy cảm. Từ CIN có thể tiến triển thành ung thư tại chỗ, rồi ung thư xâm lấn cổ tử cung. Quá trình này thường diễn ra chậm chạp, kéo dài hàng chục năm, tạo cơ hội cho việc tầm soát và phát hiện sớm UTCTC. Biến đổi tế bào bất thường là yếu tố then chốt trong sinh bệnh học. Theo tài liệu gốc, “Từ tân sinh trong biểu mô cổ tử cung có thể sẽ diễn tiến thành ung thư tại chỗ, rồi ung thư xâm lấn cổ tử cung.”

1.2. Tác nhân gây bệnh Vai trò của Human Papillomavirus HPV

Human papillomavirus (HPV) là tác nhân chính gây ra UTCTC. HPV là virus DNA mạch đôi, vòng nhỏ, thuộc họ Papovaviridae. Có hơn 100 type HPV khác nhau, 40 type gây nhiễm qua đường tình dục. HPV được phân loại thành nguy cơ cao và nguy cơ thấp. Các type HPV nguy cơ thấp (6, 11) gây tổn thương nhẹ, ít nguy cơ ác tính. Các type HPV nguy cơ cao (16, 18, 31, 33, 45) có gene gây ung thư tiềm ẩn. Khoảng 90% ung thư trong thượng mô cổ tử cung (CIN) mức độ cao chứa DNA HPV nguy cơ cao, với HPV 16 phổ biến nhất (50-70%), sau đó là HPV 18 (7-20%).

II. Thách thức Chẩn đoán sớm UTCTC Vì sao cần Realtime RT PCR 59 ký tự

Mặc dù có các phương pháp sàng lọc, chẩn đoán sớm UTCTC vẫn còn nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống như Pap's smears có độ nhạy hạn chế và tỷ lệ âm tính giả. Các phương pháp khác như VIA và VILI mang tính chủ quan. Do đó, cần có các phương pháp chẩn đoán chính xác và khách quan hơn. Kỹ thuật Realtime RT-PCR nổi lên như một giải pháp tiềm năng. Kỹ thuật này cho phép phát hiện và định lượng mRNA E7 HPV16 một cách chính xác, từ đó đánh giá nguy cơ phát triển UTCTC. Phát hiện mRNA E7 cho phép đánh giá mức độ hoạt động của virus HPV, cung cấp thông tin quan trọng về giai đoạn bệnh và tiềm năng phát triển thành ung thư. Theo nghiên cứu, “UTCTC cho đến nay vẫn là một vấn đề sức khỏe đối với phụ nữ trên toàn cầu, đặc biệt là các phụ nữ đang sống ở các nước đang phát triển.”

2.1. Hạn chế của Pap Smear và các phương pháp sàng lọc truyền thống

Phương pháp Pap smear, được George Papanicolaou giới thiệu năm 1949, dùng để phát hiện bất thường của tế bào biểu mô cổ tử cung, giúp phát hiện sớm UTCTC. Tuy nhiên, Pap smear có độ nhạy 44-78% và độ đặc hiệu cao 91-96%, nhưng tỉ lệ âm tính giả dao động từ 1,1 -29,7%. Điều này làm chậm trễ chẩn đoán và điều trị, ảnh hưởng đến kết quả điều trị. Việc cải thiện độ chính xác của các phương pháp sàng lọc là vô cùng cần thiết. Theo tài liệu gốc, “Phương pháp PAP’s smear có độ nhạy 44-78% và độ đặc hiệu cao 91-96%.”

