Luận văn thạc sĩ vnu uet phát hiện gián tiếp đột biến gen egfr trong ung thư biểu mô tuyến của phổi bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch luận văn ths công nghệ nano sinh học chuyên ngành đào tạo thí điểm

Luận văn thạc sĩ VNU UET nghiên cứu phát hiện đột biến gen EGFR trong ung thư phổi bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch và công nghệ nano sinh học.

• Tác giả: Ninh Văn Quyết
• Người hướng dẫn: TS. Trần Đăng Khoa
• Trường học: Trường Đại học Công nghệ - ĐHQGHN
• Chuyên ngành: Công nghệ Nano Sinh học
• Đề tài: Ph¸t hiÖn gi¸n tiÕp §éT biÕn gen EGFR trong ung th¦ biÓu m¤ tuyÕn cña phæi b»ng kü thuËt hãa m¤ miÔn dÞch
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược về dịch tễ học ung thư phổi và các yếu tố nguy cơ
• 1.2. Một số đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng của ung thư phổi và ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 1.3. Đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 1.4. Đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 1.5. Hóa mô miễn dịch
• 1.6. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch
• 1.7. Các nguyên lý của phương pháp hóa mô miễn dịch
• 1.8. Yêu cầu kỹ thuật
• 1.9. Phương pháp
• 1.10. Một số phương pháp khác phát hiện đột biến gen EGFR
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn
• 2.3. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.4. Địa điểm nghiên cứu
• 2.5. Thời gian nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7. Thiết kế nghiên cứu
• 2.8. Cỡ mẫu và chọn mẫu
• 2.9. Biến số nghiên cứu
• 2.10. Các bước tiến hành nghiên cứu
• 2.11. Xử lí số liệu
• 2.12. Khía cạnh đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân bố bệnh theo tuổi và giới
• 3.2. Chất lượng tiêu bản được phủ chất hiện màu ở thời gian 1 phút và 3 phút
• 3.3. Hóa mô miễn dịch đột biến gen EGFR
• 3.4. Bộc lộ dấu ấn EGFR
• 3.5. Bộc lộ dấu ấn EGFR đánh giá theo mức độ biểu hiện trên HMMD
• 3.6. Một số mối liên quan
• 3.7. Bộc lộ dấu ấn EGFR theo tuổi
• 3.8. Bộc lộ dấu ấn EGFR theo giới
• 3.9. Đối chiếu kết quả giữa hóa mô miễn dịch và phương pháp PCR phát hiện đột biến gen EGFR trong UTBMT phổi
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Một số đặc điểm về giới và tuổi
• 4.2. Thời gian phủ chất hiện màu ảnh hưởng đến chất lượng tiêu bản
• 4.3. Bộc lộ EGFR
• 4.4. Liên quan giữa bộc lộ EGFR với các yếu tố
• 4.5. Liên quan giữa bộc lộ EGFR với tuổi
• 4.6. Liên quan giữa bộc lộ EGFR với giới
• 4.7. Đối chiếu kết quả giữa hóa mô miễn dịch và phương pháp PCR phát hiện đột biến gen EGFR trong UTBMT phổi
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện đột biến gen EGFR trong ung thư phổi

Đột biến gen EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) đã trở thành một trong những yếu tố quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị ung thư phổi, đặc biệt là ung thư biểu mô tuyến. Việc phát hiện sớm các đột biến này có thể giúp bác sĩ lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp, nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (HMMD) đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện đột biến gen EGFR, mang lại nhiều lợi ích cho việc chẩn đoán và điều trị ung thư phổi.

1.1. Đột biến gen EGFR và vai trò trong ung thư phổi

Đột biến gen EGFR là một trong những nguyên nhân chính gây ra sự phát triển của ung thư phổi. Các nghiên cứu cho thấy rằng khoảng 10-15% bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến này. Việc phát hiện đột biến gen EGFR giúp xác định bệnh nhân có khả năng đáp ứng tốt với liệu pháp điều trị trúng đích, từ đó cải thiện chất lượng cuộc sống và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.

1.2. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong phát hiện đột biến gen

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (HMMD) là một phương pháp hiệu quả trong việc phát hiện đột biến gen EGFR. Phương pháp này sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện sự hiện diện của protein EGFR trong mô bệnh học. Kỹ thuật này không chỉ giúp xác định tình trạng đột biến mà còn cung cấp thông tin về mức độ biểu hiện của gen, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra quyết định điều trị.

II. Thách thức trong việc phát hiện đột biến gen EGFR

Mặc dù kỹ thuật hóa mô miễn dịch đã mang lại nhiều lợi ích trong việc phát hiện đột biến gen EGFR, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những thách thức lớn nhất là độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này. Đôi khi, kết quả có thể không chính xác do chất lượng mẫu hoặc kỹ thuật thực hiện. Ngoài ra, sự đa dạng của các loại đột biến gen EGFR cũng làm cho việc phát hiện trở nên phức tạp hơn.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật hóa mô miễn dịch

Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật hóa mô miễn dịch là hai yếu tố quan trọng quyết định tính chính xác của kết quả phát hiện đột biến gen EGFR. Nghiên cứu cho thấy rằng độ nhạy của phương pháp này có thể dao động từ 70-90%, tùy thuộc vào chất lượng mẫu và kỹ thuật thực hiện. Việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán.

