Xác Định Hợp Chất Hydrocacbon Đa Vòng Thơm PAH Trong Thịt Bằng Kỹ Thuật GC-MS/MS

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xác định hợp chất hydrocacbon đa vòng thơm PAH trong thịt bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ hai lần GC-MS-MS.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tâm
• Người hướng dẫn: TS. Lê Đình Chi
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác Định Một Số Hợp Chất Hydrocacbon Đa Vòng Thơm (PAH) Trong Thịt Và Sản Phẩm Từ Thịt Bằng Kỹ Thuật Sắc Ký Khí Khối Phổ Hai Lần (GC-MS/MS)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về PAH
• 1.2. Giới thiệu chung về PAH
• 1.3. Tính chất vật lý và hoá học của PAH
• 1.3.1. Tính chất vật lý
• 1.3.2. Tính chất hoá học
• 1.4. Độc tính của PAH và ảnh hưởng của PAH tới môi trường sống
• 1.4.1. Ảnh hưởng đối với thực vật
• 1.4.2. Ảnh hưởng đối với động vật, con người
• 1.5. Giới hạn cho phép PAH trong thực phẩm
• 1.6. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.7. Các phương pháp xác định PAH
• 1.7.1. Các phương pháp chiết tách hợp chất PAH
• 1.7.1.1. Phương pháp chiết lỏng – lỏng
• 1.7.1.2. Phương pháp chiết pha rắn
• 1.7.1.3. Phương pháp chiết QuEChERS
• 1.7.2. Phương pháp phân tích dư lượng PAH trong thực phẩm
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất
• 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.2.2. Thiết bị chính
• 2.2.3. Dụng cụ thí nghiệm
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
• 2.3.3. Phân tích PAH bằng GC-MS/MS
• 2.3.4. Phương pháp xác nhận giá trị hiệu lực phương pháp
• 2.3.4.1. Tính chọn lọc
• 2.3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
• 2.3.4.3. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn
• 2.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích PAH bằng GC-MS/MS
• 3.1.1. Lựa chọn các điều kiện tách của GC
• 3.1.2. Lựa chọn các điều kiện phân tích MS/MS
• 3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
• 3.2.1. Lựa chọn dung môi chiết và hỗn hợp muối chiết
• 3.2.2. Khảo sát bước làm sạch
• 3.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
• 3.3.1. Đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc của phương pháp phân tích
• 3.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn
• 3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
• 3.4. Ứng dụng phương pháp để phân tích mẫu
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Phân Tích Hợp Chất PAH Trong Thịt

Hợp chất hydrocacbon thơm đa vòng (PAH) là một nhóm hợp chất hữu cơ có mặt trong môi trường và thực phẩm. Việc phân tích PAH trong thịt là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm. PAH có thể gây ra nhiều tác động xấu đến sức khỏe con người, bao gồm ung thư. Do đó, việc xác định hàm lượng PAH trong thực phẩm là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Giới thiệu về Hợp Chất PAH và Tác Động Của Chúng

PAH là các hợp chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp, thường xuất hiện trong thực phẩm do quá trình chế biến. Chúng có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, bao gồm ung thư. Việc hiểu rõ về PAH giúp nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm.

1.2. Tính Chất Vật Lý và Hóa Học Của PAH

PAH có tính chất vật lý và hóa học đặc trưng, như độ tan trong nước thấp và dễ hòa tan trong dung môi hữu cơ. Những tính chất này ảnh hưởng đến cách thức chúng tích tụ trong thực phẩm và môi trường.

II. Vấn Đề Ô Nhiễm PAH Trong Thịt Và Thực Phẩm

Ô nhiễm PAH trong thực phẩm, đặc biệt là thịt, là một vấn đề nghiêm trọng. Các nguồn ô nhiễm chủ yếu bao gồm quá trình chế biến thực phẩm như nướng, chiên và hun khói. Những phương pháp này có thể làm tăng hàm lượng PAH trong thực phẩm, gây nguy hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng.

2.1. Nguồn Gốc Ô Nhiễm PAH Trong Thực Phẩm

PAH có thể xâm nhập vào thực phẩm từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm không khí, nước và đất. Việc chế biến thực phẩm cũng là một yếu tố quan trọng dẫn đến ô nhiễm PAH.

2.2. Tác Động Của PAH Đến Sức Khỏe Con Người

Sự hiện diện của PAH trong thực phẩm có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe, từ các bệnh nhẹ đến các bệnh nghiêm trọng như ung thư. Việc nhận thức rõ về tác động của PAH là rất cần thiết.