2.2. Ưu điểm của Xét nghiệm HPV DNA so với phương pháp truyền thống

Xét nghiệm DNA HPV lấy mẫu tế bào từ cổ tử cung hoặc âm đạo để phát hiện sự hiện diện của virus HPV. Phương pháp này khách quan hơn các phương pháp dựa trên quan sát bằng mắt thường. Hybrid Capture® 2 (hc2) là xét nghiệm DNA HPV được FDA cho phép sử dụng lâm sàng, phát hiện 13 loại HPV. Tuy nhiên, xét nghiệm này đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt và nhân viên được đào tạo. Xét nghiệm nhanh HPV phát hiện DNA từ 14 loại HPV nguy cơ cao, cho kết quả nhanh hơn. Theo tài liệu gốc, “Phương pháp này không mang tính chủ quan.”

III. Realtime RT PCR Cách phát hiện chính xác mRNA E7 HPV16 56 ký tự

Realtime RT-PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử mạnh mẽ để phát hiện và định lượng mRNA. Kỹ thuật này kết hợp phiên mã ngược (RT) để chuyển đổi RNA thành cDNA, sau đó sử dụng PCR để khuếch đại đoạn cDNA đích. Trong quá trình PCR, một thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc đầu dò huỳnh quang được sử dụng để theo dõi sự khuếch đại sản phẩm theo thời gian thực. Điều này cho phép định lượng chính xác lượng mRNA ban đầu trong mẫu. Trong bối cảnh UTCTC, Realtime RT-PCR được sử dụng để phát hiện và định lượng mRNA E7 HPV16, một dấu ấn sinh học quan trọng cho sự phát triển của ung thư. Theo các nhà khoa học, “Xét nghiệm phát hiện DNA HPV bằng phương pháp Hybrid Capture® 2, do Hăng Digene phát triển, hiện là xét nghiệm HPV duy nhất được Cơ quan Lương Trang: 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP thực và Dược phẩm Liên bang (FDA) của Mỹ cho phép dùng trong lâm sàng.”

3.1. Nguyên lý cơ bản của Realtime RT PCR Từ RNA đến Kết quả

Realtime RT-PCR bắt đầu với việc chuyển đổi RNA thành cDNA bằng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Sau đó, cDNA được khuếch đại bằng PCR sử dụng các mồi đặc hiệu cho đoạn gen đích (ví dụ: mRNA E7). Trong quá trình PCR, một chất đánh dấu huỳnh quang (ví dụ: SYBR Green hoặc đầu dò huỳnh quang) được sử dụng để theo dõi sự khuếch đại cDNA. Lượng huỳnh quang tăng lên tỷ lệ thuận với lượng cDNA được tạo ra, cho phép định lượng mRNA ban đầu. Quá trình được ghi lại theo thời gian thực, cung cấp thông tin định lượng chính xác.

3.2. Tại sao mRNA E7 HPV16 là mục tiêu quan trọng trong chẩn đoán

mRNA E7 HPV16 là một dấu ấn sinh học quan trọng trong sự phát triển của UTCTC. E7 là một oncoprotein, có nghĩa là nó là một protein thúc đẩy sự phát triển ung thư. E7 ức chế các protein ức chế khối u như p53 và pRb, dẫn đến tăng sinh tế bào không kiểm soát. Sự hiện diện của mRNA E7 cho thấy rằng gen E7 đang được biểu hiện, cho thấy rằng virus HPV đang hoạt động và có khả năng gây ra UTCTC. Việc định lượng mRNA E7 cung cấp thông tin về mức độ hoạt động của virus.

3.3. Các thành phần cần thiết cho phản ứng Realtime RT PCR thành công

Để thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR thành công, cần có các thành phần sau: RNA mẫu chất lượng cao; enzyme phiên mã ngược (RT) hiệu quả; DNA polymerase ổn định nhiệt; các mồi đặc hiệu cho đoạn gen đích; chất đánh dấu huỳnh quang; và thiết bị Realtime PCR. Chất lượng và nồng độ của RNA mẫu ảnh hưởng lớn đến kết quả. Mồi cần được thiết kế cẩn thận để đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả khuếch đại. Theo như tài liệu gốc viết, “Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp mới từ một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần có sự hiện diện của những mồi chuyên biệt.”

