Luận văn thạc sĩ hus phân tích tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen oshkt15 liên quan đến khả năng chịu mặn ở cây lúa oryza sativa

Luận văn thạc sĩ phân tích hus phân tích tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen oshkt15 liên quan đến khả năng chịu mặn ở, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Trần Xuân An
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Phân Tích Tính Đa Hình Và Mức Độ Biểu Hiện Của Gen OsHKT1;5 Liên Quan Đến Khả Năng Chịu Mặn Ở Cây Lúa (Oryza Sativa)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đất nhiễm mặn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng
• 1.2. Giới thiệu về đất nhiễm mặn
• 1.3. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam
• 1.4. Ảnh hưởng của mặn tới năng suất, chất lượng cây lúa
• 1.5. Cơ chế tác động của đất nhiễm mặn đến cây trồng
• 1.6. Các họ protein vận chuyển ion Na+ ở cây trồng
• 1.6.1. Vai trò của protein NHX và SOS trong việc duy trì nồng độ Na+ thấp trong tế bào chất
• 1.6.2. Protein HKT đóng vai trò chính trong khả năng chịu mặn của thực vật và ngăn chặn Na+ vận chuyển từ rễ đến thân. Họ gen OsHKT ở cây lúa
• 1.7. Nghiên cứu đa hình sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự gen
• 1.7.1. Giải trình tự gen
• 1.7.2. Phân tích tin sinh học
• 1.7.3. Nghiên cứu biểu hiện của gen sử dụng phương pháp Realtime-PCR
• 1.8. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 1.9. Phương pháp phân tích đa hình gen
• 1.9.1. Trồng và thu mẫu
• 1.9.2. Tách chiết DNA tổng số
• 1.10. Khuếch đại gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
• 1.10.1. Điện di trên gel Agarose
• 1.10.2. Tinh sạch và giải trình tự gen
• 1.10.3. Phân tích trình tự gen bằng các công cụ tin sinh
• 1.11. Phương pháp phân tích mức độ biểu hiện gen
• 1.11.1. Trồng lúa thủy cảnh và thu mẫu
• 1.11.2. Tách chiết ARN tổng số
• 1.11.3. Tổng hợp cDNA dùng mồi oligo T. Phản ứng Realtime-PCR
• 2. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân tích đa hình gen OsHKT1. Tách chiết DNA tổng số
• 3.2. Phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter và trình tự mã hóa của gen OsHKT1. Thiết kế mồi. Nhân vùng Promoter của gen OsHKT1. Nhân vùng CDS của gen OsHKT1;5
• 3.3. Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;5
• 3.4. Đánh giá mức độ biểu hiện gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn
• 3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ mô lá
• 3.4.2. Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
• 3.5. Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 bằng phương pháp Real-time PCR
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Gen OsHKT1 5 Và Khả Năng Chịu Mặn Ở Cây Lúa

Gen OsHKT1;5 là một trong những gen quan trọng trong việc điều chỉnh khả năng chịu mặn ở cây lúa Oryza sativa. Nghiên cứu về gen này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh lý của cây lúa mà còn mở ra hướng đi mới trong việc cải thiện giống lúa chịu mặn. Cây lúa là cây trồng chủ lực tại Việt Nam, nhưng lại rất nhạy cảm với điều kiện môi trường, đặc biệt là đất nhiễm mặn. Việc phân tích gen OsHKT1;5 sẽ giúp xác định các biến thể gen có liên quan đến khả năng chịu mặn, từ đó có thể phát triển các giống lúa mới có khả năng chống chịu tốt hơn.

1.1. Giới Thiệu Về Gen OsHKT1 5 Và Vai Trò Của Nó

Gen OsHKT1;5 thuộc họ gen HKT, có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển ion Na+ và K+ trong cây lúa. Nghiên cứu cho thấy gen này giúp duy trì cân bằng ion trong tế bào, từ đó cải thiện khả năng chịu mặn của cây. Việc hiểu rõ về gen này sẽ giúp các nhà khoa học phát triển các giống lúa có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện mặn.

1.2. Tình Hình Nghiên Cứu Gen OsHKT1 5 Trên Thế Giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen OsHKT1;5 có ảnh hưởng lớn đến khả năng chịu mặn của cây lúa. Các nghiên cứu này đã sử dụng các phương pháp hiện đại như giải trình tự gen và phân tích biểu hiện gen để xác định vai trò của gen này trong việc chống chịu mặn. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu về gen này vẫn còn hạn chế.

II. Vấn Đề Nhiễm Mặn Ảnh Hưởng Đến Cây Lúa Oryza Sativa

Nhiễm mặn là một trong những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất cây lúa tại Việt Nam. Đất nhiễm mặn không chỉ làm giảm khả năng sinh trưởng của cây mà còn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Các nghiên cứu cho thấy rằng, khi nồng độ muối trong đất tăng cao, cây lúa sẽ gặp khó khăn trong việc hấp thu nước và dinh dưỡng, dẫn đến tình trạng héo úa và chết cây.