2.2. Sự đa dạng của các loại đột biến gen EGFR

Đột biến gen EGFR có thể xảy ra ở nhiều vị trí khác nhau trong gen, dẫn đến sự hình thành của nhiều loại protein khác nhau. Sự đa dạng này làm cho việc phát hiện trở nên khó khăn hơn, vì không phải tất cả các loại đột biến đều có thể được phát hiện bằng cùng một phương pháp. Do đó, cần có các phương pháp bổ sung để xác định chính xác tình trạng đột biến.

III. Phương pháp phát hiện đột biến gen EGFR hiệu quả

Để phát hiện đột biến gen EGFR một cách hiệu quả, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Trong đó, kỹ thuật hóa mô miễn dịch và phương pháp PCR là hai phương pháp phổ biến nhất. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ phụ thuộc vào từng trường hợp cụ thể.

3.1. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch HMMD

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (HMMD) là một phương pháp hiệu quả trong việc phát hiện đột biến gen EGFR. Phương pháp này sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện sự hiện diện của protein EGFR trong mô bệnh học. HMMD có thể cung cấp thông tin về mức độ biểu hiện của gen, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra quyết định điều trị.

3.2. Phương pháp PCR trong phát hiện đột biến

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể. Phương pháp này có độ nhạy cao và có thể phát hiện các đột biến gen EGFR với độ chính xác cao. Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu thiết bị và kỹ thuật viên có kinh nghiệm để thực hiện.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phát hiện đột biến gen EGFR

Việc phát hiện đột biến gen EGFR không chỉ có ý nghĩa trong việc chẩn đoán mà còn trong việc điều trị ung thư phổi. Các bác sĩ có thể dựa vào kết quả phát hiện để lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Liệu pháp điều trị trúng đích đã chứng minh được hiệu quả trong việc điều trị cho bệnh nhân có đột biến gen EGFR.

4.1. Liệu pháp điều trị trúng đích cho bệnh nhân ung thư phổi

Liệu pháp điều trị trúng đích là một phương pháp điều trị mới, tập trung vào việc ức chế các thụ thể tế bào có liên quan đến sự phát triển của ung thư. Đối với bệnh nhân có đột biến gen EGFR, liệu pháp này đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc giảm kích thước khối u và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.

4.2. Cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân

Việc phát hiện đột biến gen EGFR và áp dụng liệu pháp điều trị trúng đích không chỉ giúp kéo dài thời gian sống mà còn cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh nhân có đột biến gen EGFR thường có phản ứng tốt hơn với điều trị, từ đó giảm thiểu các triệu chứng và tác dụng phụ của bệnh.

V. Kết luận và tương lai của phát hiện đột biến gen EGFR

Phát hiện đột biến gen EGFR trong ung thư phổi bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua để nâng cao độ chính xác và hiệu quả của phương pháp này. Tương lai của nghiên cứu về đột biến gen EGFR hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ mới trong lĩnh vực y học.

5.1. Tiềm năng nghiên cứu và phát triển

Nghiên cứu về đột biến gen EGFR vẫn đang tiếp tục phát triển, với nhiều phương pháp mới được nghiên cứu và áp dụng. Các nhà khoa học đang tìm kiếm các biomarker mới để cải thiện khả năng phát hiện và điều trị ung thư phổi.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị ung thư phổi

Hướng đi mới trong điều trị ung thư phổi sẽ tập trung vào việc phát triển các liệu pháp điều trị trúng đích và cá nhân hóa điều trị dựa trên tình trạng gen của từng bệnh nhân. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư phổi hiện là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do bệnh lý ác tính trên toàn cầu. Theo ước tính từ các tổ chức y tế quốc tế, đến năm 2050 thế giới sẽ ghi nhận khoảng 27 triệu ca ung thư mới mắc cùng 17,5 triệu ca tử vong mỗi năm. Trong bức tranh dịch tễ học phức tạp đó, ung thư biểu mô tuyến của phổi chiếm tỷ lệ áp đảo từ 40% đến hơn 60% tổng số các ca ung thư phổi. Tại Việt Nam, thống kê y tế cho thấy mỗi năm có trên 20.000 trường hợp mắc mới và khoảng 17.000 bệnh nhân tử vong vì căn bệnh hiểm nghèo này.

