Luận văn: Phân tích gene và enzyme SQR ở vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh tại Việt Nam

Luận văn phân tích gen và enzyme SQR ở vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh tại Việt Nam. Tìm hiểu đặc tính hóa sinh, cấu trúc và cơ chế xúc tác của SQR.

• Tác giả: Hoàng Thanh Hiếu
• Người hướng dẫn: Pgs. Đỗ Thị Phúc
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân tích gen và enzyme SQR ở một số chủng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh phân lập tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh

Vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh (SOB) đóng vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh tự nhiên. Những vi khuẩn này có khả năng chuyển hóa các hợp chất lưu huỳnh vô cơ thành sulfate, giúp điều hòa chu trình này trong hệ sinh thái. Vi khuẩn tía oxy hóa lưu huỳnh là nhóm có khả năng thực hiện quang hợp không sử dụng nước, sử dụng lưu huỳnh hoặc các hợp chất khác làm chất cho điện tử. Những chủng vi khuẩn này được phân lập rộng rãi từ các mẫu nước thải, đất và môi trường nước. Sự hiện diện của vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh ở các vùng nước thải cho thấy tiềm năng ứng dụng trong xử lý môi trường. Nghiên cứu về các chủng vi khuẩn này tại Việt Nam đã mở ra nhiều hướng ứng dụng mới trong công nghệ sinh học và xử lý nước thải.

1.1. Chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh và vai trò của vi khuẩn

Chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh là quá trình tuần hoàn của lưu huỳnh trong tự nhiên. Vi khuẩn tham gia vào nhiều giai đoạn khác nhau của chu trình này, bao gồm oxy hóa và khử. Những vi khuẩn này chuyển đổi lưu huỳnh vô cơ thành các dạng khác nhau, tạo nên các bước quan trọng trong quá trình tuần hoàn tự nhiên. Sự tham gia của vi khuẩn giúp duy trì cân bằng dinh dưỡng trong hệ sinh thái nước và đất.

1.2. Chuyển hóa lưu huỳnh ở vi khuẩn tía

Vi khuẩn tía sử dụng các hợp chất lưu huỳnh làm nguồn năng lượng và chất cho điện tử trong quá trình quang hợp. Hệ thống enzyme của vi khuẩn này giúp oxy hóa các hợp chất lưu huỳnh như sulfide và elemental sulfur. Quá trình này tạo ra năng lượng dùng cho tổng hợp axit amin và các chất hữu cơ khác cần thiết cho sự sống.

II. Enzyme SQR vai trò và chức năng

Sulfide:quinone oxidoreductase (SQR) là enzyme chính chịu trách nhiệm oxy hóa sulfide ở vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh. Enzyme SQR nằm trên màng tế bào và màng photosynthetic của vi khuẩn tía. Cơ chế xúc tác của SQR liên quan đến việc chuyển điện tử từ sulfide sang quinone, tạo ra một gradient điện hóa học cần thiết cho sản xuất ATP. Protein này chứa nhóm FAD (flavin adenine dinucleotide) và các cysteine đóng vai trò quan trọng trong quá trình xúc tác. Nghiên cứu về cấu trúc và hoạt động của enzyme SQR giúp hiểu rõ hơn về khả năng oxy hóa và tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn này.

2.1. Đặc tính hóa sinh và cấu trúc của SQR

SQR là một enzyme ngoại biên được tìm thấy trên màng tế bào của vi khuẩn. Cấu trúc của protein này bao gồm nhiều miền chức năng với nhóm prosthetic FAD kết hợp chặt chẽ. Các cysteine bảo thủ trong SQR tham gia trực tiếp vào quá trình oxy hóa của sulfide. Hoạt tính enzyme của SQR phụ thuộc vào cấu trúc và sự sắp xếp của các axit amin quan trọng.

2.2. Phân loại và cơ chế xúc tác của SQR

SQR được phân loại thành nhiều loại khác nhau dựa trên trình tự di truyền và đặc tính cấu trúc. Các loại SQR khác nhau có cơ chế xúc tác tương tự nhau nhưng có sự khác biệt về hiệu suất và đặc tính pH tối ưu. Cơ chế nửa xúc tác của SQR bao gồm việc nhận điện tử từ sulfide và chuyển chúng sang quinone.