2.1. Tác Động Của Nhiễm Mặn Đến Sinh Trưởng Của Cây Lúa

Nhiễm mặn làm tăng áp suất thẩm thấu trong đất, khiến cây lúa không thể hấp thu đủ nước. Điều này dẫn đến tình trạng héo úa, giảm năng suất và chất lượng lúa. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây lúa có thể chịu được một mức độ mặn nhất định, nhưng khi vượt quá ngưỡng này, cây sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng.

2.2. Các Giải Pháp Đối Phó Với Nhiễm Mặn Trong Canh Tác Lúa

Để đối phó với tình trạng nhiễm mặn, nông dân có thể áp dụng một số biện pháp như chọn giống lúa chịu mặn, cải tạo đất và sử dụng các biện pháp tưới tiêu hợp lý. Việc nghiên cứu và phát triển các giống lúa có khả năng chịu mặn cao là rất cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Gen OsHKT1 5 Trong Cây Lúa

Nghiên cứu gen OsHKT1;5 được thực hiện thông qua các phương pháp hiện đại như PCR, giải trình tự gen và phân tích biểu hiện gen. Các phương pháp này giúp xác định các biến thể gen và mức độ biểu hiện của gen trong các điều kiện khác nhau, từ đó đánh giá khả năng chịu mặn của cây lúa.

3.1. Phương Pháp PCR Trong Nghiên Cứu Gen OsHKT1 5

Phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen OsHKT1;5 từ mẫu DNA của cây lúa. Kỹ thuật này cho phép xác định sự hiện diện của gen và các biến thể gen có liên quan đến khả năng chịu mặn.

3.2. Phân Tích Biểu Hiện Gen Bằng Phương Pháp Realtime PCR

Realtime-PCR là phương pháp được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 trong các điều kiện khác nhau. Phương pháp này cho phép theo dõi sự thay đổi mức độ biểu hiện gen theo thời gian và điều kiện môi trường, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về khả năng chịu mặn của cây lúa.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Gen OsHKT1 5 Và Khả Năng Chịu Mặn

Kết quả nghiên cứu cho thấy gen OsHKT1;5 có mối liên hệ chặt chẽ với khả năng chịu mặn của cây lúa. Các giống lúa có biểu hiện gen OsHKT1;5 cao thường có khả năng chịu mặn tốt hơn. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển giống lúa chịu mặn tại Việt Nam.

4.1. Đánh Giá Mức Độ Biểu Hiện Gen OsHKT1 5 Ở Các Giống Lúa

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các giống lúa khác nhau có mức độ biểu hiện gen OsHKT1;5 khác nhau. Những giống lúa có khả năng chịu mặn tốt thường có mức độ biểu hiện gen này cao hơn so với các giống lúa nhạy cảm với mặn.

4.2. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu Trong Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu về gen OsHKT1;5 có thể được ứng dụng trong việc phát triển các giống lúa mới có khả năng chịu mặn tốt hơn. Điều này không chỉ giúp nâng cao năng suất lúa mà còn đảm bảo an ninh lương thực trong bối cảnh biến đổi khí hậu.

V. Kết Luận Và Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu Gen OsHKT1 5

Nghiên cứu gen OsHKT1;5 là một bước tiến quan trọng trong việc cải thiện khả năng chịu mặn của cây lúa Oryza sativa. Các kết quả đạt được không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh lý của cây mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển giống lúa chịu mặn. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về gen này để phát triển các giống lúa có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trường khắc nghiệt.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Gen Trong Nông Nghiệp

Nghiên cứu gen không chỉ giúp cải thiện giống cây trồng mà còn đóng góp vào việc phát triển nông nghiệp bền vững. Việc hiểu rõ về các gen liên quan đến khả năng chịu mặn sẽ giúp nông dân có thể chọn lựa giống cây phù hợp với điều kiện đất đai và khí hậu.

5.2. Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu Gen OsHKT1 5

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu về gen OsHKT1;5 để phát triển các giống lúa có khả năng chịu mặn tốt hơn. Các công nghệ sinh học hiện đại sẽ được áp dụng để tăng cường khả năng chống chịu của cây lúa, từ đó đảm bảo an ninh lương thực cho đất nước.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Biến đổi khí hậu toàn cầu và hiện tượng nước biển dâng đang gia tăng áp lực nghiêm trọng lên ngành nông nghiệp Việt Nam, đặc biệt là tại các vùng đồng bằng ven biển. Theo các báo cáo môi trường, nếu mực nước biển dâng thêm 75 cm thì khoảng 19% diện tích Đồng bằng sông Cửu Long sẽ bị ngập mặn; kịch bản nước biển dâng 1 m có nguy cơ làm chìm ngập gần 38% diện tích vựa lúa trọng điểm này. Hiện nay, cả nước ghi nhận hơn 1.000.000 ha đất bị nhiễm mặn, tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Nam và rải rác một số diện tích đất mặn kiềm tại Duyên hải Nam Trung Bộ. Thiệt hại do xâm nhập mặn đã làm suy giảm đáng kể diện tích canh tác lúa; riêng vụ đông xuân năm 2017, diện tích gieo cấy tại Đồng bằng sông Hồng giảm 10,1 nghìn ha và Đồng bằng sông Cửu Long giảm 16,3 nghìn ha.

