MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết và lí do của đề tài Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế IARC [49] đã xếp một số chất màu tổng hợp vào nhóm các chất có thể gây ung thư như: các chất Sudan, Auramine O, Rhodamine B, Ponceau 3R,… Những chất màu này có ưu điểm rẻ tiền, bắt màu chuẩn và lên màu nhanh, bền màu, nhưng chúng là những chất độc có khả năng gây bệnh cho người. Thực tế đã có nhiều sản phẩm thực phẩm trên thị trường bị phát hiện sử dụng phẩm màu không được phép dùng cho thực phẩm [17, 34, 57,66]. Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - phẩm màu QCVN 4-10:2010/BYT [4] và Thông tư số 21/2019/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về “Hướng dẫn một số điều của luật chăn nuôi về Thức ăn chăn nuôi”, có quy định rõ tại phụ lục V: Cấm sử dụng Auramine O (AO) và các dẫn xuất của Auramine O trong thức ăn chăn nuôi [3], như vậy AO là chất không được phép có mặt trong thực phẩm tại Việt Nam.
Mặt khác thông tư 24/2019/TT-BYT ban hành ngày 30 tháng 8 năm 2019 quy định có 57 chất màu được phép sử dụng trong thực phẩm không bao gồm các Sudan và AO. Do đó, một phương pháp phát hiện AO và các chất Sudan ở lượng siêu vết trong thực phẩm là rất cần thiết. Trong các hợp chất Sudan, thì Sudan I và Sudan II có màu đỏ sáng đẹp mắt, được sử dụng khá phổ biến trong thực phẩm hơn Sudan III và Sudan do đó đề tài chọn hướng nghiên cứu hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm. Chuẩn bị mẫu giả 49 2.
Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC 52 2. Nghiên cứu các điều kiện chiết 55 2. Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ tối ưu 59 2. Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp 65 2.
Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu 66 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3-A – ĐỐI VỚI AURAMINE O 73 Hiện nay, Việt Nam mới chỉ có duy nhất một phương pháp được chứng nhận để xác định Auramine O trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12267:2018 về “Thực phẩm - xác định hàm lượng Auramine - phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)”[1], chưa có phương pháp được chứng nhận để xác định các Sudan trong thực phẩm. TCVN 12267:2018 đã áp dụng một quy trình duy nhất chiết tách AO từ các nền mẫu thực phẩm khác nhau bằng dung môi hữu cơ, điều này có thể dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp và độ chính xác chưa cao do các mẫu thực phẩm khác nhau có nền mẫu phức tạp không giống nhau, đồng thời LC-MS/MS là hệ thống thiết bị phức tạp đắt tiền, không phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp HPLC là có thể định lượng đồng thời các chất màu tương tự nhau, phương pháp phân tích và vận hành đơn giản, thiết bị sử dụng phổ biến, tuy nhiên khi phân tích HPLC cần phải xử lý làm sạch ảnh hưởng của nền mẫu. Việc sử dụng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) để hấp phụ chất màu Rhodamine B và Xanh metylen trong dung dịch nước đã được nghiên cứu trên thế giới [20,63], ưu điểm của việc sử dụng RHNS so với kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) ở nguồn nguyên liệu nông nghiệp rẻ tiền là trấu, các bước thực nghiệm đơn giản không cần thiết bị phức tạp, sử dụng chính dung môi pha động HPLC để rửa giải chất màu cho hiệu suất hấp phụ- rửa giải cao.
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến hành hấp phụ chất màu AO và Sudan từ dịch chiết mẫu thực phẩm. Nhằm tìm kiếm giải pháp chiết, tách phù hợp với từng nền mẫu thực phẩm khác nhau, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng chất màu nhân 2. Chuẩn bị mẫu giả 49 2. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC 52 2.
Nghiên cứu các điều kiện chiết 55 2. Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ tối ưu 59 2. Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp 65 2. Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu 66 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3-A – ĐỐI VỚI AURAMINE O 73 tạo độc hại bằng hệ thống thiết bị đơn giản, phù hợp với các điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu”.
Mục đích và nội dung chính của luận án Mục đích của luận án: ❖ Xây dựng quy trình phân tích Auramine O trong mẫu thực phẩm: măng, miến, dưa, phấn hoa, cá khô, mì tôm. ❖ Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm thịt khô và bim bim. Nội dung nghiên cứu chính của luận án: ❖ Đối với Auramine O: o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định Auramine O bằng phương pháp HPLC. o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Auramine O từ mẫu thực phẩm phòng thí nghiệm.
o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của Auramine O trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (kí hiệu RHNS). o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Auramine O trong mẫu thực tế. Chuẩn bị mẫu giả 49 2. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC 52 2.