III. Phân tích gen sqr ở các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam

Nghiên cứu phân tích gen sqr trên các chủng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh phân lập từ nước thải sông Kim Ngưu đã cung cấp thông tin quý báu về tính đa dạng di truyền của vi khuẩn này tại Việt Nam. Sử dụng kỹ thuật PCR, các nhà nghiên cứu đã khuếch đại và giải trình tự gen sqr từ các chủng vi khuẩn khác nhau. Kết quả phân tích cho thấy sự tương đồng cao giữa gen sqr của các chủng vi khuẩn Việt Nam với các chủng quốc tế. Dữ liệu di truyền này giúp xác định vị trí địa phương của các chủng vi khuẩn trong cây phát sinh chủng loại toàn cầu. Phân tích tin sinh học tiết lộ các motif bảo thủ trong gen sqr được bảo tồn giữa các chủng khác nhau.

3.1. Kỹ thuật tách chiết ADN và PCR khuếch đại gen sqr

Tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn được thực hiện bằng phương pháp chuẩn với các lúa được sử dụng làm mẫu. Gen sqr được khuếch đại bằng phương pháp PCR sử dụng các primer đặc biệt được thiết kế dựa trên trình tự di truyền đã biết. Sản phẩm PCR được xác minh bằng điện di trên gel agarose trước khi giải trình tự.

3.2. Phân tích trình tự gen sqr và so sánh tin sinh học

Trình tự gen sqr được giải mã và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định danh tính và mức độ tương đồng. Phân tích tin sinh học bao gồm xây dựng cây phát sinh và xác định các vùng bảo thủ. Các kết quả cho thấy sự đa dạng và tính độc đáo của gen sqr ở các chủng Việt Nam.

IV. Ứng dụng và ý nghĩa nghiên cứu của enzyme SQR

Nghiên cứu về enzyme SQR và gen sqr có ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tiễn quan trọng. Hiểu biết về enzyme này giúp phát triển công nghệ xử lý nước thải chứa lưu huỳnh. Vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh có thể được ứng dụng để xử lý nước thải công nghiệp và khôi phục môi trường. Phân tích gen sqr giúp chọn lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính cao nhất cho mục đích công nghệ sinh học. Ngoài ra, nghiên cứu cấu trúc protein SQR mở ra cơ hội thiết kế enzyme nhân tạo với hoạt tính tối ưu hơn. Kiến thức về vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh cũng góp phần hiểu rõ hơn về quá trình tự nhiên và vai trò của vi sinh vật trong các chu trình địa hóa.

4.1. Ứng dụng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường

Vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh có tiềm năng lớn trong xử lý nước thải công nghiệp chứa lưu huỳnh. Sử dụng vi khuẩn này có thể chuyển đổi lưu huỳnh độc hại thành các chất ít độc hại hơn. Phương pháp xử lý sinh học này tiết kiệm chi phí và thân thiện với môi trường so với các phương pháp hóa học truyền thống.

4.2. Tiềm năng phát triển công nghệ sinh học

Phân tích gen sqr cung cấp nền tảng di truyền cho phát triển những phương pháp cải biến gen và tối ưu hóa hoạt tính enzyme. Hiểu biết sâu sắc về cơ chế xúc tác của SQR giúp thiết kế enzyme biến đổi gen với hiệu suất cao hơn. Công nghệ CRISPR và các kỹ thuật di truyền khác có thể được áp dụng để cải thiện khả năng oxy hóa lưu huỳnh của vi khuẩn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh và vị trí của vi khuẩn trong chu trình 1. Chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh Lưu huỳnh (S) đứng thứ 10 trong số những nguyên tố dồi dào nhất trên trái đất và là nguyên tố phổ biến thứ 6 trong sinh khối vi sinh vật [53]. Nguyên tố lưu huỳnh có công thức phân tử S8, được tìm thấy ở ba dạng tự nhiên khác nhau: alpha (vàng), beta (nâu) và gamma (vàng nhạt) và nó hòa tan trong dung môi hữu cơ ở nhiều mức độ khác nhau nhưng không hòa tan trong nước [35].

