ĐẶT VẤN ĐỀ Ong (Anthophila; Bee) là một loài côn trùng trong họ Apidae thuộc bộ cánh màng. Ong không chỉ là loài côn trùng quan trọng việc thụ phấn của thực vật mà còn tạo ra mật ong và sản phẩm có lợi khác (Kek et al. Phát sinh loài là lịch sử hình thành nguồn gốc của một nhóm đơn vị phân loại như các loài từ tổ tiên chung của chúng bao gồm thứ tự phân nhánh và đôi khi là thời gian phân kỳ. Phát sinh loài phân tử rất quan trọng để giải quyết các câu hỏi sinh học khác nhau như mối quan hệ giữa các loài hoặc gen, nguồn gốc và sự lây lan của sự lây nhiễm vi rút cũng như những thay đổi tập tính đặc tính hình thái và mô hình di cư của các loài (Yang et al.
Theo Mardulyn và các cộng sự (1998) thì một số kỹ thuật phân tử (PCR, giải trình tự.) dựa trên các vùng gene (16Sr RNA, COI) được áp dụng trong việc phân tích phát sinh loài, xác định đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hóa hoặc định danh côn trùng (ong ký sinh). Kết quả nghiên cứu của Whitfield và các cộng sự (1997) cho thấy gene 16S rRNA là một chỉ thị phân tử hữu ích nhằm phân tích mối quan hệ ở mức phân họ và chi của ong ký sinh. Gene 16S rRNA đã được sử dụng rộng rãi ở các cấp độ khác nhau để xác định phát sinh loài ở côn trùng, đặc biệt là trong bộ Hymenoptera. Đồng thời, cũng theo như kết quả nghiên cứu của Whitfield và các cộng sự đã xác định được sự tiến hóa của phân họ Microgastrinae dựa vào phân tích đặc điểm phân tử trên vùng gene 16S rRNA.
Công bố của Min và cộng sự (2005) vùng trình tự gene 16S rRNA xác định mối quan hệ phả hệ của các phân họ: Adelinae, Cheloninae, Miracnae, Microgastrinae và Cardiochilinae bằng dữ liệu trình tự gene 16S rRNA. Trong nghiên cứu của Khan và các cộng sự (2021), trình tự gene ND5 được thu nhận từ một số loài ong mật lưu hành ở châu Âu và châu Á, cụ thể là ở Pakistan. Kết quả nghiên cứu xác định được hai loài ong châu Á: A. Dorsata, một loài ong mật châu Âu A.
Mellifera từ Pakistan và 13 loài A. cerana, hai loài A. Dorsata và trình tự của 22 loài ong mật A. mellifera sự phân tích này dựa trên gene ND5.
Nghiên cứu này cũng cho thấy gene ND5 trên ti thể có khả năng thiết lập mối SVTH: Trương Đình Thi 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP quan hệ họ hàng và đa dạng di truyền giữa các loài, cụ thể là chi Apis. Hiện nay, việc định danh các loài ong chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái của các loài ong với các phương pháp thực hiện khác nhau. Tuy nhiên, công tác phân loại thường gặp khó khăn (không phân tích được các mối quan hệ ở mức dưới họ), kết quả định danh không đồng thuận với nhau giữa các công trình nghiên cứu. Vì thế, trong nhiều năm trở lại đây, các nhà nghiên cứu đã áp dụng phân tích phả hệ phân tử để hỗ trợ định danh côn trùng trong đó có các loài ong.
Trong phạm vi chuyên đề khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích phả hệ phân tử trên gene 16S rRNA và ND5 ty thể của một số loài ong Dú ở Việt Nam”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Mục tiêu tổng quát: - Sử dụng các công cụ tin sinh học và phương pháp PCR kết hợp giải trình tự để hỗ trợ định danh một số loài ong có dược tính được thu thập ở một số địa phương thuộc Việt Nam. Mục tiêu cụ thể: - Khai thác cơ sở dữ liệu, trình tự gene mục tiêu dự kiến: 16S rRNA ty thể và ND5 của các loài công trùng cụ thể là các loài ong đã được công bố trên ngân hàng gene (GenBank, NCBI;…) và xây dựng mô hình tiến hóa trên bộ dữ liệu cục bộ đã thu thập được.