IV. Xây dựng Quy trình Realtime RT PCR Khảo sát Primer và Probe 58 ký tự

Việc xây dựng một quy trình Realtime RT-PCR hiệu quả đòi hỏi khảo sát kỹ lưỡng primer và probe. Primer là các đoạn oligonucleotide ngắn, bổ sung với vùng DNA đích và có vai trò khởi đầu quá trình nhân bản. Probe là các đoạn oligonucleotide gắn với chất phát huỳnh quang, giúp phát hiện và định lượng sản phẩm PCR. Chất lượng của primer và probe ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Trong quá trình khảo sát, các yếu tố như chiều dài, thành phần nucleotide, nhiệt độ nóng chảy và cấu trúc thứ cấp của primer và probe cần được xem xét. Mục tiêu là chọn ra các primer và probe có khả năng khuếch đại hiệu quả và đặc hiệu đoạn mRNA E7 HPV16.

4.1. Thiết kế Primer và Probe chuyên biệt cho mRNA E7 HPV16

Thiết kế primer và probe là bước quan trọng nhất trong việc xây dựng quy trình Realtime RT-PCR. Primer cần được thiết kế sao cho bổ sung đặc hiệu với vùng mRNA E7 HPV16 và không có khả năng bắt cặp với các đoạn gen khác. Probe cần được thiết kế sao cho bám vào vùng giữa hai primer và phát huỳnh quang khi được cắt bởi DNA polymerase. Các phần mềm chuyên dụng như Primer3 hoặc IDT OligoAnalyzer có thể hỗ trợ quá trình thiết kế. Chất lượng thiết kế ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả và độ đặc hiệu.

4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của Primer

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của primer. Chiều dài primer (thường từ 18-25 nucleotide), thành phần GC (khoảng 40-60%), và nhiệt độ nóng chảy (Tm) cần được tối ưu hóa. Primer cần tránh có cấu trúc kẹp tóc (hairpin) hoặc dimer, có thể làm giảm hiệu quả khuếch đại. Nồng độ primer cũng cần được điều chỉnh để đảm bảo đủ lượng primer cho phản ứng mà không gây ra hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu.

4.3. Phương pháp kiểm tra và tối ưu hóa Primer và Probe đã thiết kế

Sau khi thiết kế, primer và probe cần được kiểm tra và tối ưu hóa bằng các thí nghiệm thực tế. Các thí nghiệm này bao gồm kiểm tra khả năng khuếch đại, độ đặc hiệu, và độ nhạy của primer và probe. Các thông số như nhiệt độ lai (annealing temperature) và nồng độ Mg2+ có thể cần được điều chỉnh để tối ưu hóa phản ứng. Kết quả từ các thí nghiệm này sẽ giúp chọn ra các primer và probe tốt nhất cho quy trình Realtime RT-PCR.

V. Ứng dụng Realtime RT PCR Kết quả Nghiên cứu trên Bệnh phẩm 58 ký tự

Sau khi xây dựng và tối ưu hóa quy trình, Realtime RT-PCR được ứng dụng để phân tích mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung. Mục tiêu là đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình trong việc phát hiện mRNA E7 HPV16. Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện chính xác sự hiện diện và tải lượng virus HPV trong mẫu. Thông tin này có giá trị trong chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi điều trị ung thư cổ tử cung. Theo kết quả nghiên cứu trong tài liệu gốc, quy trình phát hiện mRNA E7 HPV16 đã được thử nghiệm trên 20 mẫu bệnh phẩm.

5.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình Realtime RT PCR

Độ nhạy của quy trình được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu có nồng độ mRNA E7 HPV16 khác nhau. Độ nhạy là khả năng của quy trình để phát hiện mRNA E7 HPV16 ở nồng độ thấp. Độ đặc hiệu được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu không chứa mRNA E7 HPV16. Độ đặc hiệu là khả năng của quy trình để không phát hiện mRNA E7 HPV16 trong các mẫu âm tính. Cả độ nhạy và độ đặc hiệu đều là các yếu tố quan trọng để đảm bảo tính chính xác của quy trình.

