MỞ ĐẦU Vi rút là một trong những nguyên nhân gây ra một số bệnh nghiêm trọng ở ngƣời nói chung. Riêng vi rút viêm gan B gọi tắt là HBV (Hepatitis B virus ), vi rút viêm gan C gọi tắt là HCV (Hepatitis C virus), vi rút gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời HIV (Human immunodeficiency virus) là vi rút gây bệnh thông qua đƣờng máu. Các vi rút này biến đổi liên tục về cấu trúc và hệ gen để trốn thoát các loại sinh phẩm xét nghiệm hậu quả là tăng tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng. Phƣơng pháp xét nghiệm dùng cho sàng lọc HIV, HBV và HCV lây qua đƣờng truyền máu là xác định tác nhân gây bệnh gián tiếp dựa trên kết quả của phản ứng miễn dịch “kháng nguyên-kháng thể”.
Ƣu điểm của xét nghiệm là đơn giản, tốn ít thời gian, giá thành hợp lý, song phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là trong giai đoạn “cửa sổ” khi đó kháng thể hoặc kháng nguyên chƣa đạt ngƣỡng phát hiện, do vậy xét nghiệm sẽ cho ra kết quả âm tính. Bên cạnh đó, tƣơng tác không đặc hiệu của kháng thể hoặc kháng nguyên với những bất thƣờng protein khác trong máu có cấu trúc gần giống với kháng nguyên hoặc kháng thể có thể dẫn đến kết quả dƣơng tính giả. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật NAT đã đƣợc đƣa vào sử dụng, kỹ thuật này có độ nhạy cao cho phép phát hiện và nhân bản đặc hiệu theo hàm mũ các trình tự đích của tác nhân gây bệnh từ một lƣợng nhỏ vi rút, do đó, cho phép phát hiện sớm và chính xác các tác nhân gây bệnh. Hơn thế nữa, NAT có thể đƣợc sử dụng để phát hiện đồng thời HIV, HBV và HCV thông qua một xét nghiệm trong thời gian là 4-5 giờ, đảm bảo an toàn cho đơn vị máu truyền.
Trên Thế giới, ở các nƣớc phát triển, để đảm bảo sàng lọc máu Anh, Pháp, Mỹ, Úc thực hiện xét nghiệm song song giữa phƣơng pháp gián tiếp kháng nguyên – kháng thể và xét nghiệm NAT cho đơn vị máu từ cuối những năm 1990 đầu những năm 2000. Năm 1997, Hội chữ thập đỏ Đức đã sử dụng PCR cho mục đích sàng lọc HCV RNA cho ngƣời hiến máu, tiếp theo là Nhật Bản và Scotland. Sau đó vào tháng 3/1998 ngƣời ta đã giới thiệu NAT cho xét nghiệm HCV RNA[50]. TrÇn V©n Chi 9 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ở Việt Nam, hầu hết các phòng xét nghiệm sàng lọc HIV, HBV và HCV đều sử dụng phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên kháng thể hay còn gọi là xét nghiệm huyết thanh học, xét nghiệm NAT chƣa đƣợc sử dụng.
Năm 2008 đề tài cấp Bộ về ứng dụng NAT cho xét nghiệm sàng lọc máu đạt kết quả tốt [3]. Đến năm 2015, Viện HHTMTW thực hiện theo Thông tƣ 26 TT-BYT ngày 16/9/2014 Hƣớng dẫn hoạt động truyền máu, triển khai xét nghiệm NAT đảm bảo an toàn truyền máu. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật NAT (nucleic acid) phát hiện sớm sự có mặt vi rút HIV, HBV, HCV ở ngƣời cho máu” nhằm hƣớng tới công tác xét nghiệm sàng lọc sớm các tác nhân lây qua đƣờng truyền máu này một cách chính xác, đảm bảo an toàn, chất lƣợng cho máu và chế phẩm sử dụng trong điều trị. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Khảo sát tỷ lệ HBsAg, anti HCV, HIVAgAb phản ứng trên đơn vị máu hiến đƣợc xét nghiệm miễn dịch bằng kỹ thuật CMIA, ECLIA.
Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần. - Tỷ lệ HBV, HCV, HIV phản ứng phát hiện bằng kỹ thuật NAT (nucleic acid) trên đơn vị máu hiến mà xét nghiệm miễn dịch không phát hiện đƣợc, theo dõi ngƣời hiến máu có phản ứng kỹ thuật NAT, phát hiện sớm hệ gen vi rút nhằm bổ trợ cho xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên- kháng thể. TrÇn V©n Chi 10 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong xét nghiệm sàng lọc máu nói riêng và trong chẩn đoán bệnh nói chung, xét nghiệm vi rút luôn là 1 trong những xét nghiệm liên tục đƣợc nâng cấp nhờ có sự biểu biết ngày càng sâu về sinh học phân tử của vi rút. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC HBV, HCV, HIV 1.
Đặc điểm sinh học của HBV. Bệnh viêm gan B. Vi rút viêm gan B (HBV) đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Blumberg vào năm 1976. Cho đến nay khoa học đã có đƣợc những hiểu biết sâu sắc về dịch tễ học, cách thức truyền nhiễm, cơ chế sao chép phân tử, miễn dịch, các phƣơng thức ngăn chặn hữu hiệu và các phƣơng pháp điều trị đối với HBV.
Cho đến nay đã phát hiện đƣợc 5 loại vi rút chính gây nên bệnh viêm gan đó là vi rút viêm gan A,B,C,D,E. Trong đó vi rút viêm gan B là nguy hiểm nhất với tỷ lệ tử vong cao nhất, trung bình hàng năm trên thế giới có 1-2 triệu ngƣời tử vong do vi rút này gây ra[61]. Viêm gan do vi rút hiện nay vẫn là một bệnh rất phổ biến trên toàn Thế giới và luôn là mối quan tâm lớn đối với công tác y tế của toàn cầu. Bệnh có tỉ lệ ngƣời mắc cao và thƣờng gây nên những hậu quả nặng nề nhƣ viêm gan mạn, xơ gan và ung thƣ gan nguyên phát.
Viêm gan là tổn thƣơng tại gan với sự có mặt của các tế bào bị viêm trong mô gan. Tình trạng bệnh có thể là tự khỏi hoặc có thể phát triển tới việc gây sẹo tại gan. Viêm gan cấp tính là khi bệnh chỉ kéo dài dƣới 6 tháng, còn viêm gan mãn tính là khi bệnh kéo dài hơn. Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu thì không có sự giống nhau về triệu chứng và sự đáp ứng lại liệu pháp kháng vi rút của bệnh nhân mắc bệnh viêm gan mạn tính ở các vùng khác nhau trên Thế giới do có sự khác nhau giữa các kiểu gen của HBV [31,33].
TrÇn V©n Chi 11 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tình hình nhiễm HBV Theo Tổ chức Y tế Thế giới thì gần 30% dân số Thế giới, tƣơng đƣơng khoảng 2 tỷ ngƣời có bằng chứng huyết thanh nhiễm HBV. Ƣớc tính khoảng 350-400 triệu ngƣời trong tổng số những ngƣời này mắc viêm gan B mạn tính, và mỗi năm có khoảng 1-2 triệu trƣờng hợp tử vong vì bệnh gan mạn tính, gồm bệnh xơ gan và ung thƣ gan. Châu Á và Tây Thái Bình Dƣơng là vùng lƣu hành cao của HBV, chiếm khoảng 3/4 số nhiễm HBV mạn tính trên Thế giới [38,58,59].
Việt Nam là nƣớc có tỷ lệ hiện mắc viêm gan B cao; ƣớc tính có khoảng 8,6 triệu ngƣời nhiễm vi rút viêm gan B. Tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính đƣợc ƣớc tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới. Nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính là nguyên nhân chính gây bệnh gan ở Việt Nam nhƣ xơ gan và ung thƣ gan.Tiêm chủng vắc xin viêm gan B cho tất cả trẻ sơ sinh đã đƣợc triển khai từ năm 2003. Tỷ lệ bao phủ của vắc xin viêm gan B năm 2012 là 97% và tỷ lệ bao phủ liều sau sinh tăng lên 75% trong năm 2012 so với 65% của năm 2006.