- Khai thác dữ liệu khoa học từ các bài báo thực nghiệm bằng tiếng Anh hoặc tiếng Việt thuộc hướng nghiên cứu phân tích phả hệ phân tử nhằm hỗ trợ định danh các loài ong, để thu thập khảo sát các bộ mồi được sử dụng cho phương pháp PCR kết hợp giải trình tự trên vùng gene mục tiêu: 16S rRNA ty thể. - Thiết lập phương pháp PCR kết hợp giải trình tự để hỗ trợ định danh một số loài ong có dược tính và được thu thập ở một số địa phương thuộc Việt Nam. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Nội dung 1: Sử dụng một số công cụ tin sinh học để thu thập bộ dữ liệu gene 16S rRNA và ND5 (dự kiến) của một số loài ong. SVTH: Trương Đình Thi 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Nội dung 2: Khảo sát trên máy tính để thiết kế bộ mồi phù hợp, đặc hiệu trên vùng trình tự gene 16S rRNA và ND5 (dự kiến) của một số loài ong.
Nội dung 3: Sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự và phân tích phả hệ phân tử để hỗ trợ định danh một số loài ong (Ong mật, ong Dú). SVTH: Trương Đình Thi 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP I. TỔNG QUAN SVTH: Trương Đình Thi 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ CÔN TRÙNG 1.1 Khái niệm về côn trùng Côn trùng là một nhóm động vật thuộc lớp Côn trùng (Insecta) trong ngành Arthropoda. Chúng là nhóm sinh vật rất đa dạng và phong phú, bao gồm khoảng 1 triệu loài đã được mô tả và được tìm thấy (Eggleton, 2020).2 Cấu tạo côn trùng Cấu trúc cơ thể của côn trùng rõ ràng gồm ba phần chính: đầu, ngực và bụng.
Phần đầu bao gồm một đôi râu đầu, miệng, một đôi mắt kép và có thể có hai hoặc ba mắt đơn (một số loài không có mắt đơn). Râu đầu, mắt kép và mắt đơn là các cơ quan cảm giác, trong khi miệng là cơ quan nhận thức thức ăn. Do đó, đầu của côn trùng chịu trách nhiệm cho việc cảm nhận và thu thập thức ăn. Bề mặt đầu có các nếp gấp là các ổ lõm của da.
Các ổ lõm này tạo ra các núm lồi, được gọi là sừng nổi, trên bề mặt đầu. Những sừng nổi này giúp cung cấp khả năng bám và làm cứng vỏ đầu. Các ổ lõm chia đầu thành các khu vực và mảnh vỏ, bao gồm khu trán-chân môi, khu cạnh-đỉnh đầu, khu hàm, khu hàm sau, khu dưới má, và đặc biệt, môi trên và lưỡi cũng là một phần của vỏ đầu. Trên đỉnh đầu của ấu trùng, có thể dễ dàng nhận thấy các ổ lõm lột xác có hình dạng của chữ Y ngược (N.
Phần ngực đóng vai trò là trung tâm vận động của cơ thể, bao gồm ba đốt. Mỗi đốt ngực đi kèm với một đôi chân ngực, và trong giai đoạn trưởng thành, côn trùng có thể phát triển hai đôi cánh: một đôi cánh trước ở đốt ngực giữa và một đôi cánh sau ở đốt ngực sau. Tuy nhiên, trong trường hợp chỉ có một đôi cánh như ruồi, muỗi, đôi cánh sau sẽ giảm thiểu và chuyển đổi thành một cấu trúc hình chùy, giúp duy trì sự cân bằng khi bay. Ba đốt ngực của côn trùng, gồm đốt ngực trước, đốt ngực giữa và đốt ngực sau, được nối chặt với nhau.