Vấn đề then chốt trong điều trị ung thư biểu mô tuyến giai đoạn tiến triển là việc cá thể hóa phác đồ điều trị thông qua liệu pháp nhắm trúng đích bằng các thuốc ức chế tyrosine kinase như Gefitinib và Erlotinib. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị phụ thuộc hoàn toàn vào tình trạng đột biến của gen thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (EGFR). Từ năm 2009, Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã khuyến cáo bắt buộc phải xác định tình trạng gen EGFR trước khi chỉ định thuốc ức chế đặc hiệu.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Nano Sinh học của tác giả Ninh Văn Quyết tập trung giải quyết bài toán chẩn đoán với hai mục tiêu cụ thể: khảo sát quy trình kỹ thuật hóa mô miễn dịch để phát hiện gián tiếp đột biến gen EGFR và xác định tỷ lệ biểu hiện thụ thể này trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi. Nghiên cứu được thực hiện trên 120 mẫu bệnh phẩm sinh thiết thu thập tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Đơn vị Gen trị liệu thuộc Bệnh viện Bạch Mai trong giai đoạn từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2017.

Công trình mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi chứng minh kỹ thuật hóa mô miễn dịch đạt độ tương đồng 90% đến 100% so với phương pháp sinh học phân tử PCR ở các mức bộc lộ mạnh. Điều này mở ra giải pháp sàng lọc nhanh chóng, tiết kiệm chi phí xét nghiệm từ 60% đến 70% và đặc biệt hữu ích cho các mẫu mô sinh thiết kích thước nhỏ.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết sinh học phân tử tế bào về con đường truyền tín hiệu nội bào qua thụ thể tyrosine kinase và nguyên lý miễn dịch học huỳnh quang men:

• Mô hình dẫn truyền tín hiệu thụ thể EGFR: Gen EGFR nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 7 (vị trí 7p12) bao gồm 30 exon, mã hóa cho một glycoprotein xuyên màng có trọng lượng phân tử khoảng 170 kDa. Khi gắn với phối tử đặc hiệu như EGF hoặc TGF-alpha, thụ thể thực hiện phản ứng nhị hợp hóa và kích hoạt quá trình tự phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase nội bào. Quá trình này kích hoạt dòng thác tín hiệu qua các trục RAS/RAF/ERK, PI3K/AKT và STAT, thúc đẩy tế bào ung thư tăng sinh vô tổ chức, tăng sinh mạch máu và ức chế quá trình tự chết theo chương trình.
• Cơ chế đột biến kích hoạt: Các đột biến hoạt hóa tập trung chủ yếu từ exon 18 đến exon 21. Trong đó, đột biến mất đoạn tại exon 19 chiếm khoảng 44% và đột biến điểm thay thế L858R tại exon 21 chiếm khoảng 41% tổng số các đột biến nhạy cảm với thuốc điều trị đích.
• Nguyên lý phản ứng miễn dịch liên kết enzym: Kỹ thuật hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu (clone DAK-H1-WT của hãng Dako) nhận diện chọn lọc kháng nguyên protein EGFR đột biến cố định trên mảnh mô vùi paraffin. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể được khuếch đại qua hệ thống liên kết Avidin - Biotin gắn men Peroxidase, sau đó hiển thị màu nâu sắc nét dưới tác dụng của cơ chất Diaminobenzidine (DAB) trên kính hiển vi quang học.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng thiết kế mô tả cắt ngang trên các mẫu bệnh phẩm hồi cứu thu thập từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2017 tại Bệnh viện Bạch Mai. Cỡ mẫu tối thiểu được xác định theo công thức ước tính tỷ lệ trong quần thể:

$$N = Z_{1-\alpha/2}^2 \times \frac{p \times q}{d^2}$$

Với độ tin cậy 95% (tương ứng hệ số Z bằng 1,96), tỷ lệ đột biến gen EGFR dự kiến ở người Việt Nam là 64% (p = 0,64, q = 0,36) và sai số tuyệt đối chấp nhận d = 0,1, cỡ mẫu tối thiểu tính toán được là 89 trường hợp. Để gia tăng độ tin cậy và hạn chế sai số, tác giả đã tiến hành nghiên cứu trên 120 mẫu bệnh phẩm đạt chuẩn chẩn đoán ung thư biểu mô tuyến nguyên phát theo tiêu chuẩn phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).

Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nghiêm ngặt với các tiêu chuẩn loại trừ rõ ràng: loại bỏ các bệnh nhân ung thư thứ phát, người đã qua xạ trị hoặc hóa trị trước sinh thiết, và các mẫu bệnh phẩm hoại tử trên 50%. Tác giả lựa chọn hóa mô miễn dịch làm phương pháp phân tích chính vì kỹ thuật này bảo tồn nguyên vẹn cấu trúc mô bệnh học, có thể thực hiện trên các mảnh sinh thiết bấm rất nhỏ chỉ chứa vài tế bào u mà các kỹ thuật phân tích DNA thông thường (vốn đòi hỏi tỷ lệ tế bào u từ 30% đến 50%) không thể thực hiện được. Để kiểm chứng, 30 block bệnh phẩm đại diện đã được gửi sang Đơn vị Gen trị liệu để phân tích đối chiếu bằng kỹ thuật PCR sử dụng bộ kít EGFR XL StripAssay.