Các cồn muối, các chất bốc hơi phân lớp và các trầm tích núi lửa đều là những nơi có thể tìm thấy lưu huỳnh tự nhiên. Nó cũng có thể được liên kết với các khoáng chất sulfatee như anhydrit, barit và thạch cao, cũng như các sunfide như chalcopyrite, pyrrhotite, sphalerite, galena, và pyrite (FeS2). Lưu huỳnh cũng có trong khí tự nhiên, dầu, than đá, cát bitum, đá phiến pyrobitum và dưới dạng hydrogen sulfide (H2S) trong đất thiếu oxy, cũng như sản phẩm phụ của các hoạt động công nghiệp [35]. Khoáng chất tự nhiên FeS2 là nguồn cung cấp lưu huỳnh chính trong đất.

Lưu huỳnh dễ bị khử và bị oxy hóa, gây ra nhiều phản ứng trong đất [79]. Chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh cũng là một trong số các chu trình sinh địa hóa lớn nhất trong tự nhiên, bên cạnh chu trình nước, carbon, ni-tơ, phốt-pho, sắt [92]. Chu trình sinh địa hóa của S liên quan đến một số phản ứng oxy hóa và khử [92]. Các con đường chính liên quan đến chu trình S là sự khoáng hóa S hữu cơ thành S vô cơ, quá trình oxy hóa của S0, SO32- và S2O32- thành SO42-, sự khử SO42- thành H2S và sự cố định các hợp chất S bởi các vi sinh vật và các quá trình đồng hóa sau đó của S thành dạng chất hữu cơ.

Tóm tắt các con đường tạo nên chu trình sinh địa hóa của S được tóm tắt và minh họa như Hình 1 [55]. Các hợp chất lưu huỳnh vô cơ dưới trạng thái oxy hóa được ước tính chiếm gần một nửa trong toàn bộ chu trình lưu huỳnh trên hành tinh này. Vi khuẩn và cổ khuẩn giữ vai trò hình thành các dạng oxy hóa của 2 lưu huỳnh từ các hợp chất khử; chúng thuộc nhóm các sinh vật hóa dưỡng vô cơ hoặc quang dưỡng vô cơ [29],[48] [97]. Mô hình chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh [55] 1.

Vai trò của vi khuẩn trong chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh Các phản ứng khử lưu huỳnh có thể được diễn ra theo hai cách: đồng hóa hoặc dị hóa. Trong con đường khử đồng hóa, S dạng khử thường được dùng cho các phản sinh tổng hợp axit amin và protein, trong khi đó với con đường khử trong dị hóa, sulfate bị khử thành sulfide vô cơ bởi các vi khuẩn khử sulfate kỵ khí bắt buộc. Quá trình khử sulfur diễn ra thông qua hệ thống sulfur reductase dị hóa, tồn tại ở cả các loài vi khuẩn và cổ khuẩn khử sulfate (Wagner, 1998). Vi khuẩn và cổ khuẩn thuộc nhóm này có thể kể đến, tương ứng gồm Desulfurella, Desulfuromonas, Geobacter, Pelobacter,v.

và Thermoproteales, Thermococcales, Sulfolobales, Pyrodictales,, v.v… Oxy hóa lưu huỳnh là một trong những phản ứng phổ biến nhất trong môi trường[30] và là phản ứng quan trọng trong đất để tránh cho thực vật bị thiếu hụt lưu 3 huỳnh và tránh ô nhiễm môi trường. Cổ khuẩn và vi khuẩn có tham gia vào các phản ứng oxy hóa lưu huỳnh. Phần lớn các nhóm vi sinh vật này dùng CO2 là nguồn carbon chính và S là chất cho điện tử [30] [14]. Các hợp chất lưu huỳnh được sử dụng bởi nhóm vi sinh vật này gồm sulfides (S2-, HS-, H2S), polysulfides (-S-Sn-S-), S nguyên tố (S0), tetrathionate (S4O62-), sulfite (SO32-), và thiosulfate (S2O32-) [59].

Tất cả các cổ khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa lưu đều là sinh vật hiếu khí và thuộc Bộ Sulfolobales [32] [54], được đặc trưng bởi các vi khuẩn ưa axit (các vi khuẩn cực trị cần pH thấp để phát triển) và các vi khuẩn ưa nhiệt (các vi khuẩn cực trị cần nhiệt độ cao để phát triển). Các loài được nghiên cứu nhiều nhất là chi Sulfolobus, một cổ khuẩn hiếu khí, và Acidianus, một nhóm kỵ khí tùy tiện. Trong khi đó, vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh (SOB) là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí hoặc tùy tiện, và hầu hết chúng là sinh vật tự dưỡng, có thể sử dụng CO2 hoặc các hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon [27]. SOB phong phú và được nghiên cứu nhiều nhất thuộc họ Thiobacilliaceae trong môi trường trên cạn và họ Beggiatoaceae trong môi trường nước [27].