III. Phương Pháp Phân Tích PAH Bằng Kỹ Thuật GC MS MS

Kỹ thuật sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phân tích PAH trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng PAH ở nồng độ rất thấp, đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Kỹ Thuật GC MS MS

GC-MS/MS kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ, cho phép tách biệt và phân tích các hợp chất PAH một cách hiệu quả. Nguyên tắc này giúp nâng cao độ chính xác trong việc xác định hàm lượng PAH.

3.2. Quy Trình Phân Tích PAH Bằng GC MS MS

Quy trình phân tích PAH bằng GC-MS/MS bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, chiết xuất và phân tích. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Phân Tích PAH

Việc áp dụng phương pháp GC-MS/MS trong phân tích PAH đã mang lại nhiều kết quả tích cực. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp này có thể phát hiện PAH trong nhiều loại thực phẩm khác nhau, từ thịt đến các sản phẩm chế biến sẵn.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Về PAH Trong Thịt

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng PAH trong các mẫu thịt thường vượt quá giới hạn cho phép. Điều này cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ hơn trong chế biến thực phẩm.

4.2. Ứng Dụng Trong Kiểm Soát An Toàn Thực Phẩm

Phương pháp GC-MS/MS không chỉ giúp phát hiện PAH mà còn hỗ trợ trong việc xây dựng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Điều này rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

V. Kết Luận Về Phân Tích PAH Trong Thịt

Phân tích PAH trong thịt bằng kỹ thuật GC-MS/MS là một bước quan trọng trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy cần có các biện pháp kiểm soát ô nhiễm PAH hiệu quả hơn trong chế biến thực phẩm.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu PAH

Nghiên cứu về PAH sẽ tiếp tục được mở rộng để tìm ra các phương pháp phân tích mới và hiệu quả hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao chất lượng thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Chính Sách An Toàn Thực Phẩm

Cần có các chính sách rõ ràng và nghiêm ngặt hơn về kiểm soát PAH trong thực phẩm. Điều này không chỉ bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn nâng cao chất lượng thực phẩm trên thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Các hợp chất hydrocacbon đa vòng thơm (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons – PAH) là nhóm chất hữu cơ độc hại thuộc diện ô nhiễm tồn dư dai dẳng (POP), có khả năng gây đột biến gen và ung thư nghiêm trọng cho con người. Quá trình chế biến nhiệt ở nhiệt độ cao như nướng, rán, quay và xông khói là nguyên nhân hàng đầu khiến thực phẩm tích tụ lượng lớn PAH. Một số khảo sát thực tế tại các đô thị lớn như Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh đã ghi nhận hàm lượng benzo(a)pyren trong thịt nướng chả chạm ngưỡng 14 µg/kg và trong bánh quẩy đạt 9,4 µg/kg, vượt xa ngưỡng khuyến cáo an toàn. Nhằm kiểm soát nguy cơ này, Ủy ban Châu Âu đã ban hành Quy chế EC 835/2011 quy định giới hạn tối đa nghiêm ngặt đối với thực phẩm chế biến từ thịt là 5 µg/kg cho benzo(a)pyren và 30 µg/kg đối với tổng 4 hợp chất PAH trọng tâm.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm là giải quyết thách thức tách chiết và định lượng chính xác 16 hợp chất PAH dạng vết trên nền mẫu thịt giàu chất béo và protein phức tạp. Mục tiêu cụ thể của luận văn bao gồm: tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu theo kỹ thuật QuEChERS hiện đại; thiết lập các thông số vận hành trên hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS); thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn quốc tế AOAC và quy định EC 657/2002; đồng thời ứng dụng khảo sát thực tế trên 30 mẫu thịt và sản phẩm thịt thu thập tại Hà Nội và Thái Bình. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài thể hiện ở việc rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu từ 24 giờ xuống dưới 45 phút, tiết kiệm trên 70% lượng dung môi hữu cơ độc hại, mang lại công cụ kiểm nghiệm có độ chọn lọc cao với giới hạn định lượng thấp hơn 1 µg/kg nhằm phục vụ đắc lực cho công tác quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết hóa học phân tích hiện đại, cơ chế hình thành độc chất học môi trường và nguyên lý khối phổ va chạm. Các khái niệm và mô hình cốt lõi bao gồm:

• Khái niệm PAH và độc tính phân tử: Nhóm hydrocacbon thơm đa vòng chứa từ hai vòng benzen ngưng tụ trở lên, có đặc tính kỵ nước mạnh, độ tan trong nước cực thấp (chỉ từ 0,26 đến 3,8 µg/L đối với các hợp chất 5-6 vòng), tan tốt trong dung môi hữu cơ và mô mỡ thực phẩm. Benzo(a)pyren đóng vai trò là chất chỉ thị độc tính chính do khả năng chuyển hóa thành các gốc epoxit tấn công cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN.
• Nguyên lý chiết phân tán pha rắn QuEChERS: Mô hình chiết tách một bước kết hợp phân bố lỏng - lỏng và d-SPE, sử dụng acetonitril đệm muối magie sunfat (MgSO4) và natri clorua (NaCl) để tách nước, kết hợp chất hấp phụ amin bậc một, bậc hai (PSA) và silica gắn mạch octadecyl (C18) để loại triệt để axit béo tự do, sắc tố và lipid.
• Nguyên lý khối phổ hai lần với cơ chế giám sát đa phản ứng (MRM): Khung lý thuyết va chạm cảm ứng phân ly (CID) trong buồng va chạm của thiết bị ba tứ cực, cho phép lựa chọn ion mẹ đặc trưng và bắn phá thành hai ion con định lượng và định danh, loại bỏ toàn bộ nhiễu nền đồng khối phổ.
• Tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích vết: Hệ thống đánh giá dựa trên hướng dẫn của AOAC International và Quyết định EC 657/2002 của Liên minh Châu Âu về điểm xác nhận (Identification Points - IP) và tỷ lệ ion ion-ratio.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu thực nghiệm thu thập từ quá trình khảo sát trong phòng thí nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025 tại Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia:

• Đối tượng và phương pháp lấy mẫu: Cỡ mẫu thực nghiệm gồm 30 mẫu thịt tươi, thịt quay, thịt xiên nướng và thịt xông khói lưu hành tại thị trường Hà Nội và Thái Bình. Kỹ thuật lấy mẫu tuân thủ nghiêm ngặt theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4833-1:2002 (ISO 3100-1) về lấy mẫu thịt và sản phẩm thịt. Mẫu được đồng nhất hóa với khối lượng tối thiểu 200 g trước khi bảo quản ở nhiệt độ -20°C. Mẫu trắng chuẩn là thịt bò tươi đã qua kiểm tra âm tính với toàn bộ 16 hợp chất PAH.
• Quy trình xử lý mẫu QuEChERS: Cân chính xác 5 g mẫu thịt đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL, thêm 5 mL nước cất và 10 mL acetonitril. Tiến hành phân tách pha bằng hỗn hợp muối gồm 4 g MgSO4 khan và 1 g NaCl, lắc vortex 1 phút và ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 6 mL dịch chiết sang ống ly tâm 15 mL chứa 0,9 g MgSO4, 0,3 g PSA và 0,3 g C18 để làm sạch d-SPE. Dịch chiết sau ly tâm được thổi khô bằng dòng khí nitơ tinh khiết 99,999%, hòa cặn bằng 0,4 mL n-hexan và lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm.
• Phân tích sắc ký khí khối phổ hai lần: Thiết bị sắc ký GC 7890A kết nối khối phổ ba tứ cực MS 7000B của Agilent. Pha tĩnh sử dụng cột mao quản DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), khí mang heli tốc độ 1,0 mL/min, chế độ tiêm không chia dòng (splitless) thể tích 1 µL ở nhiệt độ buồng tiêm 310°C. Chương trình nhiệt độ lò: ban đầu 70°C (giữ 1 phút), tăng 10°C/phút lên 310°C (giữ 5 phút), tổng thời gian phân tích là 30 phút. Nguồn ion hóa va chạm electron (EI, 70 eV), nhiệt độ nguồn ion 250°C, ghi nhận tín hiệu ở chế độ MRM với 1 ion mẹ và 2 ion con cho mỗi chất, đảm bảo đạt tối thiểu 4 điểm xác nhận (IP = 4).
• Lý do lựa chọn phương pháp: GC-MS/MS ở chế độ MRM mang lại độ nhạy vượt trội gấp 10 lần so với LC-MS/MS nguồn APPI và triệt tiêu hoàn toàn hiện tượng dương tính giả trên nền chất béo phức tạp so với các phương pháp GC-MS đơn tứ cực hay HPLC-FLD truyền thống.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát và thẩm định phương pháp đã ghi nhận các kết quả thực nghiệm nổi bật:

1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký và phân tách 16 hợp chất PAH: Chương trình tăng nhiệt độ gradient với tốc độ 10°C/phút từ 70°C lên 310°C đã tạo ra hình dạng pic cân đối, đối xứng cao với độ rộng chân pic của benzo(a)pyren chỉ khoảng 0,35 phút. Thời gian lưu của toàn bộ 16 hợp chất dao động ổn định trong khoảng từ 7,2 phút (naphthalen) đến 27,0 phút (dibenzo(a,h)anthracen).
2. Hiệu quả làm sạch vượt trội của d-SPE phối hợp PSA và C18: Thử nghiệm so sánh cho thấy việc phối hợp đồng thời 50 mg PSA và 50 mg C18 cho mỗi mililit dịch chiết giúp nâng độ thu hồi của các PAH nhẹ từ dưới 60% lên trên 80%, đồng thời loại bỏ trên 95% lượng axit béo và phospholipid tự do trong dịch chiết thịt.
3. Độ tuyến tính và độ tin cậy đạt chuẩn quốc tế: Tất cả 16 đường chuẩn xây dựng trên nền dịch chiết mẫu trắng đều đạt hệ số tương quan tuyến tính R² từ 0,9900 đến 0,9992 trong khoảng nồng độ khảo sát 20–1000 ng/mL (tương ứng 1,6–80 µg/kg trên mẫu). Tỷ lệ phân mảnh ion con định lượng và định danh có sai lệch nằm hoàn toàn trong giới hạn cho phép từ ±20% đến ±50% theo quy định EC 657/2002.
4. Độ đúng và độ lặp lại xuất sắc: Độ thu hồi trung bình của phương pháp trên nền mẫu thịt bò thêm chuẩn ở các dải nồng độ đạt từ 81,4% đến 106,2%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) qua 6 lần phân tích lặp lại chỉ dao động từ 3,2% đến 9,8%, hoàn toàn đáp ứng tiêu chí nghiêm ngặt của AOAC đối với phân tích hàm lượng vết.
5. Hiện trạng tồn dư PAH trên các mẫu thương phẩm: Khảo sát 30 mẫu thực tế cho thấy toàn bộ các mẫu thịt tươi đều âm tính với PAH. Ngược lại, 100% mẫu thịt xiên nướng than hoa và thịt quay đều phát hiện có chứa PAH với hàm lượng tổng dao động từ 4,2 µg/kg đến 28,6 µg/kg; trong đó một số mẫu thịt xiên nướng có hàm lượng benzo(a)pyren tiệm cận mức giới hạn 4,8 µg/kg.

Thảo luận kết quả

Cơ chế tạo thành hàm lượng PAH cao trong các sản phẩm thịt chế biến nhiệt xuất phát từ sự nhiệt phân không hoàn toàn của protein và lipid ở nhiệt độ trên 300°C. Khi mỡ từ thịt chảy xuống than hồng nóng đỏ, các gốc tự do ngưng tụ tạo thành khói chứa hàm lượng PAH đậm đặc rồi bốc lên bám chặt vào bề mặt thịt. Dữ liệu phân tích thực nghiệm có thể được mô tả trực quan thông qua đồ thị sắc ký đồ MRM hiển thị các pic tín hiệu sắc nét không bị nhiễu nền, cùng với biểu đồ cột so sánh tổng hàm lượng 4 PAH chính giữa các nhóm sản phẩm: thịt tươi (0 µg/kg), thịt xông khói công nghiệp (trung bình 3,1 µg/kg), thịt quay (trung bình 8,4 µg/kg) và thịt xiên nướng trực tiếp (trung bình 19,7 µg/kg).

Khi so sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm sử dụng HPLC-FLD hoặc GC-MS đơn tứ cực, quy trình QuEChERS kết hợp GC-MS/MS chứng minh tính ưu việt rõ rệt. Các phương pháp chiết lỏng - lỏng truyền thống đòi hỏi từ 100 đến 250 mL dung môi clo hóa độc hại và mất 2 đến 4 giờ thủy phân kiềm, trong khi quy trình này chỉ tiêu tốn 10 mL acetonitril và 0,4 mL n-hexan. Về mặt phân tích, kỹ thuật GC-MS/MS với hai mức chọn lọc khối lượng loại bỏ hoàn toàn các pic tạp chất đồng phân, khắc phục triệt để hiện tượng dương tính giả vốn thường gặp trên detector huỳnh quang (FLD) khi gặp nền mẫu béo.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát độc chất PAH trong chuỗi cung ứng thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

• Ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về giới hạn PAH: Bộ Y tế cùng Cục An toàn thực phẩm cần xây dựng và ban hành Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia (QCVN) quy định ngưỡng giới hạn tối đa cho phép của benzo(a)pyren ở mức 5,0 µg/kg và tổng 4 PAH ở mức 30,0 µg/kg trong thịt chế biến nhiệt, hoàn thành trong giai đoạn 2026–2027.
• Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kiểm nghiệm QuEChERS – GC-MS/MS: Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia chủ trì tập huấn, chuyển giao quy trình phân tích tối ưu cho hệ thống phòng kiểm nghiệm của các Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm trên toàn quốc, mục tiêu rút ngắn thời gian trả kết quả kiểm nghiệm xuống dưới 24 giờ cho 100% các mẫu giám sát khẩn cấp trước năm 2027.
• Khuyến cáo cải tiến kỹ thuật nướng và chế biến thực phẩm: Các cơ sở sản xuất và dịch vụ ăn uống cần thay thế phương pháp nướng than hoa trực tiếp bằng bếp nướng điện, nướng gián tiếp hoặc sử dụng khay hứng mỡ chuyên dụng nhằm giảm thiểu trên 60% lượng khói ngưng tụ chứa PAH tiếp xúc với thực phẩm, thực hiện định kỳ từ quý 3 năm 2026.
• Mở rộng mạng lưới quan trắc và đánh giá nguy cơ phơi nhiễm: Các cơ quan thanh tra an toàn thực phẩm tuyến tỉnh/thành phố triển khai kế hoạch lấy mẫu giám sát định kỳ tối thiểu 150 mẫu thịt nướng đường phố và sản phẩm xông khói mỗi năm tại các đô thị trọng điểm để cập nhật cơ sở dữ liệu độc học quốc gia.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo chuyên sâu, mang lại giá trị thực tiễn cho nhiều nhóm chuyên môn:

• Cán bộ phân tích tại các phòng kiểm nghiệm ISO/IEC 17025: Sử dụng trực tiếp quy trình QuEChERS và bộ thông số MRM (ion mẹ, ion con, năng lượng va chạm 15–40 eV) để xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 16 hợp chất PAH trong nền mẫu thực phẩm phức tạp.
• Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm: Cục An toàn thực phẩm và Thanh tra Sở Y tế sử dụng các số liệu thực chứng về tỷ lệ ô nhiễm PAH trong thịt nướng và thịt xông khói để hoạch định chính sách, xây dựng kế hoạch giám sát rủi ro và thiết lập tiêu chuẩn kỹ thuật phù hợp.
• Doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm: Đội ngũ R&D và QA/QC tại các nhà máy chế biến thịt xông khói, xúc xích, đồ hộp ứng dụng dữ liệu để kiểm soát nhiệt độ gia nhiệt và công nghệ tạo khói lỏng, đảm bảo hàm lượng độc chất luôn dưới ngưỡng giới hạn cho phép.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa phân tích, Độc học môi trường: Sử dụng luận văn như một tài liệu mẫu mực về thiết kế thực nghiệm, khảo sát gradient nhiệt sắc ký khí, xử lý dữ liệu khối phổ và quy trình thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn AOAC.

Câu hỏi thường gặp

Hợp chất PAH nào nguy hiểm nhất trong thực phẩm và giới hạn quy định hiện nay là bao nhiêu?

Benzo(a)pyren là hợp chất độc hại nhất trong nhóm PAH, được xếp vào nhóm chất gây ung thư mạnh cho người qua cơ chế tạo liên kết cộng hóa trị với ADN. Theo quy chuẩn quốc tế EC 835/2011, giới hạn tối đa cho phép của benzo(a)pyren trong thịt nướng và xông khói là 5,0 µg/kg, và tổng của 4 hợp chất PAH nguy hại nhất không được vượt quá 30,0 µg/kg.

Tại sao phương pháp QuEChERS lại ưu việt hơn chiết lỏng - lỏng truyền thống?

Phương pháp QuEChERS tối ưu hóa dung môi chiết với 10 mL acetonitril thay vì hàng trăm mililit dung môi clo hóa độc hại, không cần qua bước thủy phân kiềm kéo dài 2-4 giờ. Kỹ thuật này tích hợp bước làm sạch d-SPE nhanh gọn, giúp tăng độ thu hồi lên trên 80% và giảm thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 45 phút cho mỗi mẻ phân tích.

Vì sao hệ thống GC-MS/MS được lựa chọn thay thế cho HPLC-FLD khi phân tích PAH?

Mặc dù HPLC-FLD có độ nhạy tốt, nhưng trên nền mẫu giàu chất béo thường xuất hiện các pic tạp chất phát huỳnh quang gây dương tính giả. Hệ thống GC-MS/MS với chế độ giám sát đa phản ứng (MRM) cung cấp 4 điểm xác nhận (IP = 4), giúp loại bỏ hoàn toàn tín hiệu nhiễu nền và định lượng chính xác ở nồng độ vết dưới 1,0 µg/kg.

Chất hấp phụ PSA và C18 đóng vai trò gì trong bước làm sạch phân tán pha rắn (d-SPE)?

Trong bước làm sạch d-SPE, chất hấp phụ PSA đóng vai trò giữ lại các axit béo tự do, đường và axit hữu cơ nhờ tương tác trao đổi anion yếu và liên kết hydro. Đồng thời, chất hấp phụ C18 giữ lại triệt để các hợp chất lipid không phân cực, giúp dịch chiết sạch và bảo vệ cột sắc ký mao quản không bị thoái hóa.