---

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phân tích 120 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi trong nghiên cứu mang lại các kết quả thống kê quan trọng:

• Đặc điểm phân bố nhân khẩu học: Nam giới chiếm 70% (84 bệnh nhân) và nữ giới chiếm 30% (36 bệnh nhân), tỷ lệ nam/nữ đạt mức 2,33/1. Độ tuổi trung bình của bệnh nhân là 60 tuổi (dao động từ 32 đến 80 tuổi). Bệnh nhân tập trung chủ yếu ở lứa tuổi trung niên và cao tuổi, trong đó nhóm tuổi 50-59 chiếm 31,67% và nhóm tuổi 60-69 chiếm 33,33%; tổng hai nhóm này chiếm tới 65% toàn bộ mẫu nghiên cứu.
• Tối ưu hóa thời gian hiện màu DAB: Thử nghiệm kỹ thuật trên 20 tiêu bản cho thấy thời gian phủ chất hiện màu DAB ở mốc 1 phút cho tỷ lệ 100% tiêu bản đạt chất lượng chuẩn, màu bắt rõ nét màng tế bào và không bị nhuộm nền. Ngược lại, khi kéo dài thời gian phủ DAB lên 3 phút, có tới 20% tiêu bản bị lỗi do hiện tượng bắt màu nền quá mức và biến dạng mẫu mô.
• Tỷ lệ bộc lộ dấu ấn EGFR: Có 100/120 trường hợp cho kết quả dương tính với EGFR bằng hóa mô miễn dịch, chiếm tỷ lệ 83,33%; chỉ có 20 trường hợp âm tính (16,67%). Đánh giá theo cường độ nhuộm ghi nhận: mức 0 (âm tính) chiếm 16,67%, mức 1+ chiếm 35,0% (42 ca), mức 2+ chiếm 37,5% (45 ca) và mức 3+ chiếm 10,83% (13 ca). Tỷ lệ dương tính ở nữ giới đạt 86,11% (31/36 ca), cao hơn so với nam giới là 82,14% (69/84 ca).
• Độ tương đồng cao giữa hóa mô miễn dịch và PCR: Kết quả đối chiếu trên 30 mẫu cho thấy ở nhóm có bộc lộ hóa mô miễn dịch mức 2+, tỷ lệ dương tính khi kiểm tra lại bằng PCR đạt 90% (9/10 ca). Đặc biệt, ở nhóm bộc lộ mức 3+, tỷ lệ phát hiện đột biến bằng PCR đạt tuyệt đối 100% (10/10 ca). Nhóm bộc lộ 1+ chỉ ghi nhận 20% dương tính trên PCR.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ nam/nữ trong nghiên cứu (2,33/1) phản ánh xu hướng dịch tễ học ung thư biểu mô tuyến đang gia tăng rõ rệt ở nữ giới so với các thập niên trước. Số liệu này tương đồng với các công bố của nhiều tác giả trong và ngoài nước: Burns ghi nhận tỷ lệ nam/nữ là 3,2/1, Murray công bố 2,53/1, tác giả Nguyễn Tiến Tuân ghi nhận 2,75/1 và tác giả Lê Trung Thọ chỉ ra tỷ lệ 2,87/1. Tỷ lệ mắc bệnh tập trung từ 50 tuổi trở lên (trên 95%) hoàn toàn phù hợp với cơ chế tích lũy tổn thương di truyền và thời gian phơi nhiễm kéo dài với các yếu tố nguy cơ như khói thuốc lá hay ô nhiễm môi trường.

Về tỷ lệ dương tính EGFR đạt 83,33%, kết quả này tương thích với nghiên cứu của tác giả Trịnh Tuấn Dũng (79,35%) và tác giả Hsu (74,2%). Sự khác biệt với một số nghiên cứu phương Tây (vốn chỉ ghi nhận tỷ lệ 30% đến 50%) xuất phát từ hai nguyên nhân chính: quần thể người Đông Á có tần suất đột biến EGFR cao hơn đáng kể so với người da trắng, và việc sử dụng kháng thể đơn dòng Dako clone DAK-H1-WT pha sẵn có độ nhạy rất cao với thụ thể.

Dữ liệu so sánh giữa cường độ hóa mô miễn dịch và kết quả PCR chứng minh hóa mô miễn dịch là công cụ sàng lọc phân tầng cực kỳ tin cậy. Khi trình bày dữ liệu này trên biểu đồ cột đối chiếu hoặc bảng tương quan 2x2, có thể thấy rõ các mẫu mô đạt mức 2+ và 3+ có giá trị dự đoán dương tính rất cao đối với đột biến gen. Đối với các mẫu âm tính hoặc chỉ bộc lộ 1+, chỉ định xét nghiệm PCR bổ sung là bước đi cần thiết nhằm phát hiện các đột biến hiếm ngoài exon 19 và exon 21, đảm bảo không bỏ sót cơ hội điều trị trúng đích cho người bệnh.