5.2. Phân tích kết quả Realtime RT PCR trên mẫu bệnh phẩm thực tế

Khi phân tích mẫu bệnh phẩm thực tế, kết quả Realtime RT-PCR được biểu thị bằng giá trị Ct (cycle threshold). Ct là số chu kỳ PCR cần thiết để đạt đến một ngưỡng huỳnh quang nhất định. Giá trị Ct càng thấp, lượng mRNA E7 HPV16 trong mẫu càng cao. Kết quả được so sánh với các mẫu chứng dương và chứng âm để xác định sự hiện diện và tải lượng virus HPV. Phân tích kết hợp với các thông tin lâm sàng khác giúp đưa ra chẩn đoán chính xác.

5.3. Giá trị lâm sàng của việc phát hiện và định lượng mRNA E7 HPV16

Việc phát hiện và định lượng mRNA E7 HPV16 có giá trị lâm sàng quan trọng. Kết quả xét nghiệm giúp xác định nguy cơ phát triển ung thư cổ tử cung, hỗ trợ quyết định điều trị và theo dõi hiệu quả điều trị. Tải lượng mRNA E7 HPV16 có thể được sử dụng để tiên lượng khả năng tái phát bệnh. Thông tin này giúp bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị cá nhân hóa và cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân.

VI. Kết luận và Tương lai Phát triển Xét nghiệm mRNA E7 HPV16 59 ký tự

Nghiên cứu này đã xây dựng và ứng dụng thành công quy trình Realtime RT-PCR để phát hiện và định lượng mRNA E7 HPV16 trong mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung. Quy trình này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hứa hẹn là công cụ chẩn đoán và tiên lượng hiệu quả. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình, mở rộng ứng dụng lâm sàng và tích hợp với các phương pháp chẩn đoán khác. Mục tiêu cuối cùng là cải thiện công tác phòng ngừa, phát hiện sớm và điều trị hiệu quả ung thư cổ tử cung, giảm gánh nặng bệnh tật cho phụ nữ. Theo nghiên cứu, trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình, mở rộng ứng dụng lâm sàng và tích hợp với các phương pháp chẩn đoán khác.

6.1. Tóm tắt những đóng góp chính của nghiên cứu

Nghiên cứu này đã đóng góp vào việc phát triển một phương pháp chẩn đoán tiên tiến cho ung thư cổ tử cung. Quy trình Realtime RT-PCR phát hiện mRNA E7 HPV16 cung cấp thông tin chính xác về hoạt động của virus HPV, giúp đánh giá nguy cơ phát triển ung thư. Nghiên cứu cũng đã cung cấp dữ liệu về độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình trên mẫu bệnh phẩm thực tế. Những đóng góp này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện công tác chẩn đoán và điều trị bệnh.

6.2. Hướng phát triển và nghiên cứu tiếp theo

Trong tương lai, cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình Realtime RT-PCR để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu, giảm chi phí và thời gian thực hiện. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của quy trình trong việc theo dõi đáp ứng điều trị và tiên lượng tái phát bệnh. Việc tích hợp quy trình này với các phương pháp chẩn đoán khác như xét nghiệm HPV DNA và soi cổ tử cung cũng là một hướng đi tiềm năng.