SOB hiếu khí chủ yếu là vi khuẩn ưa nhiệt, phát triển ở nhiệt độ và pH vừa phải, mặc dù một số là ưa nhiệt và/hoặc ưa axit. Ngoài các họ này, các SOB khác được mô tả thuộc về chi Acidithiobacillus [47], Aquaspirillum [28], Aquifex [41], Bacillus [9], Methylobacteria [49], Paracoccus, Pseudomonas [28], Starkey, Thermithiobacillus [47] và Xanthobacter [28]. Mặt khác, sợi khuẩn đa bào thuộc họ Desulfobulbaceae (Deltaproteobacteria) với các đại diện là hai chi ứng viên Electronema và Electrothrix [95] không thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. SOB kỵ khí chủ yếu là quang tự dưỡng ưa pH trung tính/nhiệt độ trung bình, lấy năng lượng từ ánh sáng nhưng sử dụng các hợp chất lưu huỳnh dạng khử làm chất cho hydro hoặc điện tử để quang hợp (thay vì nước).

SOB kỵ khí bao gồm một số vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Chlorobiaceae), cũng như vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Chromatiaceae), như Allochromatium [43] và vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Rhodospirillaceae) [14] và một số vi khuẩn lam Cyanobacteria [27]. Vi khuẩn lam kỵ khí oxy hóa lưu huỳnh chỉ có khả năng oxy hóa sunfua thành lưu huỳnh nguyên 4 tố và đã được xác định là Oscillatoria, Lyngbya, Aphanotece, Microcoleus và Phormidium [19] [34]. Một số SOB kỵ khí khác như các loài kỵ khí tùy tiện Thiobacillus spp., và Thermothrix sp., là các vi sinh vật hóa tự dưỡng, lấy năng lượng từ quá trình oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh, sau đó được sử dụng để cố định CO2. Những loại khác, chẳng hạn như một số vi khuẩn màu lục dạng sợi (Chloroflexaceae), là vi khuẩn hỗn hợp.

Trong số tất cả SOB, nhóm duy nhất oxy hóa trực tiếp sunfua thành sulfate trong lượng oxy dồi dào mà không tích lũy lưu huỳnh nguyên tố là Thiobacilli. Các nhóm khác tích lũy lưu huỳnh nguyên tố, chúng có thể oxy hóa thành sulfate khi sunfua bị hạn chế hoặc cạn kiệt [27]. Tổng hợp một số đại diện vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh theo các nhóm nhu cầu dinh dưỡng và năng lượng được tóm tắt trong Bảng 1 [76]. Ví dụ về các SOB thuộc các nhóm dinh dưỡng khác nhau.

Chlorobium limicola Chlorobium tepidum Chromatium Chloroherpeton, Prosthecochloris, Quang dưỡng vô vơ (GSB) Pelodictyon, Năng lượng – Ánh sáng 1 Ancalochloris Nguồn Carbon – CO2 Ectothiorhodospira spp. Cgloroflexus aurantiacus Oscillatoria sp. Quang dưỡng vô cơ tùy tiện (vi Allochromatium, 2 khuẩn tía lưu huỳnh - PSB) Thioalkalicoccus Năng lượng – Ánh sáng Thioradococcus 5 Nguồn Carbon – CO2 hoặc hợp chất Thiococcus hữu cơ Thiocysts Thiospririllum Ectothiorhodospira Halorhodospira Thiorhodospira Thiobacillus thioparus Thiobacillus novellas Thiobacillus termophilic Hóa dưỡng vô cơ Thiobacillus denitrificans Năng lượng – các hợp chất khử của Acidithiobacillus ferrooxidans 3 lưu huỳnh và nito/sắt reduced sulfur Acidithiobacillus thiooxidans and nitrogen/iron compounds Acidithiobacillus albertensis Nguồn Carbon - CO2 Thiomicrospira denitrificans Thiosphaera pantotropha Acidianus brierleyi Thermothrix azorensis Sulfolobus acidocaldarius Hóa dưỡng vô cơ tùy tiện Sulfolobus metallics Năng lượng — hợp chất khử của lưu Thermothrix thiopara 4 huỳnh hoặc hợp chất hữu cơ Pseudomonas denitrificans Nguồn Carbon - CO2 hoặc hợp chất Paracoccus denitrificans hữu cơ Beggiatoa alba Hóa dị dưỡng (mixotrophs) Thiobacillus intermedius Năng lượng – các hợp chất khử của Paracoccus versutus 5 lưu huỳnh Thiobacillus organoparus Nguồn Carbon – các hợp chất hữu cơ Pseudomonas spp. Hóa dưỡng hữu cơ Thiomonas permetabolis 6 Năng lượng – chất hữu cơ Pseudomonas acidovorans Nguồn Carbon – các hợp chất hữu cơ 1.