Thực phẩm chế biến nào có nguy cơ nhiễm PAH cao nhất trong thực tế đời sống?

Thực phẩm chế biến bằng phương pháp nướng than hoa trực tiếp như thịt xiên nướng, sườn nướng, chả nướng và các sản phẩm xông khói thủ công có nguy cơ ô nhiễm PAH cao nhất. Khảo sát thực nghiệm cho thấy hàm lượng benzo(a)pyren trong các món nướng than có thể đạt từ 4,2 đến 14,0 µg/kg do tiếp xúc trực tiếp với khói mỡ nhiệt phân.

Kết luận

• Phương pháp QuEChERS kết hợp GC-MS/MS đã được tối ưu hóa thành công để định lượng đồng thời 16 hợp chất PAH trong nền mẫu thịt với độ nhạy và độ chọn lọc vượt trội.
• Thẩm định phương pháp đạt độ tin cậy cao với hệ số tương quan R² trên 0,9900, độ thu hồi đạt từ 81,4% đến 106,2% và độ lệch chuẩn tương đối RSD dưới 10%, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn khắt khe của AOAC và EC 657/2002.
• Kết quả khảo sát 30 mẫu thực tế đã chỉ ra nguy cơ ô nhiễm PAH tập trung chủ yếu ở các sản phẩm thịt nướng than trực tiếp, cung cấp bằng chứng khoa học xác đáng cho cơ quan quản lý.
• Lộ trình tiếp theo trong giai đoạn 2026–2028 cần tập trung mở rộng quy trình phân tích trên các nền mẫu thủy sản, dầu mỡ thực vật và tích hợp công nghệ tự động hóa xử lý mẫu.
• Các đơn vị kiểm nghiệm và doanh nghiệp thực phẩm nên nhanh chóng ứng dụng quy trình phân tích chuẩn mực này để kiểm soát chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Các chất hydrocacbon thơm đa vòng (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons – PAH) là một nhóm hợp chất ô nhiễm nguy hiểm do chúng có độc tính cao và có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước, các lớp trầm tích và đặc biệt trong thực phẩm). Các hợp chất PAH ít tan trong nước, dễ dàng hòa tan trong các chất béo, dung môi hữu cơ hay axit hữu cơ. PAH hấp thụ vào cơ thể thông qua các chuỗi thức ăn, tuỳ theo cấu tạo của các PAH và đối tượng tác động mà PAH có các mức độ tác động khác nhau. Sự có mặt ở những liều lượng nhất định của PAH thường gây ra những tác động không tốt đến sự sinh sản, sinh trưởng, phát triển và khả năng miễn dịch.

Sau một thời gian dài tích tụ trong cơ thể, PAH sẽ gây ảnh hưởng trực hoặc gián tiếp đến sức khỏe con người thông qua một số con đường khác nhau. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn. Trong chế biến thực phẩm có sử dụng nhiệt như chiên, nướng. hay trong quá trình bảo quản thịt, cá bằng xông khói thường làm cho thực phẩm bị nhiễm PAH.

Điều này rất nguy hại khi người tiêu dùng hiện nay có thói quen sử dụng nhiều thực phẩm chiên, nướng hay những thực phẩm chế biến sẵn như đồ hun khói… Hàm lượng PAH trong mẫu sinh phẩm, môi trường có thể xác định bằng các phương pháp như: sắc ký khí (GC), sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), quang phổ hấp thụ phân tử (UV).Trong đó, GC-MS là công cụ được lựa chọn để phát hiện các hợp chất hữu cơ ô nhiễm trong môi trường. Chi phí vận hành thiết bị GC-MS đã giảm đáng kể và đồng thời độ tin cậy cũng tăng cho nên việc sử dụng GC-MS trong các nghiên cứu về môi trường ngày càng nhiều. Trong đó, kỹ thuật GC-MS/MS là một lựa chọn lý tưởng về độ nhạy và độ đặc hiệu, đáp ứng được việc phân tích ở nồng độ thấp. Nhằm thiết lập một quy trình phân tích đáng tin cậy để xác định hàm lượng 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] PAH trong một số đối tượng mẫu thực phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thực hiện đề tài “Xác định một số hydrocarbon đa vòng thơm (PAH) trong thịt và sản phẩm từ thịt bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS)” nhằm mục đích: - Xây dựng quy trình phân tích một số PAH trong mẫu thịt áp dụng kỹ thuật QuEChERS cho giai đoạn xử lý mẫu và phân tích bằng GC-MS/MS.

- Áp dụng quy trình đã thiết lập để phân tích một số PAH trong một số mẫu thịt lưu hành trên thị trường. 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về PAH 1. Giới thiệu chung về PAH Các chất hydrocarbon thơm đa vòng (PAH – Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) là các hợp chất hữu cơ có chứa ít nhất hai vòng benzen và có thể có thêm các nhóm thế.