6.3. Tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong sàng lọc và chẩn đoán sớm

Quy trình Realtime RT-PCR phát hiện mRNA E7 HPV16 có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung. Việc triển khai quy trình này tại các cơ sở y tế sẽ giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, khi khả năng điều trị thành công cao hơn. Sàng lọc định kỳ bằng quy trình này có thể giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do ung thư cổ tử cung.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU UTCTC cho đến nay vẫn là một vấn đề sức khỏe đối với phụ nữ trên toàn cầu, đặc biệt là các phụ nữ đang sống ở các nước đang phát triển. Theo con số thống kê trên toàn cầu mỗi năm có đến 452.000 ca mới mắc UTCTC. Gần 80% các trường hợp ung thư mới này tập trung ở các nước đang phát triển, nơi mà chương trình tầm soát UTCTC chưa hoạt động có hiệu quả. Ở các quốc gia đang phát triển, UTCTC có tỉ lệ mắc bệnh đứng thứ nhì sau ung thư vú và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ.

Trên thế giới mỗi năm, UTCTC đã lấy đi mạng sống của 231.000 phụ nữ và hơn 80% số này diễn ra ở các nước đang phát triển. Theo số liệu của WHO, có đến 50% các trường hợp UTCTC xảy ra ở châu Á. [49] Ở Việt Nam nếu chỉ tính riêng UTCTC thì số người chết vì HPV đã cao hơn nhiều so với HIV. Trong 10 năm qua có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì UTCTC cao gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các tổn thương do HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện sớm.

Tuy nhiên thực tế ở Việt nam, phần lớn bệnh nhân ung thư cổ tử cung chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, vài năm trước khi qua đời. [45] Hầu hết tất cả các ca UTCTC đều có liên quan Human papillomavirus (HPV), một loại virus có DNA đặc thù theo mô dễ lây lan rộng rãi. Hiện vẫn không có thuốc điều trị đặc hiệu cho nhiễm HPV [34,15,6]. HPV là một tổ hợp các chủng vi rút khác nhau [13].

Người ta biết tới hơn 100 loại HPV, trong đó hai type HPV nguy cơ cao có liên quan tới khoảng 70% tất cả các ca ung thư cổ tử cung: HPV -16 và -18. Ung thư cổ tử cung có thể phòng tránh được nếu phát hiện sớm được các tổn thương tiền ung thư và điều trị. [51] Với những điều nêu trên chúng tôi tiến hành: “xây dựng quy trình phát hiện và định lượng E7 mRNA Human papillomavirus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật Realtime RT – PCR ” Nội dung chính của đề tài bao gồm: Trang: 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Thiết kế và đánh giá các primer, probe chuyên biệt cho E7 mRNA của HPV type 16. - Xây dựng quy trình Real time RT – PCR nhằm phát hiện và định lượng E7 mRNA của bệnh nhân nhiễm HPV type 16.

- Thử nghiệm quy trình Realtime RT-PCR trên bệnh phẩm. Trang: 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang: 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP I. BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG I.1Định nghĩa : [60] UTCTC là những tổn thương ác tính phát triển tại cổ tử cung. Ung thư xuất hiện khi các tế bào cổ tử cung biến đổi và phát triển bất thường một cách không kiểm soát.

Ung thư cổ tử cung tiến triển bằng cách có thể xâm lấn tại chỗ hay lan rộng đến những cơ quan khác của cơ thể và gây tử vong. Nhiễm lâu dài virus papilloma (HPV) là điều kiện cần để dẫn đến ung thư cổ tử cung. Theo nghiên cứu của Cơ quan Quốc tế nghiên cứu về ung thư thì 99,7% các trường hợp ung thư cổ tử cung có sự hiện diện của Human Pappiloma Virus (HPV) type nguy cơ cao. Hình 1: Ba giai đoạn tăng trưởng bất thường của tế bào I.2 Sinh bệnh học:[57] Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung hay nghịch sản cổ tử cung (thường được Trang: 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP viết tắt là CIN, theo tiếng Anh Cervical Intraepithelial Neoplasia) chỉ những thay đổi của niêm mạc cổ tử cung có tiềm năng ác tính nhưng chưa có sự xâm nhập vào mô đệm.