Nghiên cứu các điều kiện chiết 55 2. Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ tối ưu 59 2. Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp 65 2. Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu 66 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3-A – ĐỐI VỚI AURAMINE O 73 ❖ Đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II: o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định đồng thời Sudan I và Sudan II bằng phương pháp HPLC.
o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Sudan I và Sudan II từ mẫu thực phẩm phòng thí nghiệm. o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của của hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu. o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Sudan I và Sudan II trong mẫu thực tế. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu Đối tượng, phạm vi nghiên cứu - Các chất màu Sudan I, Sudan II trong các mẫu thực phẩm: mẫu thịt khô, mẫu bim bim.
- Chất màu Auramine O trong các mẫu: măng, miến, phấn hoa, dưa chua, cá khô, mì tôm. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chiết lỏng – lỏng mẫu thực phẩm bằng dung môi hữu cơ. - Phương pháp hấp phụ chất màu trên nanosilica. - Phương pháp phân tích HPLC định lượng chất màu, sử dụng detector mảng Diode Array (PDA).
Chuẩn bị mẫu giả 49 2. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC 52 2. Nghiên cứu các điều kiện chiết 55 2. Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ tối ưu 59 2.
Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp 65 2. Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu 66 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3-A – ĐỐI VỚI AURAMINE O 73 - Phương pháp phổ hấp phụ phân tử UV-Vis để xác định các bước sóng hấp phụ cực đại của các dung dịch chất màu. Luận án sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại để đánh giá xác định các đặc trưng của vật liệu hấp phụ: phổ FTIR, SEM, EDX, BET,… Sử dụng các phương pháp thống kê để xử lý kết quả, đánh giá số liệu thực nghiệm. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án - Việc kiểm tra chất màu cấm sử dụng trong thực phẩm với các mẫu ngẫu nhiên tại các phòng thí nghiệm nhỏ ở Việt Nam là ít khả thi, chính vì vậy với mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đơn giản RP-HPLC để đánh giá hàm lượng AO, Sudan I và Sudan II trong một số mẫu thực phẩm trên thị trường là có ý nghĩa lớn.
- Luận án đã đưa ra quy trình chung để phân tích các chất màu (Auramine O và hỗn hợp Sudan I, Sudan II) trong các mẫu thực phẩm. Quy trình gồm 2 giai đoạn chính là xử lý mẫu và phân tích định lượng mẫu bằng phương pháp HPLC. Giai đoạn xử lý mẫu được thực hiện theo 2 cách với các loại mẫu khác nhau. Cách 1: Chiết bằng dung môi hữu cơ.
Cách 2: Chiết bằng dung môi hữu cơ - Hấp phụ chất màu trong dịch chiết bằng Nanosilia chế tạo từ vỏ trấu - Giải hấp phụ bằng pha động trong phân tích HPLC. Đây là quy trình phân tích chất màu trong thực phẩm chưa được đề xuất trước đó trong bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào. Chuẩn bị mẫu giả 49 2. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC 52 2.
Nghiên cứu các điều kiện chiết 55 2. Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ tối ưu 59 2. Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp 65 2. Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu 66 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3-A – ĐỐI VỚI AURAMINE O 73 - Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ được đánh giá là phương pháp nhanh, đơn giản dễ thực hiện và chi phí thấp.
Một điểm ý nghĩa của luận án là đưa ra phương pháp chiết các chất màu bằng dung môi ethanol (chiết auramine O bằng hỗn hợp ethanol: nước (v/v 70:30, chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II bằng ethanol tuyệt đối). Với lượng mẫu, thể tích dịch chiết, số lần chiết, nhiệt độ, thời gian chiết phù hợp, sử dụng dung môi chiết chứa dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao đối với nhiều loại mẫu thực phẩm (trên 90%) mà vẫn đảm bảo được yếu tố: không độc hại với người phân tích và môi trường, chi phí thấp, các bước thực hiện đơn giản và có thể áp dụng chiết được nhiều loại mẫu. - Sử dụng Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu để hấp phụ chất màu từ dịch chiết mẫu thực phẩm cũng là một điểm mới của luận án. Đây cũng là một bước quan trọng trong xử lý mẫu hướng tới "quy trình xanh".
Việc sử dụng nanosilia hấp phụ các Sudan ở điểm đẳng điện trong khi Sudan có tính kỵ nước là một nghiên cứu chưa được đề xuất trước đó (các nghiên cứu hấp phụ chất màu bằng RHNS chỉ tập trung vào chất màu ưa nước như Methylene Blue, Rhodamine B,.