Cây lúa (Oryza sativa) vốn là cây trồng mẫn cảm với stress thẩm thấu và độc tính ion khi nồng độ muối vượt ngưỡng cho phép. Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền học tập trung giải quyết vấn đề cấp bách: xác định bản chất di truyền và cơ chế điều hòa biểu hiện của gen OsHKT1;5 – thành viên quan trọng kiểm soát dòng ion Na+ trong cây lúa. Nghiên cứu được triển khai tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội trong giai đoạn 2017 - 2018. Mục tiêu cụ thể là phân tích tính đa hình nucleotide trên cả vùng promoter và vùng mã hóa (CDS) của gen OsHKT1;5 trên tập đoàn 22 giống lúa địa phương và chuẩn quốc tế, đồng thời định lượng mức độ biểu hiện phiên mã của gen ở mô rễ và mô lá dưới các điều kiện xử lý mặn (50 mM và 100 mM NaCl). Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học chính xác để phục vụ công tác chọn tạo giống lúa kháng mặn bằng chỉ thị phân tử, hướng tới mục tiêu ổn định năng suất lúa từ 15% đến 25% tại các vùng chịu ảnh hưởng mặn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Khả năng chống chịu mặn ở thực vật là tính trạng số lượng phức tạp được chi phối bởi mạng lưới điều hòa nội môi ion tế bào, trong đó nổi bật là 3 họ protein vận chuyển chính: SOS (loại Na+ ra khỏi màng sinh chất), NHX (cô lập Na+ vào không bào) và HKT (High-Affinity K+ Transporter). Ở cây lúa, họ gen OsHKT bao gồm 9 thành viên được chia thành 2 phân họ chức năng: phân họ I (OsHKT1;1 đến OsHKT1;5) chịu trách nhiệm vận chuyển chọn lọc ion Na+, và phân họ II (OsHKT2;1 đến OsHKT2;4) tham gia đồng vận chuyển cả Na+ và K+.

Gen OsHKT1;5 (còn gọi là locus SKC1) nằm trong vùng QTL chịu mặn chính mang tên Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 của lúa. Protein OsHKT1;5 định vị tại màng tế bào nhu mô bao quanh mạch xylem ở rễ và bẹ lá, thực hiện chức năng then chốt là dỡ bỏ chủ động ion Na+ ra khỏi dòng nhựa mạch gỗ (xylem sap) trước khi Na+ bị tích tụ quá mức lên phiến lá quang hợp. Nghiên cứu vận dụng 3 khái niệm sinh học phân tử nền tảng:

• Đa hình nucleotide đơn (SNPs) và đột biến mất/chèn đoạn (InDels) làm thay đổi cấu trúc không gian protein hoặc chức năng điều hòa phiên mã.
• Các yếu tố điều hòa cis (cis-acting regulatory elements) trên vùng promoter như TATA-box, CAAT-box, GT1-motif và Circadian, đóng vai trò điểm gắn kết của các nhân tố phiên mã (bZIP, WRKY, NAC, MYB) nhằm kích hoạt gen khi cây tiếp xúc nồng độ mặn vượt 100 mM NaCl.
• Động học phiên mã tương đối qua chỉ số thay đổi mức độ biểu hiện (Fold Change) được chuẩn hóa theo gen nội sinh.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 22 giống lúa thuần và giống địa phương do Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, bao gồm giống chuẩn kháng Pokkali, giống chuẩn nhiễm Nipponbare, IR29, cùng các giống bản địa như Chăm biển, Chiêm rong, Nếp Cúc, Mặn 1, Mặn 2, Tép Lai, Dâu Ấn Độ. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích đại diện cho các nhóm hình thái và ngưỡng chịu mặn khác nhau từ mức mẫn cảm cao đến mức chống chịu tốt.

Quy trình thực nghiệm và phân tích bao gồm:

• Tách chiết DNA và khuếch đại gen: DNA tổng số được tách chiết từ mô lá giai đoạn 3-4 lá bằng dung dịch đệm CTAB 2x cải tiến. Thiết kế 3 cặp mồi đặc hiệu bằng công cụ Primer-BLAST: cặp mồi Pro-HKT1.5 khuếch đại đoạn promoter dài 1934 bp (nhiệt độ gắn mồi 55°C); cặp mồi HKT1.5-1 khuếch đại Exon 1 dài 1639 bp và cặp mồi HKT1.5-2 khuếch đại Exon 2-3 dài 1460 bp (nhiệt độ gắn mồi 57°C). Phản ứng PCR thực hiện qua 35 chu kỳ nhiệt trên máy Applied Biosystems 9700.
• Giải trình tự và phân tích tin sinh học: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit GeneJET Gel Extraction và giải trình tự tự động theo phương pháp Sanger qua dịch vụ 1st-Base (Singapore). Trình tự được căn chỉnh bằng MultAlin và BLAST; dự đoán các yếu tố cis trên promoter bằng công cụ PlantCARE và PLACE; mô phỏng cấu trúc không gian 3 chiều của protein bằng Phyre2.
• Thử nghiệm sinh lý và Real-time RT-PCR: Nuôi cấy thủy canh 2 giống lúa đối chứng (Pokkali và Nipponbare) trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida 2 tuần tuổi, sau đó gây stress mặn bằng NaCl ở 2 mức nồng độ 50 mM và 100 mM (đối chứng 0 mM NaCl). Thu mẫu rễ và lá tại 7 thời điểm: 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 7 ngày. Tách chiết RNA tổng số, xử lý DNase I, tổng hợp cDNA bằng RevertAid First Strand Kit và chạy Real-time PCR trên hệ thống ABI Fast 7500 với hóa chất SYBR Green Master Mix, sử dụng gen Actin1 làm đối chứng nội và tính toán biểu hiện tương đối qua công thức 2-ΔΔCt.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã làm sáng tỏ cấu trúc di truyền và đặc tính phiên mã của gen OsHKT1;5 thông qua 3 phát hiện khoa học quan trọng:

1. Đa hình cấu trúc vùng promoter: Khuếch đại và giải trình tự thành công đoạn promoter dài 1934 bp trên 14 giống lúa, phát hiện 25 vị trí nucleotide biến dị bao gồm 19 đột biến thay thế và 6 đột biến mất đoạn. Dựa vào ma trận sai khác, 14 giống lúa được chia thành 5 nhóm rõ rệt: Nhóm 1 (Nipponbare, Cườm 2, Nếp Cúc); Nhóm 2 (Mặn 1, Mặn 2); Nhóm 3 (Cườm 1, Chiêm rong, Chăm, Chành Trụi); Nhóm 4 (Pokkali); và Nhóm 5 (Tép Lai, Tẻ Tép, IR29, Chiêm Đen). Đáng chú ý, các đột biến tại vị trí -1253, -1201, -969 bp làm thay đổi yếu tố CAAT-box, trong khi biến dị tại -275 bp làm biến đổi yếu tố TATA-box ở các nhóm giống chịu mặn.
2. Đa hình vùng mã hóa (CDS) và biến đổi axit amin: Phân tích trình tự CDS trên 16 giống lúa phát hiện 12 vị trí nucleotide biến dị, phân thành 6 nhóm sai khác. Quá trình dịch mã suy biến xác định được 6 đột biến có nghĩa làm thay đổi trực tiếp 6 axit amin trong chuỗi polypeptide của protein OsHKT1;5. Kết quả mô phỏng cấu trúc 3D trên nền tảng Phyre2 cho thấy các đột biến này định vị tại các vòng lặp xuyên màng và gần vùng lỗ lọc ion, ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng không gian của kênh vận chuyển.
3. Đặc tính biểu hiện phiên mã đáp ứng stress mặn: Phân tích Real-time PCR chứng minh gen OsHKT1;5 biểu hiện mạnh mẽ ở cả rễ và lá khi có tác động của muối. Ở giống kháng Pokkali, mức độ phiên mã tại mô rễ tăng vọt ngay từ 1 giờ đến 5 giờ sau khi xử lý 50 mM và 100 mM NaCl, đạt đỉnh biểu hiện cao hơn từ 3 đến 5 lần so với mẫu đối chứng không xử lý. Ngược lại, ở giống nhiễm Nipponbare, mức độ tăng sinh transcript diễn ra chậm, biên độ dao động thấp hơn rõ rệt (chỉ tăng nhẹ khoảng 1,2 đến 1,8 lần tại thời điểm 24 giờ rồi suy giảm nhanh sau 72 giờ).

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu giải trình tự và biểu hiện gen cho phép tái hiện cơ chế chống chịu mặn của cây lúa một cách toàn diện qua các biểu đồ so sánh chu kỳ khuếch đại (amplification plot) và bảng ma trận đột biến nucleotide. Sự sai khác 25 vị trí trên vùng promoter giữa giống chuẩn kháng Pokkali và giống chuẩn nhiễm Nipponbare giải thích trực tiếp sự khác biệt về khả năng cảm ứng phiên mã. Sự hiện diện của các motif TATA-box và CAAT-box tối ưu tại promoter của giống Pokkali giúp tăng cường ái lực liên kết với phức hệ ARN polymerase và các nhân tố phiên mã điều hòa stress như bZIP hoặc NAC, từ đó kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của gen OsHKT1;5 chỉ sau 1 giờ tiếp xúc với dung dịch 100 mM NaCl.