Đa số hiện tượng này xuất hiện ở vùng chuyển tiếp giữa biểu mô lát và biểu mô tuyến (hay biểu mô trụ) của cổ tử cung. Đây là vùng thường xuyên biến đổi và rất nhạy cảm với những thay đổi của môi trường xung quanh nó. Từ tân sinh trong biểu mô cổ tử cung có thể sẽ diễn tiến thành ung thư tại chỗ, rồi ung thư xâm lấn cổ tử cung .3 Tác nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung: I.1 Tác nhân gây bệnh: [2,38] Human papillomavirus là tác nhân chủ yếu gây ra các ca UTCTC. Human papillomaviruses là những virus có DNA mạch đôi, vòng nhỏ, thuộc họ Papovaviridae.

Có hơn 100 type HPV khác nhau đã được xác định, trong đó 40 type được biết là gây nhiễm qua đường tình dục. Hình 2: Human papillomavirus Papillomaviruses được Giuseppeffo Ciu mô tả lần đầu tiên vào năm 1907, nhưng HPV vẫn chưa đươc nghiên cứu rộng rãi cho đến khi Khoa Virut học có mặt vào năm 1970. HPV được phân loại bao gồm : nguy cơ cao và nguy cơ thấp. Những type HPV nguy cơ thấp, như là 6 và 11, gây ra những tổn thương nhẹ với nguy cơ phát triển thành ác tính là thấp.

Trái lại, HPVs nguy cơ cao có gene gây ung thư tiềm ẩn. Trang: 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Khoảng 90% ung thư trong thượng mô cổ tử cung (CIN) mức độ cao có chứa DNA HPV nguy cơ cao, với type HPV 16 phổ biến nhất, theo sau là type 18, 31, 33 và 45 [30]. Trong đó, type 16 chiếm khoảng 50 – 70 %, còn type 18 là 7 – 20 % [27].2Đặc điễm của HPV: [16,40,41] Đặc Điểm sinh học: Bộ gene của HPV có chiều dài khoảng 8000 bp, mã hóa 8 khung đọc mở (ORFs), được phiên mã như mRNAs polycistronic. Những trình tự điều hòa cần thiết cho sự sao chép và phiên mã của virus được tập trung trong một vùng không mã hóa gọi là “vùng điều hòa ngược” hay “vùng kiểm soát dài”.

Sản phẩm gene được chia ra bao gồm protein “sớm” và “trễ” phụ thuộc vào thời điểm biểu hiện trong suốt chu kỳ sống của virus. Những phân tử quyết định cho sự sao chép của virus là E6 và E7, với chức năng làm bất hoạt sản phẩm của hai gene đàn áp khối u là p53 và pRb. Cả hai gen gây ung thư này đều gây ra sự tăng nhanh, sự bất tử và những thay đổi ác tính của những tế bào bị nhiễm. Hoạt động của E6 là chất đàn áp apoptosis và làm trung gian cho sự sống sót của những tế bào bị hư hại nghiêm trọng, trong khi chức năng của E7 như là một chất hoạt hóa cho sự sao chép và sự tăng trưởng của tế bào.

Cả hai có thể làm bất tử tế bào người một cách độc lập, nhưng chức năng chung là tạo ra hiệu quả bổ trợ và bổ sung nhau, gây ra sự tăng lên rõ ràng trong hoạt động biến đổi. Trang: 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 3: Cấu trúc bộ gene HPV type 16 Sự tiến triển từ nhiễm HPV thành ung thư cổ tử cung: [4,32,33] Ung thư cổ tử cung bắt nguồn từ nhiễm HPV. Hầu hết các viêm nhiễm đều tự biến mất mà không hề có triệu chứng, nhưng viêm nhiễm kéo dài với các loại có nguy cơ cao có thể dẫn đến bị các bất thường tiền UTCTC và gây nên các tổn thương trong biểu mô cổ tử cung độ thấp. Trong số các phụ nữ nhiễm các loại HPV nguy cơ cao, khoảng từ 5% đến 10% sẽ chuyển thành viêm nhiễm HPV kéo dài và vì vậy làm tăng nguy cơ xuất hiện các tổn thương tiền ung thư ở cổ tử cung.