---

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng thực nghiệm từ luận văn, bốn nhóm giải pháp kỹ thuật và lâm sàng được đề xuất cụ thể:

• Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch tại các cơ sở giải phẫu bệnh: Áp dụng nghiêm ngặt thời gian ủ chất hiện màu Diaminobenzidine (DAB) trong đúng 1 phút để loại bỏ hoàn toàn hiện tượng dương tính giả và nhuộm nền. Mẫu mô sinh thiết cần được cố định ngay trong dung dịch formol trung tính 10% trong khoảng thời gian từ 6 đến 24 giờ nhằm bảo tồn tối đa tính toàn vẹn của các quyết định kháng nguyên epitop.
• Xây dựng phác đồ chẩn đoán phân tầng kết hợp hóa mô miễn dịch và sinh học phân tử: Thiết lập quy trình lâm sàng chuẩn hóa, trong đó hóa mô miễn dịch được chỉ định là xét nghiệm sàng lọc đầu tay. Những bệnh nhân có kết quả nhuộm đạt mức 2+ hoặc 3+ có thể được hội đồng chuyên môn cân nhắc định hướng điều trị đích TKI sớm trong vòng 48 giờ. Các trường hợp đạt mức 0 hoặc 1+ cần được chuyển tiếp làm xét nghiệm PCR chuyên sâu để khảo sát toàn diện các đột biến hiếm.
• Mở rộng đào tạo kỹ thuật và chuyển giao công nghệ cho y tế tuyến dưới: Triển khai các khóa tập huấn chuẩn hóa kỹ thuật cắt tiêu bản paraffin và đọc tiêu bản hóa mô miễn dịch cho ít nhất 70% bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh trong giai đoạn 2024-2026, giúp giảm tải cho các bệnh viện trung ương và rút ngắn thời gian chờ đợi xét nghiệm của người bệnh.
• Ứng dụng hệ thống kháng thể đột biến thế hệ mới và theo dõi kháng thuốc: Đưa vào sử dụng thêm các dòng kháng thể đặc hiệu cao cho đột biến điểm T790M ở exon 20 để chủ động tầm soát đột biến kháng thuốc thứ phát xuất hiện sau 6 đến 12 tháng điều trị thuốc ức chế tyrosine kinase, giúp bác sĩ chuyển đổi kịp thời sang các thế hệ thuốc đích mới hơn.

---

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và ứng dụng cao cho nhiều nhóm chuyên gia trong hệ sinh thái y tế:

• Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Hô hấp: Khai thác dữ liệu về tỷ lệ bộc lộ EGFR (83,33%) và mức độ tương thích với PCR để đưa ra quyết định chỉ định liệu pháp trúng đích kịp thời cho bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến giai đoạn muộn, ngay cả khi chưa có kết quả giải trình tự gen.
• Bác sĩ và Kỹ thuật viên Giải phẫu bệnh - Tế bào học: Tham khảo quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch chuẩn xác, phương pháp phục hồi kháng nguyên bằng nhiệt và quy chuẩn đánh giá tiêu bản từ mức 0 đến 3+ theo hệ thống phân loại Dako.
• Học viên sau đại học và Nghiên cứu sinh ngành Công nghệ Nano Sinh học, Sinh học Phân tử: Sử dụng tài liệu làm khung tham chiếu phương pháp luận về thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang, công thức tính cỡ mẫu y sinh học, và kỹ thuật đối chiếu giữa dấu ấn miễn dịch mô học với kỹ thuật lai phân tử StripAssay.
• Nhà quản lý y tế và các đơn vị hoạch định chính sách Bảo hiểm Y tế: Có cơ sở dữ liệu chi phí - hiệu quả thực tế để xây dựng danh mục xét nghiệm sàng lọc bước một tại bệnh viện tuyến cơ sở, giúp tiết kiệm ngân sách y tế so với việc chỉ định giải trình tự gen đại trà.

---

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch phát hiện đột biến gen EGFR dựa trên cơ chế nào?

Kỹ thuật sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu để liên kết trực tiếp với các protein thụ thể EGFR biểu hiện trên màng tế bào u. Phức hợp này được nhận diện bởi kháng thể thứ hai gắn men peroxidase, tạo phản ứng đổi màu nâu với cơ chất DAB để quan sát hình thái dưới kính hiển vi.

Vì sao thời gian ủ chất hiện màu DAB bắt buộc phải khống chế ở mốc 1 phút?

Thực nghiệm trên 20 block bệnh phẩm cho thấy phủ DAB trong 1 phút giúp 100% tiêu bản đạt chất lượng chuẩn. Kéo dài lên 3 phút khiến 20% tiêu bản xuất hiện hiện tượng bắt màu nền lan tỏa và gấp xước mô, làm cản trở việc phân biệt cường độ màng tế bào.

Mức độ bộc lộ hóa mô miễn dịch nào có thể dự đoán chính xác đột biến gen trên PCR?

Nghiên cứu đối chiếu trên 30 mẫu bệnh phẩm khẳng định mức bộc lộ 2+ cho tỷ lệ dương tính trên PCR là 90%, và mức bộc lộ 3+ đạt độ chính xác tuyệt đối 100%. Đây là căn cứ tin cậy để chỉ định điều trị đích nhanh chóng trên lâm sàng.