Vi khuẩn tía oxy hóa lưu huỳnh Vi khuẩn tía oxy hóa lưu huỳnh có thể được chia thành vi khuẩn tía lưu huỳnh (gammaproteobacteria) và vi khuẩn tía không lưu huỳnh (alpha- hoặc betaproteobacteria); chúng là các vi khuẩn gram âm. Sắc tố quang hợp điển hình là BChl a hoặc b và các carotenoid chính bao gồm spirilloxanthin, spheroidene, lycopene, rhodopsin, và các dẫn xuất của chúng; sắc tố khiến huyền phù tế bào có màu đặc trưng như tím, tím-đỏ, tím violet, đỏ, cam, nâu, vàng nâu (các loài chứa BChl a) hoặc xanh lục, vàng (các loài chứa BChl b). Sắc tố được sắp xếp dưới dạng các túi, ống, bó ống hoặc xếp chồng bên trong lớp màng sinh chất bên trong. Vi khuẩn tía lưu huỳnh cơ bản chia thành 2 họ chính, gồm Chromatiaceae, có tích lũy lưu huỳnh nguyên tố (S0) bên trong tế bào và Ectothiorhodospiraceae sinh S0 ở bên ngoài tế bào.

Nhiều đại diện trong nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh là các vi khuẩn ưa cực trị, phát triển tốt nhất trong môi trường muối/pH cao [64]. Vi khuẩn tía không lưu huỳnh có thể chia thành 7 họ với tổng cộng khoảng 20 chi đã được ghi nhận. Các loài Rhodobacter và Rhodopseudomonas là đối tượng chính cho các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về quang hợp thiếu oxy. Nhiều loài có một hoặc nhiều đặc điểm trao đổi chất khác thường cũng được biết đến.

Ví dụ, các loài cực trị sống ở môi trường nóng, lạnh, mặn, kiềm, axit [64]. Chuyển hóa lưu huỳnh ở vi khuẩn tía Tương đối dễ dàng để có thể nuôi cấy vi khuẩn tía trong phòng thí nghiệm, cơ bản yêu cầu là môi trường kị khí với các khoáng chất và bổ sung hoặc sulfide, bicarbonate (nếu là mô hình quang tự dưỡng), hoặc bổ sung chất hữu cơ (nếu là mô hình quang dị dưỡng). Vì lẽ đó, và cũng bởi quang hợp không oxy là dạng quang hợp đơn giản hơn quang hợp có oxy, vi khuẩn tía là một hệ thống mô hình lý tưởng để 7 nghiên cứu sinh lý học, hóa sinh học, sinh học phân tử của quá trình quang hợp cũng như quá trình oxy hóa lưu huỳnh. Vi khuẩn tía lưu huỳnh Trong số các hợp chất khử của lưu huỳnh, sulfide có vai trò mật thiết với sự phát triển của vi khuẩn tía lưu huỳnh, với số lượng lớn các loài thuộc nhóm này đã được ghi nhận ở các môi trường có ánh sáng và có tồn tại sulfide [71][72] [73].

Trong trường hợp sinh trưởng dạng quang tự dưỡng, nguồn cho điện tử có thể là sulfide, thiosulfate hoặc H2 [12] [97]. Các loài thuộc Chromatium như Chromatium okenii, Chromatium weissei, và Thiospirillum [96], hay các loài ưa nhiệt như Thermochromatium (Tch.) tepidum [63] đòi hỏi sulfide một cách nghiêm ngặt để có thể sinh trưởng phát triển. Một số ít loài vi khuẩn tía lưu huỳnh có thể sử dụng Fe2+ hoặc NO2- là chất cho điện tử [26].