Nếu không được điều trị, các tổn thương tiền ung thư này sẽ tiến triển thành ung thư cổ tử cung xâm lấn. Cả ung thư và tiền ung thư thường xuất hiện ở “khu vực ranh giới” ở cổ tử cung, và tiến triển mạnh hơn trong thời kỳ dậy thì và mang thai. Thông thường, các lớp trên cùng của biểu mô cổ tử cung chết đi và bong ra, và các tế bào mới lại tiếp tục được sản sinh. Tuy nhiên, đối với viêm nhiễm HPV kéo dài, thì tiến trình này bị ngắt quãng; các tế bào có xu hướng tiếp tục sản sinh, trước tiên sẽ trở thành bất thường (tiền ung thư), và sau đó sẽ xâm lấn tới các biểu mô phía dưới (ung thư xâm lấn).

Vì sự tiến triển từ nhiễm HPV đến ung thư xâm lấn là rất chậm, thường kéo dài hàng chục năm, cho nên chúng ta thường gặp ở phụ nữ ở độ tuổi 40 và 50. Tham khảo hình 4 về tỷ lệ tử vong do ung thư cổ tử cung theo độ tuổi.[15 – 19 ] Trang: 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 4: Tỷ lệ tử vong ung thư cổ tử cung chia theo lứa tuổi trên 100000 phụ nữ I. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và ở Việt Nam: I.1 Tình hình bệnh trên thế giới: [1,20,21,24,25] Trên toàn thế giới, hằng năm có trên 250 ngàn phụ nữ tử vong vì căn bệnh này. Tại vùng cận sa mạc Sahara Châu Phi, Mỹ La tinh và Nam Á, số người mới nhiễm và tỷ lệ tử vong là cao nhất (hình 5).

Nhìn tổng thể, tỷ lệ tử vong tại các nước đang phát triển cao gấp 4 lần tại các nước công nghiệp; 80% đến 85% ca tử vong do ung thư cổ tử cung xảy ra tại các nước đang phát triển. Ở các vùng này, ung thư cổ tử cung thường xảy ra ở những phụ nữ có nhiều con, và họ chết đi đã kéo theo sự ảnh hưởng rất lớn đến xã hội của cộng đồng nơi họ sinh sống. Theo điều tra của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, tỷ lệ nhiễm HPV của phụ nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9 – 13 %, nghĩa là cứ 10 phụ nữ thì có 1 người bị nhiễm HPV. Tại Mỹ, có khoảng 40% phụ nữ trẻ nhiễm HPV trong vòng 3 năm sau khi có quan hệ tình dục.

Ở Pháp, mỗi năm có khoảng gần 3,400 trường hợp ung thư cổ tử cung được chẩn đoán và có hơn 1,000 phụ nữ tử vong vì chứng bệnh này. Mặc dù ung thư cổ tử cung ngày càng giảm dần ở các nước phát triển, nơi mà việc sàng lọc phát hiện Trang: 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP bệnh đã được thực hiện khá lâu, căn bệnh này vẫn rất phổ biến ở các nước thuộc thế giới thứ ba. Hình 5: Số ca ước tính và tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung I.2 Tình hình bệnh ở Việt Nam:[49] Ở Việt Nam, KCTC chiếm tỉ lệ 53,5% các loại ung thư ở nữ giới. WHO ước tính tỉ lệ KCTC ở phụ nữ Việt Nam từ 16 đến 24/100.

Theo các con số thống kê ở Hà Nội và TP. HCM 1996 – 1999 tỉ lệ mắc chuẩn theo tuổi tính trên 100000 dân lần lượt là 5. Như vậy tỉ lệ ung thư cổ tử cung ở TP. HCM tương đối cao nếu đem so sánh với thống kê ở Mỹ (SEER) là 7.