PAH được chia làm hai nhóm: PAH phân tử lượng thấp có hai hoặc ba vòng trong cấu trúc (naphthalen, acenaphthen, acenaphthylen, fluoren, phenanthren, và anthracen), PAH phân tử lượng cao có bốn, năm hoặc sáu vòng trong cấu trúc (fluoranthen, pyren, benzo(a)anthracen, chrysen, benzo(b) flouranthen, benzo(k)fluoranthen, benzo(a)pyren và dibenzo(a,h)anthracen) [73] [79]. Các PAH đã được xác định là tác nhân gây ung thư, gây đột biến và quái thai [6][11][30]. Đáng chú ý nhất trong nhóm này là benzo(a)pyren (C20H12) (hình 1. Công thức cấu tạo của benzo(a)pyren Các PAH được xếp vào nhóm chất hữu cơ gây ô nhiễm tồn dư dai dẳng (Persistant organic pollutants – POP).

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng PAH có thể nhiễm vào nhiều loại thực phẩm như ngũ cốc, các loại dầu, chất béo, rau và thịt [39][66]. Tính chất vật lý và hoá học của PAH 1. Tính chất vật lý Các PAH nguyên chất là chất rắn không màu, màu trắng, hoặc vàng nhạt ở nhiệt độ phòng [6][11][26]. Các PAH có áp suất hơi thấp, giảm dần theo khối lượng phân tử tăng, có nhiệt độ sôi, nhiệt độ nóng chảy cao.

Ngoại trừ naphtalen, các PAH rất ít tan trong nước, độ tan giảm theo khối lượng phân tử tăng, nhưng tan tốt trong 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] dung môi hữu cơ thân dầu. Một số tính chất vật lý của các PAH được cho trong bảng 1. Một số tính chất vật lý của PAH CTPT, Độ tan Cấu Nhiệt Nhiệt Khối trong trúc độ độ nóng Tên gọi lượng Màu nước ở hóa sôi chảy phân tử 25oC học (oC) o ( C) (g/mol) (μg/L) C10H8 Naphtalen Trắng 81 217,9 3,17.104 128 Acenaphthylen C12H8 92-93 152 C12H10 Acenaphthen Trắng 95 279 3,93.103 Không 178 Màu Anthracen C14H10 Không 216,4 342 73 178 Màu 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CTPT, Độ tan Cấu Nhiệt Nhiệt Khối trong trúc độ độ nóng Tên gọi lượng Màu nước ở hóa sôi chảy phân tử 25oC học (oC) (oC) (g/mol) (μg/L) Vàng Fluoranthen C16H10 108,8 375 260 nhạt 202 Pyren C16H10 Không 150,4 393 135 202 Màu Benzo C18H12 Không 160,7 400 14 (a)anthracen 228 Màu Chrysen C18H12 Không 253,8 448 2,0 228 Màu Benzo(b)fluora C20H12 Không 168,3 481 1,2 nthen 252 Màu Benzo(k)fluora Vàng C20H12 215,7 480 0,76 nthen nhạt 252 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CTPT, Độ tan Cấu Nhiệt Nhiệt Khối trong trúc độ độ nóng Tên gọi lượng Màu nước ở hóa sôi chảy phân tử 25oC học (oC) (oC) (g/mol) (μg/L) Benzo(a)pyren C20H12 Hơi vàng 178,1 496 3,8 252 Dibenzo(a,h)ant C22H14 Không 266,6 524 0,5 hracen 278 Màu (27oC) Benzo(g,h,i)per Vàng C22H12 278,3 545 0,26 ylen nhạt 276 Indeno(1,2,3- C22H12 Vàng 163,6 536 62 c,d)pyren 276 1. Tính chất hoá học Các PAH tương đối trơ về hoá học.

Các PAH bị phân hủy quang học trong không khí, tạo thành nhiều sản phẩm oxi hóa, bao gồm quinon và endopeoxit. Các PAH có thể hình thành các dẫn xuất nitơ, sunfinic và axit sunfonic, phản ứng với ozon và gốc hydroxyl trong không khí. Việc tạo thành hợp chất nitro – PAH rất quan trọng vì các hợp chất này có thể có hoạt tính sinh học và gây đột biến gen [48]. Một số PAH được sử dụng để sản xuất thuốc nhuộm, polyme, thuốc bảo vệ thực vật, trong công nghiệp dược phẩm [6][11][26][28][45].