Về mặt cấu trúc phân tử, 6 đột biến thay thế axit amin trên protein OsHKT1;5 ở các giống lúa địa phương như Chăm biển, Chiêm rong và Pokkali đóng vai trò then chốt trong việc duy trì cấu trúc lỗ lọc ion Na+. So sánh với các công bố quốc tế về locus SKC1, protein OsHKT1;5 ở giống kháng có tốc độ tải Na+ từ dịch mạch gỗ vào tế bào nhu mô rễ nhanh hơn đáng kể, ngăn ngừa tình trạng quá tải ion Na+ lên chồi lá. Nhờ đó, cây lúa duy trì được tỷ lệ K+/Na+ nội bào ở mức tối ưu, bảo vệ bộ máy quang hợp khỏi hiện tượng cháy lá và ức chế sinh trưởng sinh dưỡng.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng thực nghiệm về tính đa hình và động học biểu hiện của gen OsHKT1;5, nghiên cứu đề xuất 4 nhóm giải pháp công nghệ và ứng dụng thực tiễn:

1. Xây dựng bộ chỉ thị phân tử chức năng (Functional Markers): Thiết kế ngay các cặp mồi dCAPS và mồi đặc hiệu allele dựa trên 6 đột biến axit amin tại vùng CDS và đột biến TATA-box tại vị trí -275 bp của gen OsHKT1;5. Mục tiêu rút ngắn 50% thời gian sàng lọc con lai ở giai đoạn mạ trong vòng 12 đến 18 tháng tới. Cơ quan chủ trì thực hiện: Viện Di truyền Nông nghiệp và Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
2. Lai chuyển gen và cải tạo giống lúa thuần: Triển khai chương trình lai hồi giao (backcross) có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MABS) để chuyển allele OsHKT1;5 ưu việt từ các nguồn gen bản địa (Pokkali, Chăm biển) sang các giống lúa thuần chất lượng cao như Bắc Thơm số 7, BT7 hoặc Jasmine 85. Mục tiêu nâng ngưỡng chịu mặn của các giống lúa thương phẩm lên 4‰ đến 6‰ (tương đương 6 - 9 dS/m) trong giai đoạn 3 đến 5 năm. Cơ quan thực hiện: Các Viện Nghiên cứu Lúa Đồng bằng sông Cửu Long và Sở Nông nghiệp & PTNT các tỉnh ven biển.
3. Ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9: Tối ưu hóa cấu trúc promoter của gen OsHKT1;5 trên các giống lúa năng suất cao bằng cách chèn thêm các yếu tố cis-element đáp ứng stress mặn (như ABRE, GT1-motif) nhằm nâng cao mức độ biểu hiện gen lên trên 200% khi cây gặp nồng độ mặn 100 mM NaCl, lộ trình thực hiện từ năm 2026 đến 2030. Cơ quan thực hiện: Các phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học quốc gia.
4. Bảo tồn và số hóa nguồn gen lúa bản địa: Tiến hành giải trình tự mở rộng toàn bộ họ gen HKT trên 50 đến 100 giống lúa địa phương thu thập từ các vùng đất mặn Duyên hải miền Trung và Nam Bộ trong thời gian 24 tháng, nhằm xây dựng ngân hàng dữ liệu số phục vụ lưu trữ tài nguyên di truyền quý hiếm. Cơ quan thực hiện: Trung tâm Tài nguyên Thực vật phối hợp với Đại học Quốc gia Hà Nội.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn thạc sĩ mang giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn sâu rộng, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình thiết kế mồi PCR kích thước lớn (1,5 - 2,0 kb), phương pháp phân tích tin sinh học với PlantCARE, Phyre2, và kỹ thuật định lượng biểu hiện gen tương đối $2^{-\Delta\Delta Ct}$ trên hệ thống Real-time PCR.
2. Chuyên gia chọn tạo giống tại các viện nghiên cứu nông nghiệp: Sử dụng dữ liệu đa hình 25 vị trí promoter và 12 vị trí CDS để xây dựng quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS), giúp rút ngắn chu kỳ chọn lọc cá thể chịu mặn từ 6 thế hệ xuống còn 3 thế hệ lai.
3. Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối Nông - Lâm - Sinh: Ứng dụng luận văn làm học liệu chuyên đề cho các học phần Sinh học phân tử thực vật, Di truyền số lượng và Cơ chế thích ứng stress môi trường của cây trồng.
4. Cán bộ quản lý nông nghiệp và khuyến nông tại các vùng ven biển: Nắm bắt cơ sở khoa học về khả năng chống chịu của các giống lúa địa phương (như Chăm biển, Chiêm rong) để xây dựng phương án cơ cấu mùa vụ và quy hoạch vùng canh tác lúa - tôm thích ứng tình trạng xâm nhập mặn ngày càng gia tăng.

Câu hỏi thường gặp

1. Gen OsHKT1;5 đóng vai trò cốt lõi nào trong khả năng chịu mặn của cây lúa?
Gen OsHKT1;5 mã hóa protein vận chuyển chọn lọc ion Na+ định vị tại tế bào nhu mô quanh mạch xylem. Khi nồng độ muối tăng cao, protein này chủ động dỡ bỏ Na+ khỏi dòng nhựa rễ vận chuyển lên thân, hạn chế tối đa sự tích lũy Na+ độc hại ở phiến lá quang hợp và bảo vệ quá trình tổng hợp chất hữu cơ của cây.