Tại sao vẫn cần thực hiện xét nghiệm PCR khi kết quả hóa mô miễn dịch âm tính hoặc 1+?

Khoảng 20% mẫu có mức bộc lộ 1+ vẫn mang đột biến gen khi kiểm tra bằng PCR. Hóa mô miễn dịch chỉ nhận diện một số cấu hình kháng nguyên phổ biến, do đó PCR cần thiết để không bỏ sót các đột biến hiếm hoặc đột biến chèn đoạn ở exon 20.

Hóa mô miễn dịch có ưu điểm gì vượt trội so với các phương pháp phân tích DNA?

Phương pháp này có thể thực hiện trên các mảnh mô sinh thiết cực nhỏ chỉ chứa một vài tế bào u. Ngược lại, kỹ thuật phân tích DNA thông thường đòi hỏi tỷ lệ tế bào u tối thiểu từ 30% đến 50% trong mẫu bệnh phẩm để tránh nguy cơ âm tính giả.

---

Kết luận

• Đóng góp học thuật: Luận văn đã xác lập thành công quy trình chuẩn hóa xét nghiệm hóa mô miễn dịch phát hiện gián tiếp đột biến gen EGFR với thời gian hiện màu DAB tối ưu trong đúng 1 phút, đảm bảo 100% tiêu bản đạt tiêu chuẩn chẩn đoán.
• Giá trị dịch tễ học: Xác định tỷ lệ bộc lộ protein EGFR đạt 83,33% trên 120 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi tại Bệnh viện Bạch Mai, với tỷ lệ mắc ở nữ giới đạt 86,11% và nam giới đạt 82,14%.
• Độ chính xác chẩn đoán: Chứng minh mối tương quan chặt chẽ giữa mức độ nhuộm hóa mô miễn dịch 2+ (90%) và 3+ (100%) với kết quả phân tích phân tử PCR, khẳng định giá trị sàng lọc lâm sàng vượt trội của phương pháp.
• Định hướng ứng dụng: Hoàn thiện mô hình sàng lọc phân tầng chi phí thấp, cho phép các cơ sở y tế tuyến tỉnh triển khai chẩn đoán định hướng điều trị đích trong giai đoạn 2024-2026.
• Hành động đề xuất: Các đơn vị giải phẫu bệnh và ung bướu nên nhanh chóng cập nhật quy trình hóa mô miễn dịch EGFR vào phác đồ thường quy để tối ưu hóa thời gian và cơ hội sống cho bệnh nhân ung thư phổi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, trên toàn thế giới, bệnh ung thƣ đã vƣợt qua bệnh tim mạch để trở thành căn nguyên gây tử vong hàng đầu với tỷ lệ mắc bệnh cao và độ tuổi mắc bệnh ngày càng giảm[6][9] [70]. Với tốc độ phát triển dân số và sự gia tăng tuổi thọ nhƣ hiện nay thì ƣớc tính đến năm 2050, thế giới sẽ có thêm khoảng 27 triệu trƣờng hợp ung thƣ mới mắc và khoảng 17,5 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm[6] [70]; trong đó phải kể đến ung thƣ phổi (UTP), căn nguyên gây tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu với thể ung thƣ biểu mô tuyến của phổichiếmđến40%cáctrƣờnghợp [12][13]. Những nghiên cứu thực hiện ở các nƣớc có nền y học tiên tiến cho thấy việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị đã mang lại những lợi ích nổi bật cho bệnh nhân ung thƣ. Các nhà khoa học có thể đánh giá một cách tổng quát sự tƣơng tác gen, các con đƣờng dẫn truyền tín hiệu nội bào và ảnh hƣởng của các dòng thác tín hiệu trong tế bào đến quá trình tái bản, sao chép và phiên mã, từ đó tác động lên quá trình sinh trƣởng, biệt hóa, di chuyển và chết theo chƣơng trình của tế bào.

Nhƣ vậy, với mỗi một biến đổi gen xảy ra đều có thể làm thay đổi sự cân bằng các hoạt động sống tế bào, biến một tế bào lành trở thành tế bào ác tính hoặc gây chết tế bào. Mặt khác, có những biến đổi gen lại khiến các tế bào trở nên nhạy cảm hoặc đề kháng hơn với những tác nhân ngoại bào nhƣ tác nhân lý, hóa. Trong đó, sự thay đổi tính đáp ứng của tế bào với các các thuốc điều trị ung thƣ là một ví dụ điển hình. Đây là cơ sở khoa học để các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng các loại thuốc mới tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bào nhằm ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ gọi là liệu pháp điều trị ung thƣ trúng đích (targeted cancer therapy).