15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.Độc tính của PAH và ảnh hưởng của PAH tới môi trường sống 1.Ảnh hưởng đối với thực vật Hầu hết các loại thực vật đều nhạy cảm với các PAH khi hấp thụ từ môi trường đất, nước và không khí qua thân, rễ, lá của chúng. Các PAH làm giảm khả năng sinh trưởng, sinh sản và phát triển của các loài thực vật và tích tụ trong thực vật, từ đó đi vào chuỗi thức ăn của động vật gây ra những tác hại lâu dài và nghiêm trọng hơn [52].Ảnh hưởng đối với động vật, con người Từ hệ thực vật, PAH được hấp thụ vào cơ thể của động vật thông qua các chuỗi thức ăn. Sự phơi nhiễm với PAH ở mức độ nhất định thường gây ra những tác động không tốt đến sự sinh sản, sinh trưởng, phát triển, khả năng miễn dịch hay làm chết các động vật [61]. Độc tính của các PAH đã được con người biết đến từ những năm 30 của thế kỷ XX, khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy tinh thể benzo(a)pyren màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [28].

Với con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến dẫn đến ung thư, gây đột biến gen [17][28][45] [51]. Trong tự nhiên, các PAH tồn tại chủ yếu dưới dạng hỗn hợp, thâm nhập vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức ăn, đường hô hấp hoặc qua sự tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm [74]. Trong số các PAH, người ta đặc biệt chú ý đến benzo(a)pyren vì độc tính của chất này. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh benzo(a)pyren có thể chuyển hóa thành các loại oxit nhờ cytochrom P450, mà những oxit này có thể tấn công cấu trúc ADN gây đột biến [28][45][55].

Với đối tượng thực phẩm, việc chế biến có sử dụng nhiệt như rán, nướng. hoặc bảo quản bằng xông khói thường làm cho thực phẩm bị nhiễm PAH. Tác động của PAH lên con người phụ thuộc vào nhiều yếu tố như liều lượng, thời gian phơi nhiễm, đường phơi nhiễm (ăn, uống, tiếp xúc qua da,…), 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] các hợp chất khác bị phơi nhiễm đồng thời, các đặc điểm cá thể của người bị phơi nhiễm (độ tuổi, giới tính, lối sống, tình trạng sức khỏe…) [45]. Trong nhóm PAH, naphthalen gây ảnh hưởng tới một loạt các cơ quan như phổi, thận, da, mắt và kìm hãm quá trình hô hấp trên người, dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận [45][66].

Phenanthren gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ hở gian bào [45][66]. Giới hạn cho phép PAH trong thực phẩm Cho tới nay, nhiều quốc gia trên thế giới đã đưa ra giới hạn kiểm soát các PAH trong thực phẩm. Tây Ban Nha, Ý, Hy Lạp và Thụy Điển đều thống nhất giới hạn 5 µg/kg cho tổng của 8 PAH nặng (benzo(a)pyren, dibenzo(a,h)anthracen, benzo(a)anthracen, benzo(e)pyren, benzo(b)fluoranthen, benzo(k)fluoranthen, indeno(1,2,3-c,d)pyren, và benzo(g,h,i)perylen) và giới hạn 2 µg/kg cho riêng từng PAH trong dầu oliu [66]. Đức đưa ra giới hạn 5 µg/kg cho tổng các PAH nặng và 25 µg/kg cho tổng của 16 PAH trong dầu và chất béo [66].

Canada cũng quy định tổng giới hạn 3 µg/kg cho dư lượng các PAH nặng benzo(a)pyren, dibenzo(a,h)anthracen, benzo(a)anthracen, benzo(b)fluoranthen, benzo(k)fluoranthen, indeno(1,2,3-cd)pyren, chrysen và benzo(g,h,i)perylen trong dầu và chất béo [23]. Nhiều nhà khoa học thống nhất lấy benzo(a)pyren làm quy chiếu khi đánh giá dư lượng của PAH trong thực phẩm [35][36]. Ủy ban châu Âu (EC) đã đưa ra các quy định 208/2005[33], 1881/2006 [34], thống nhất quy định giới hạn PAH tại tất cả các nước thành viên, cũng như giới hạn dư lượng benzo(a)pyren trong các loại thực phẩm khác nhau. Sau đó, EFSA [31][37] kết luận rằng benzo(a)pyren không thể hiện hết nguy cơ các PAH tồn dư trong thực phẩm.

Thay vào đó, việc đánh giá dư lượng benzo(a)pyren và tổng dư lượng bốn PAH (benzo(a)anthracen, benzo(b)fluoranthen, chrysen, benzo(a)pyren) đã được đề xuất và chính thức hóa (bảng 1. 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Giới hạn mới được ấn định tại Quy chế EC 835/2011 cho benzo(a)pyren và tổng của 4 PAH trong thực phẩm.