2. Tại sao nghiên cứu cần phân tích đồng thời cả vùng promoter và vùng CDS của gen?
Vùng promoter chứa các yếu tố điều hòa phiên mã (cis-elements) quyết định thời điểm và cường độ gen được kích hoạt khi gặp mặn, trong khi vùng CDS quy định cấu trúc và hoạt tính vận chuyển của chuỗi polypeptide. Việc khảo sát cả hai vùng giúp giải thích toàn diện vì sao giống Pokkali vừa có mức biểu hiện gen cao hơn, vừa sở hữu kênh protein vận chuyển Na+ hiệu quả hơn giống Nipponbare.

3. Nghiên cứu sử dụng những nồng độ mặn và thời gian nào để đánh giá biểu hiện gen?
Thí nghiệm thủy canh tiến hành khảo sát tại 2 ngưỡng mặn 50 mM và 100 mM NaCl (so với đối chứng 0 mM) ở 7 mốc thời gian gồm: 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 7 ngày sau xử lý. Thiết kế này phản ánh chính xác đáp ứng phiên mã của cây lúa từ giai đoạn sốc mặn ban đầu đến giai đoạn thích nghi sinh lý kéo dài.

4. Đa hình nucleotide vùng mã hóa dẫn đến những thay đổi cụ thể nào trên protein OsHKT1;5?
Nghiên cứu đã tìm ra 12 điểm đột biến nucleotide trên vùng CDS, dẫn đến 6 biến đổi axit amin có nghĩa trong cấu trúc chuỗi polypeptide. Phân tích mô hình Phyre2 chỉ ra rằng các vị trí biến dị này phân bố gần lỗ lọc ion, trực tiếp làm thay đổi tính chọn lọc và tốc độ vận chuyển Na+ giữa các nhóm giống lúa.

5. Kỹ thuật Real-time PCR với phương pháp 2-ΔΔCt mang lại ưu thế gì trong định lượng biểu hiện gen?
Phương pháp $2^{-\Delta\Delta Ct}$ cho phép định lượng mức độ tăng/giảm phiên mã của gen đích OsHKT1;5 một cách tương đối thông qua việc chuẩn hóa với gen tham chiếu nội sinh Actin1. Kỹ thuật này đạt độ nhạy cao, phát hiện được sự thay đổi lượng bản sao mRNA ngay từ 1 giờ sau xử lý mặn mà không cần xây dựng đường chuẩn tuyệt đối phức tạp.

Kết luận

• Luận văn đã phân tích thành công cấu trúc phân tử gen OsHKT1;5 trên 22 giống lúa, xác định 25 vị trí đa hình trên promoter (19 thay thế, 6 mất đoạn) và 12 vị trí đa hình trên vùng mã hóa CDS.
• Phát hiện 6 đột biến thay thế axit amin có nghĩa làm thay đổi cấu trúc không gian của protein vận chuyển ion OsHKT1;5 giữa các nhóm giống chịu mặn và mẫn cảm.
• Chứng minh các đột biến vùng promoter làm thay đổi các yếu tố cis then chốt (TATA-box, CAAT-box), giải thích cơ chế giống kháng Pokkali tăng sinh transcript OsHKT1;5 nhanh gấp 3 đến 5 lần so với giống nhiễm Nipponbare dưới áp lực 100 mM NaCl.
• Định hình hệ thống 3 cặp mồi đặc hiệu đạt độ chính xác cao, tạo tiền đề vững chắc cho việc thiết kế bộ chỉ thị phân tử chức năng phục vụ chọn tạo giống lúa kháng mặn.
• Trong kế hoạch 12 đến 24 tháng tới, cần mở rộng đánh giá kiểu hình chịu mặn trên đồng ruộng và tiến hành thử nghiệm chỉ thị phân tử trên quy mô hơn 50 giống lúa bản địa nhằm đẩy nhanh tiến độ thương mại hóa giống lúa thích ứng biến đổi khí hậu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, dưới tác động của biến đổi khí hậu, vấn đề đất nhiễm mặn ngày càng trầm trọng hơn, đặc biệt là các khu vực ven biển. Đất nhiễm mặn gây ảnh hưởng xấu tới sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại cây trồng. Lúa là cây lương thực chủ yếu và quan trọng nhất đối với người dân Việt Nam. Lúa là loài cây trồng mẫn cảm với các tác động đến từ bên ngoài (điều kiện ngoại cảnh).

Hàng năm, thiệt hại về lương thực do thiên tai, ngoại cảnh bất lợi là không hề nhỏ. Đây cũng được xem là những yếu tố chính làm giảm năng suất lúa. Do vậy, việc lựa chọn và chọn tạo giống cây lúa thích nghi với điều kiện mặn là cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, cũng như sự tăng trưởng của kinh tế Việt Nam. Từ lâu, ngoài việc lựa chọn lúa có năng suất cao dựa vào đặc điểm hình thái của cây, việc lựa chọn lúa có kiểu gen chống chịu với ngoại cảnh bất lợi ngày càng được quan tâm nghiên cứu.