Ƣu điểm của phƣơng pháp này là liều điều trịthấp, đặc hiệu, ít độc hại và đặc biệt là hiệu quả đƣợc nâng cao một cách rõ rệt, thể trạng ngƣời bệnh đƣợc tăng cƣờng và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân[9][28]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 Việc phân tích tình trạng các gen đóng vai trò chủ chốt trong quá trình phát sinh khối u giúp các bác sĩ lựa chọn pháp đồ điều trị phù hợp nhất để nâng cao hiệu quả điều trị đích cho ngƣời bệnh. Qua nhiều công trình nghiên cứu cũng nhƣ sự kiểm duyệt khắt khe của các Tổ chức quản lý y dƣợc uy tín trên thế giới (FDA-Hoa Kì, EMEA-Liên Minh Châu Âu), liệu pháp điều trị trúng đích (LPĐTTĐ) đã chứng tỏ hiệu quả rất tốt trong việc điều trị cho các bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến của phổi giai đoạn cuối: kích thƣớc các khối u giảm đáng kể, thời gian sống kéo dài hơn, chất lƣợng cuộc sống đƣợc cải thiện, … Tuy nhiên, mức độ đáp ứng với thuốc điều trị đích ở mỗi bệnh nhân phụ thuộc phần lớn vào tình trạng một số gen, mà quan trọng nhất là gen EGFR. Việc xác định đột biến gen hay sự tƣơng tác protein bị đột biến có ý nghĩa rất lớn giúp bác sĩ lựa chọn đƣợc phác đồ điều trị thích hợp để nâng cao hiệu quả điều trị đích cho bệnh nhân.

Tháng 6/2009, Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) chính thức đƣa ra khuyến cáo: bệnh nhân trƣớc khi đƣợc chỉ định dùng thuốc ức chế EGFR cần phải đƣợc làm xét nghiệm tình trạng gen[17][78]. Tại Việt Nam, số lƣợng bệnh nhân bệnh ung thƣ ngày càng nhiều, nhu cầu sử dụng LPĐTTĐ ngày càng tăng, trên thị trƣờng đã có một số dƣợc phẩmđiềutrịđíchđangđƣợclƣuhành;tuynhiênbệnh nhân muốn sử dụng LPĐTTĐ cần phải đƣợc làm xét nghiệm đột biến gen. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tàinghiêncứu“Phát hiện gián tiếp đột biến gen EGFR trong ung thư biểu mô tuyến của phổi bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch”đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Khảo sát kỹ thuật hóa mô miễn dịch xác định đột biến gen EGFR.

Xác định tỷ lệ đột biến gen EGFR trong ung thư biểu mô tuyến của phổi. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lƣợc về dịch tễ học ung thƣ phổi và các yếu tố nguy cơ 1. Dịch tễ học  Thế giới Kể từ năm 1985, UTP đã đứng đầu trong các bệnh lý ung thƣ cả về tỉ lệ mắc và tử vong trên toàn cầu[14][103].

Tính tại thời điểm năm 2012, cả thế giới có khoảng 1,8 triệu ca UTP mới mắc (chiếm 12,9% tổng số ca ung thƣ mới mắc), 1,59 triệu ca tử vong (chiếm 19,4% tổng số ca tử vong do ung thƣ) [3][78][102]. Tại Hoa Kỳ, theo số liệu năm 2016 của American Cancer Society, số ca mắc mới UTP là 224390 ca (chiếm khoảng 13% tổng số ca ung thƣ mới mắc), số ca tử vong do UTP là 158080 ca. Cũng theo đó, tổng số ca tử vong do ung thƣ đại tràng (49190 ca), vú (40890 ca), tiền liệt tuyến (26120 ca) chỉ chiếm xấp xỉ gần 3/4 tổng số ca tử vong của UTP[19][70]. Về mặt phân bố theo giới, trên toàn cầu năm 2012, UTP là bệnh lý ung thƣ hay gặp nhất ở nam, xếp sau đó là ung thƣ tiền liệt tuyến và ung thƣ đại trực tràng, chiếm tỉ lệ xấp xỉ 17% tổng số ca ung thƣ mới mắc ở nam; ở nữ, UTP chỉ đứng hàng thứ ba sau ung thƣ vú và ung thƣ đại trực tràng, chiếm gần 9% tổng số ca ung thƣ mới mắc của giới này[19][21][102].

Trƣớc đây, nhìn chung UTP hay gặp và gây tử vong cho nam giới nhiều hơn hẳn nữ giới trên nhiều quốc gia. Tuy nhiên, hiện nay khoảng cách đó đã dần bị xóa bỏ, bệnh có tỉ lệ mắc và tử vong gần nhƣ tƣơng đƣơng nhau ở cả 2 giới. Tại Hoa Kỳ, tỉ lệ mắc và tử vong của nam/nữ đã thay đổi rõ rệt: năm 2004 tƣơng ứng là 1,15/1 và 1,34/1 đến năm 2016 ƣớc tính các tỉ lệ này tƣơng ứng chỉ còn 1,11/1 và 1,19/1[3][19][77]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 UTBMT cùng với UTBM vảy, UTBM tế bào nhỏ và UTBM tế bào lớn là các týp MBH hay gặp nhất của UTP.