Mỗi đốt ngực bao gồm bốn mảnh: mảnh lưng, mảnh bụng và hai mảnh bên, được liên kết chặt chẽ với nhau. Mỗi đốt ngực cũng đi kèm với một đôi chân tương ứng, bao gồm chân trước, chân giữa và chân sau (N. Phần bụng của côn trùng là một phần quan trọng trong cấu trúc cơ thể của chúng. Đây là phần sau cùng của cơ thể côn trùng và thường chứa các cơ quan nội tạng quan trọng như dạ dày, ruột và cơ quan sinh sản.
Các cơ quan nội tạng trong SVTH: Trương Đình Thi 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP phần bụng của côn trùng thường phục vụ các chức năng như tiêu hóa thức ăn, trao đổi chất, lưu trữ chất dự trữ và sinh sản. Chẳng hạn, dạ dày của côn trùng được sử dụng để tiêu hóa thức ăn và hấp thụ dưỡng chất. Ruột thường chứa chất thải và chất còn dư sau quá trình tiêu hóa. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn nằm ở cuối bụng (Sheikh, 2009).2 BỘ CÁNH MÀNG (HYMENOPTERA) Bộ cánh màng (bọ cánh cứng, ong bắp cày, kiến và ong) là một trong bốn bộ côn trùng siêu đa dạng, bao gồm hơn 153.000 loài được mô tả và có thể lên đến một triệu loài còn tồn tại chưa được mô tả (Peters, 2017).
Bộ cánh màng có các đặc điểm chung về cấu trúc và chức năng của cánh. Cánh của Hymenoptera có cấu trúc mỏng và mềm, được gắn kết với ngực bằng một khớp đơn giản gọi là gối cánh (wing hinge). Điều này cho phép chúng thực hiện các chuyển động bay phức tạp và tạo độ linh hoạt khi di chuyển. Bộ cánh màng thường có hai cánh phát triển đầy đủ và các loài trong bộ này thường có khả năng bay tốt.
Tuy nhiên, một số loài trong bộ có khả năng mất cánh và sống trên mặt đất sau khi mất cánh. Cánh của Hymenoptera cũng có thể có các cấu trúc khác nhau như mô phỏng các màu sắc và hình dạng đặc biệt để tương tác với môi trường và các loài khác (Aguiar, 2013). Bộ cánh màng Hymenoptera đóng một vai trò quan trọng trong sinh thái học và hệ sinh thái. Chúng có vai trò quan trọng trong việc thụ phấn, duy trì sự phát triển của côn trùng khác và có vai trò quan trọng trong việc kiềm hãm số lượng côn trùng gây hại cho cây trồng.
Ngoài ra, một số loài Hymenoptera có khả năng gây hại đối với con người như ong và kiến có thể châm, chích và gây đau (Aguiar, 2013).3 TỔNG QUAN VỀ ONG DÚ Ong Dú có tên tiếng Anh là Stingless bee, thuộc ngành Arthropoda, họ Apidae, tộc Meliponini. Ong Dú là những con côn trùng có tổ chức xã hội lớn nhất trên trái đất, có nguồn gốc từ châu Phi được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là Trung và Nam Mỹ, Châu Phi, Úc và Đông Nam Á với hơn 500 loài đã được xác định (P. Kwapong et al. Kwapong có hơn 300 loài ở Brazil, 14 loài ở Australia và có 46 loài đã được ghi nhận ở Mexico, 26 loài tại châu Phi, trong số 9 loài này cho đến nay đã được tìm thấy ở Ghana và 43 loài đã được tìm thấy SVTH: Trương Đình Thi 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP tại châu Á.
Với 43 loài được công nhận thuộc hai chi là Lisotrigona và Trigona đã phát hiện ở Châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ, Malaysia, Lào,…(Hai X. Nguyen et al. Ong Dú có kích thước nhỏ hơn so với những loài trong họ ong mật thông thường.