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng nhiều vào việc sàng lọc, lai tạo, nhân dòng gen có tính chống chịu cao. Để tạo ra các giống cây trồng chịu mặn thì việc nghiên cứu các gene quy định các tính trạng chống chịu mặn là hết sức quạn trọng, đặc biệt là các gene mã hóa cho các kênh vận chuyển ion Na+, K+ như họ gene HKT. Trong đó, gene OsHKT1;5 là một gene quan trọng tham gia vào quá trình cân bằng ion của tế bào trong quá trình chống chịu mặn ở cây lúa. Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về gen OsHKT1;5 ở cây lúa được tiến hành ở Việt Nam.

Vì những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân tích tính đa hình v mức đ biểu hiện của gen OsHKT1;5 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở cây lúa (Oryza sativa)” với mục đích: 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ - Phân tích đa hình gen OsHKT1;5 ở một số giống lúa có khả năng chịu mặn khác nhau. - Nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 đáp ứng với điều kiện mặn ở lúa. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Đất nhiễm mặn và ảnh hƣởng đến năng suất cây trồng 1. Giới thiệu về đất nhiễm mặn Đất mặn là đất có chứa nhiều muối hòa tan như là: NaCl, Na2SO4, CaCl2, CaSO4, MgCl2, NaHCO3… Nguồn gốc của những loại muối này rất khác nhau (nguồn gốc lục địa, biển hay nguồn gốc từ sinh vật,… ), nhưng nguồn gốc ban đầu của những loại muối này đều xuất phát từ các thành phần khoáng của đá núi lửa. Những loại muối này có nguồn gốc từ muối hòa tan trong quá trình phong hóa đá, chúng di chuyển tập trung ở những dạng địa hình trũng không thoát nước, kết hợp với các yếu tố như đá mẹ, khí hậu khô hạn, mực nước mặn nông và sinh vật ưa muối,… hình thành lên đất mặn [2]. Ở Đồng bằng Sông Cửu Long, cũng như các vùng đất bằng phẳng ven biển khác ở nước ta, đất mặn là loại đất khá phổ biến.

Quá trình đất bị mặn hóa có liên quan chặt chẽ với vị trí địa lý, địa hình, tác động các của dòng chảy, sự hình thành sự xâm lấn, mức độ mặn của nước biển và các hoạt động sản xuất của con người. Ở Việt Nam, đất mặn được hình thành do nước biển dâng lên bởi thủy triều hoặc do nước mặn từ các dòng chảy ngầm di chuyển lên mặt đất, một nguyên nhân khác của sự mặn hóa là vấn đề sử dụng nước mặn từ các kênh tiêu dẫn vào đồng ruộng khi thiếu nước ngọt. Ở một số vùng Việt Nam, có các dòng nước mặn ngầm rất gần với mặt đất, trong canh tác cây trồng cạn sự bốc hơi cũng là nguyên nhân kéo nước mặn lên làm nhiễm mặn đất tầng mặt [2]. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam Việt Nam là nước có bờ biển dài 3.

Hiện nay, dưới tác động của biến đổi khí hậu, băng tan, mực nước biển dâng cao, làm vấn đề mặn hóa có nguy cơ trầm trọng hơn. Theo công bố của Bộ Tài nguyên và Môi trường năm 2012 thì Việt Nam là 1 trong 5 nước trên thế giới chịu ảnh hưởng nặng nề nhất của biến đổi khí hậu. Chỉ tính riêng mực nước biển nếu dâng 75 cm đã làm cho 19% diện tích khu vực Đồng bằng sông Cửu Long bị ngập. Nếu nước biển 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ dâng 1m vào năm 2100, sẽ làm ngập gần 38% diện tích khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.

Theo Hồ Quang Đức (2010) cả nước có khoảng trên 1 triệu ha đất mặn, chủ yếu ở các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, ngoài ra có một ít đất mặn nội địa phân bố ở Binh Thuận và Bình Thuận, gọi là đất mặn kiềm [2]. Ảnh hưởng của mặn tới năng suất, chất lượng cây lúa Diện tích gieo trồng những năm gần đây có xu hướng giảm, do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu (hạn hán, nhiễm mặn), do chuyển đổi mục đích sử dụng đất, chuyển đổi cơ cấu cây trồng. Theo báo cáo số 152/BC-TCTK ngày 28/6/2017 của Tổng cục Thống kê, tính riêng vụ đông xuân 2017, hai vùng có diện tích đất lúa giảm nhiều nhất là vùng Đồng bằng sông Hồng và Đồng bằng sông Cửu Long vốn được coi là hai vựa lúa của cả nước. Tại vùng Đồng bằng sông Hồng, diện tích gieo trồng lúa đông xuân 2017 đạt 536,2 nghìn ha, giảm 10,1 nghìn ha, bằng 98,2% so vùng kỳ năm trước.