UTBMT đến giai đoạn 2006 – 2010 đã chiếm tới hơn 40% các ca UTP, trở thành týp MBH hay gặp nhất của UTP nói chung[13][14][79]. Đến nay, UTBMT đã thay thế UTBM vảy để trở thành týp MBH hay gặp nhất ở nam giới, đồng thời vẫn luôn là týp MBH phổ biến nhất ở nữ giới trong thời gian dài[13][14].  Việt Nam Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, UTP đứng hàng thứ hai về tỉ lệ tử vong của các loại ung thƣ hằng năm ở cả hai giới nam và nữ. Mỗi năm cả nƣớc có hơn 20000 bệnh nhân UTP mới đƣợc phát hiện và có tới 17000 trƣờng hợp tử vong.

Riêng tại Bệnh viện Phổi Trung ƣơng, theo Lê Trung Thọ, tính đến năm 2012, số ngƣời mắc bệnh này đến khám và điều trị đã lên tới 16677 ngƣời[4][6][34]. Theo số liệu ghi nhân ung thƣ tại Hà Nội giai đoạn 2001 – 2004, ƣớc tính hằng năm có 17073 trƣờng hợp mắc mới UTP, trong đó có 12958 nam và 4115 nữ và là ung thƣ đứng đầu ở nam giới[4][47]. Theo Phạm Duy Hiển và cộng sự, nghiên cứu trên 1151 trƣờng hợp UTP tại thành phố Hồ Chí Minh, UTBMT chiếm tỉ lệ rất cao, lên tới 48,54% [8]. Theo Phạm Nguyên Cƣờng (2015), trong tổng số 258 trƣờng hợp UTP có 67,1% là týp UTBMT, týp UTBM vảy chỉ chiếm 11,4%, các týp chiếm tỉ lệ rất nhỏ [5].

Các yếu tố nguy cơ  Thuốc lá Thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng hàng đầu làm gia tăng UTP, dịch tễ học UTP thay đổi gần nhƣ song song với sự phổ biến của thuốc lá. Không chỉ những ngƣời hút, mà cả những ngƣời hít phải khói thuốc (hút thuốc lá bị động) cũng có nguy cơ cao mắc UTP, đặc biệt là týp UTBMT tại chỗ [13][20]. Thuốc lá chứa hơn 4000 hợp chất hóa học [5], trong đó có nhiều LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 chất đã đƣợc chứng minh có khả năng gây ra UTP nhƣ carbon oxit và nitrosamine. Tại Hoa Kỳ, khoảng 80% - 90% các ca UTP có liên quan đến hút thuốc lá [26][33].

Nguy cơ mắc UTP tăng lên theo thời gian hút và số lƣợng thuốc lá hút mỗi ngày, gấp 9 đến 10 lần với nam giới hút thuốc mức độ trung bình và ít nhất 20 lần với ngƣời nghiện hút thuốc lá [103]. Bằng chứng về xu hƣớng thay đổi trong các týp MBH UTP đƣợc xem xét một cách toàn diện tại báo cáo của Hội ngoại khoa Hoa Kỳ năm 2014. Báo cáo đã đƣa ra 4 kết luận quan trọng liên quan đến sự thay đổi trong mô hình UTP liên quan đến thuốc lá: - Có đủ bằng chứng để kết luận rằng nguy cơ làm phát triển UTBMT của phổi do hút thuốc lá tăng lên từ những năm 1960. - Có đủ bằng chứng để kết luận rằng sự tăng nguy cơ bị UTBMT của phổi ở những ngƣời hút thuốc lá là hậu quả từ sự thay đổi trong cấu trúc và thành phần của thuốc lá từ những năm 1950.

- Chƣa có đầy đủ bằng chứng để kết luận sự thay đổi nào trong cấu trúc của thuốc lá gây tăng nguy cơ bị UTBMT của phổi, nhƣng có một chứng cứ gợi ý đƣợc đƣa ra là các đầu lọc và sự tăng hàm lƣợng nitrosamine trong thuốc lá đóng vai trò gây hậu quả này. - Bằng chứng chỉ ra rằng sự giảm tỉ lệ mắc UTBM vảy theo sau sự giảm tỉ lệ hút thuốc lá.  Yếu tố nghề nghiệp Radon là một loại khí gas có sẵn trong tự nhiên, hình thành do sự phân rã của các nguyên tố uranium, thorium và radium trong đất đá. Nồng độ của khí này thay đổi tùy vị trí địa lý, và thƣờng có mức độ tập trung rất cao ở các khu vực hầm mỏ.

Radon không màu, không mùi, không vị, có khả năng phát LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 tia phóng xa và tùy vào mức độ và thời gian tiếp xúc có thể trở thành tác nhân gây UTP. Tại Mỹ, nói chung Radon là nguyên nhân gây UTP đứng thứ hai sau thuốc lá và là nguyên nhân hàng đầu trong nhóm không hút thuốc lá, với khoảng 15000 đến 22000 ca tử vong có liên quan đến Radon[16][81]. Radon có thể hiệp đồng với thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc UTP lên gấp nhiều lần. Amiante là nguyên nhân gây UTP liên quan đến nghề nghiệp đƣợc biết đến rõ nhất và hay găp nhất.