Theo một cuộc khảo sát năm 2011, chỉ còn 2% trẻ dƣới 5 tuổi bị nhiễm vi rút viêm gan B. Việt Nam đang hƣớng tới mục tiêu giảm tỷ lệ hiện mắc viêm gan B xuống dƣới 1% ở trẻ dƣới 5 tuổi vào năm 2017 [12]. Cấu trúc và đặc điểm nhân lên của HBV 1. Cấu trúc hình thể HBV HBV thuộc họ Hepadnaviridae, vi rút mang vật chất di truyền là ADN, gây viêm gan.
HBV có bộ gen là phân tử ADN chuỗi kép, chiều dài khoảng 3,2 kp. HBV có dạng hình cầu, hình sợi, đƣờng kính trung bình từ 42-45 nm. Vi rút tồn tại dƣới 3 kích thƣớc 20-22 nm, 42-45 nm và 20-200 nm. Vi rút có sức đề kháng tốt với nhiệt độ, ở 1000C trong 30 phút vi rút mới bị chết, ở nhiệt độ thƣờng chúng có thể sống trong thời gian dài từ 5-6 tháng, ở nhiệt độ lạnh thì rất bền vững, chúng có thể sống tới 20 năm ở -200C [8].
TrÇn V©n Chi 12 LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trƣớc đây, HBV đƣợc phân ra làm 4 kiểu huyết thanh: adr, adw, ayr và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên bề mặt vi rút B, tuy nhiên cho đến nay có rất ít dữ liệu về vai trò của các kiểu huyết thanh này. Ngày nay, những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi ADN của HBV, từ đó đã phân loại HBV thành 8 kiểu gen khác nhau (A-H) dựa vào sự khác nhau trên 8% toàn bộ trình tự chuỗi của hệ gen. Sự phân bố các kiểu gen là khác nhau ở các châu lục và các nƣớc khác nhau. Kiểu A thấy nhiều nhất ở châu Âu, Bắc Mỹ và châu Phi trong khi đó kiểu B và C phổ biến ở Đông Nam Á, kiểu D là dạng chiếm ƣu thế nhất ở Nam Âu cũng nhƣ ở vùng Trung Đông, kiểu E phân bố khắp châu Phi trong khi kiểu F đƣợc tìm thấy ở ngƣời Ấn Độ gốc Nam Mỹ.
Kiểu G mới đƣợc tìm thấy gần đây và thấy ở châu Âu và Bắc Mỹ [6,12]. HBV có 3 loại kháng nguyên là HBsAg, HBcAg và HBeAg. HBsAg là kháng nguyên bề mặt của lớp vỏ ngoài lipoprotein của vi rút với các polypeptide có khối lƣợng phân tử khác nhau. Kháng nguyên này thƣờng thấy xuất hiện trong tế bào chất của các tế bào gan của bệnh nhân viêm gan B.
Kháng nguyên bề mặt có ở 3 loại vi rút HBV và có sự khác nhau giữa chúng. Có loại HBV mang cả 3 loại kháng nguyên HBsAg đó là HBsAg kích thƣớc lớn, vừa và nhỏ. Có loại HBV chỉ có HBsAg kích thƣớc lớn và vừa, loại HBV hình cầu nhỏ kích thƣớc 20-200 nm chỉ có HBsAg loại nhỏ. Lõi bên trong của vi rút có protein HBcAg, HBeAg, một sợi ADN đơn (-) và enzyme ADN polymerase.
Trong tất cả các vi rút đã biết thì HBV là nhỏ nhất. HBcAg là kháng nguyên của capsid, thƣờng thấy trong nhân tế bào gan của bệnh nhân mắc bệnh và chỉ có ở HBV kích thƣớc 42-45nm. HBeAg là protein chƣa biết rõ nguồn gốc nhƣng ngƣời ta cho rằng nó có thể là một phần của HBcAg đã bị biến đổi.