Trong đó có đến 1,9 nghìn ha là diện tích bỏ hoang, ô nhiễm. Tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, diện tích xuống giống lúa đông xuân năm nay đạt 1.539,4 nghìn ha, giảm 16,3 nghìn ha, bằng 99,0% so cùng kỳ; diện tích không sản xuất (bỏ hoang, ô nhiễm,.) là 1,4 nghìn ha [1]. Nguyên nhân chủ yếu của việc giảm diện tích trồng lúa là do biến đổi khí hậu, chuyển đổi mục đích sử dụng đất, trong đó là nhiễm mặn được coi là một tác hại trực tiếp do biến đổi khí hậu gây ra. Cơ chế tác đ ng của đất nhiễm mặn đến cây trồng Việc dư thừa muối trong đất đã làm tăng áp suất thẩm thấu của các dung dịch trong đất.

Ở điều kiện nồng độ muối tan trong đất nhỏ hơn nồng độ dịch tế bào trong rễ, cây có thể dễ dàng lấy được nước và chất khoáng từ đất do áp suất thẩm thấu và sức hút nước của rễ cây lớn hơn áp suất thẩm thấu và sức hút nước của đất. Nếu nồng độ muối tan trong đất tăng cao dẫn đến mức sức hút nước của đất cao hơn sức hút nước của rễ thì chẳng những cây không lấy được nước trong đất mà còn mất nước vào đất. Do đó, cây không hấp thu được lượng nước cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển, nhưng quá trình thoát hơi nước của lá vẫn diễn ra bình thường làm mất cân bằng nước gây nên hạn sinh lý. Vì vậy, việc tăng 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ nồng độ muối hòa tan trong đất quá mức là nguyên nhân quan trọng nhất gây hại cho cây trồng trên đất mặn.

Các đáp ứng sinh lý ở các loại cây khác nhau là khác nhau, dẫn đến khả năng chịu mặn khác nhau của một số loại cây trồng. Dưới đây là bảng trình bày khả năng chịu mặn của một số loại cây trồng theo nồng độ muối. Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng [46] Ngƣỡng chịu mặn STT Cây trồng Tên khoa học EC Nồng đ (dS/m) muối tan (‰) 1 Bắp Zea mays L. 1,7 1,088 2 Đậu phộng Arachis hypogaea L.

3,0 1,92 4 Đậu nành Glycine max (L.) Merrrill 5,0 3,2 5 Củ cải đường Vulgaris Beta L. (Capitata Group) 1,8 1,152 8 Cà rốt Daucus carota L. 1,0 0,64 9 Đậu đũa Vigna unguiculata (L. 4,9 3,136 10 Dưa leo Cucumis sativus L.

2,5 1,6 Solanum 11 Cà tím 1,1 0,704 melongena L. 12 Tỏi Allium sativum L. 4,9 3,136 14 Khoai lang Ipomoea batatas (L.) 15 Cà chua Karst.] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 16 Nho Vitis Vinifera L. 1,5 0,96 17 Bưởi Citrus x paradisi Macfady.

1,2 0,768 18 Ổi Psidium guajava L. 4,7 3,008 19 Cam Citrus sinensis (L.) Osbeck 1,3 0,832 Chống chịu mặn ở thực vật là cơ chế được điều khiển bởi nhiều yếu tố. Đối với những loài nhạy cảm với độ mặn như Arabidopsis thaliana và Oryza sativa, ức chế sinh trưởng thường xảy ra ở nồng độ 100 mM NaCl, trong khi loài Atriplex amnicola có thể phát triển ở 600 mM NaCl [48]. Thực vật có nhiều cách khác nhau để thích ứng với stress mặn.

Khi tiếp xúc với điều kiện stress mặn, cây thường biểu hiện kiểu hình già yếu như cháy xém lá. Một số phản ứng bên trong như giảm sự thoát hơi nước ở các lá bị cháy xém, chuyển hướng các nguồn năng lượng và dinh dưỡng đến cho lá non, đỉnh sinh trưởng và bảo vệ các cơ quan quan trọng bởi sự tích lũy các ion gây độc trong các lá già yếu [12]. Khả năng chịu mặn trong nhiều thực vật tỷ lệ nghịch với mức độ tích lũy Na+ trong thân, đặc biệt là ở các cây lương thực như lúa mì và gạo, là những cây có khả năng chịu mặn kém [60]. Có rất nhiều yếu tố dẫn đến khả năng chịu mặn khác nhau giữa các loài, trong đó các protein vận chuyển chất tan là một yếu tố đặc biệt quan trọng, điển hình như các protein vận chuyển Na+ [38; 44].

Ion Na+ được phát hiện là có sự tích lũy khác nhau giữa các loại tế bào của lá. Sự tích lũy Na+ ở các tế bào biểu bì lá do hoạt động của các kênh cation không chọn lọc, tránh gây độc cho các mô quang hợp [32]. Dựa vào cơ chế tác động của stress mặn do tích lũy/vận chuyển ion Na + nên protein tham gia vận chuyển Na+ đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa cân bằng nội môi Na+ (homeostasis). Ở thực vật, có thể nhận thấy nhóm gen tham gia mã hóa protein vận chuyển các ion Na+ bao gồm 3 họ gen chính là HKT, NHX và SOS [63].

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ Hình 1. Các con đƣờng điều hòa chống chịu stress mặn ở thực vật [64] Trong hình 1.