Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam

Luận văn thạc sĩ trình bày kết quả nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái, sinh học phân tử.

• Tác giả: Đinh Đức Hiền
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Nấm Men Moniliella

Nấm men Moniliella là một chi nấm men đen quan trọng trong lĩnh vực vi sinh vật học. Luận văn thạc sĩ của Đinh Đức Hiền từ Đại học Quốc gia Hà Nội tập trung vào phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam. Chi Moniliella được biểu hiện bởi các đặc điểm hình thái độc đặc và khả năng sản sinh chlamydospore. Nghiên cứu này nhằm xác định các loài nấm men đen Moniliella từ các mẫu hoa phân lập được tại các địa điểm khác nhau trên toàn Việt Nam. Công trình khoa học này có ý nghĩa quan trọng trong việc bổ sung kiến thức về đa dạng vi sinh vật của nước ta và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

1.1. Đặc điểm Hình Thái và Phân Loại

Nấm men Moniliella có các tế bào đặc trưng với hình dạng elip hoặc hình trụ. Các chủng được phân lập có khả năng sinh trưởng trên nhiều loại môi trường khác nhau như YM agar và Malt-Glucose agar. Phân loại nấm men này dựa trên các đặc điểm hình thái như màu sắc khuẩn lạc, khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau và khả năng đồng hóa các nguồn nitơ.

1.2. Ý Nghĩa Của Nghiên Cứu

Luận văn phân loại nấm men Moniliella tại Việt Nam cung cấp những dữ liệu quan trọng về đa dạng sinh học của các chủng nấm men đen. Nghiên cứu này giúp phát hiện các loài mới và góp phần vào kho tàng kiến thức khoa học của đất nước trong lĩnh vực vi sinh vật học và công nghiệp thực phẩm.

II. Phương Pháp Nghiên Cứu và Thu Thập Mẫu

Nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella sử dụng nhiều phương pháp phân loại hiện đại kết hợp các kỹ thuật truyền thống và sinh học phân tử. Các mẫu được thu thập từ các địa điểm khác nhau tại Việt Nam, chủ yếu từ các mẫu hoa. Tổng cộng 126 chủng nấm men Moniliella được phân lập và phân tích. Phương pháp PCR fingerprinting với mồi GAC5 được sử dụng để phân biệt và xác định các chủng khác nhau. Ngoài ra, các phép thử sinh hóa và khả năng chuyển hóa các nguồn dinh dưỡng cũng được thực hiện để đặc trưng hóa mỗi chủng.

2.1. Kỹ Thuật Phân Tích Sinh Học Phân Tử

Phương pháp PCR fingerprinting là một công cụ quan trọng trong phân loại nấm men hiện đại. Phương pháp này giúp tạo ra các phổ DNA đặc trưng cho mỗi chủng, từ đó phân biệt các loài Moniliella carnis, M. dehoogii và M. byzovii. Kỹ thuật RFLP cũng được ứng dụng để phân tích tính đa hình của DNA.

2.2. Môi Trường Nuôi Cấy và Điều Kiện Thực Nghiệm

Các chủng được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau như YM agar, Malt-Glucose agar và Dalmau tinh bột ngô agar. Các điều kiện nuôi cấy bao gồm nhiệt độ 25-28°C, thời gian 5-7 ngày. Các môi trường đặc biệt được sử dụng để kiểm tra khả năng sinh trưởng trong điều kiện nồng độ đường và muối cao.

III. Kết Quả Phân Loại và Các Loài Moniliella Phát Hiện

Từ 126 chủng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam, nghiên cứu đã xác định được ba loài chính: Moniliella carnis, M. dehoogii và loài mới M. byzovii. Mỗi loài có những đặc điểm riêng biệt được xác định thông qua phân loại hình thái và phân tích DNA. Các chủng đại diện được lựa chọn để mô tả chi tiết, bao gồm cả khả năng sinh sản hữu tính. Phổ PCR fingerprinting cho thấy sự phân biệt rõ ràng giữa các loài này. Công trình này cũng so sánh các chủng phân lập được tại Việt Nam với các chủng từ các quốc gia khác để xác định vị trí trong cây phả hệ toàn cầu.

3.1. Moniliella carnis và M. dehoogii

M. carnis và M. dehoogii là hai loài đã biết được phân lập thành công. M. carnis (chủng KFP 246T) được mô tả chi tiết với các tế bào sinh dưỡng trên YM agar. M. dehoogii (chủng KFP 211T) có những đặc điểm riêng biệt trong hình thái khuẩn lạc. Cây phả hệ cho thấy mối quan hệ giữa hai loài này và các loài nấm men khác.

3.2. Loài Mới Moniliella byzovii

M. byzovii là một loài nấm men mới được phát hiện và mô tả trong luận văn này. Chủng TBY 2041.7T và TBY 2041.8 là những đại diện của loài này. M. byzovii có khả năng hình thành chlamydospore trên môi trường Yeast Cacbon Base agar. Loài này có sự khác nhau rõ ràng về đặc tính so với các loài Moniliella đã biết khác.

IV. Ứng Dụng và Ý Nghĩa Khoa Học

Luận văn phân loại nấm men Moniliella có nhiều ứng dụng thực tiễn quan trọng. Các chủng nấm men được phân lập có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và các nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật. Công trình này góp phần phổ biến kiến thức về vi sinh vật học và phân loại trong cộng đồng khoa học Việt Nam. Sự xác định được các loài mới như M. byzovii mở ra những hướng nghiên cứu mới về tính chất sinh học và ứng dụng tiềm năng của chúng. Kho tàng chủng vi sinh vật được lưu giữ sẽ là nguồn tài nguyên quý báu cho các nghiên cứu tương lai.

4.1. Ứng Dụng Trong Công Nghiệp Thực Phẩm

Nấm men Moniliella có ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp thực phẩm nhờ khả năng sản xuất các hợp chất thơm như các chất volatile. Các chủng phân lập được có thể được đánh giá để phát triển các sản phẩm lên men hoặc bảo quản thực phẩm. Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp đã hỗ trợ lưu giữ các chủng này để phục vụ cho nghiên cứu và phát triển.

4.2. Đóng Góp Cho Kho Tàng Đa Dạng Vi Sinh Vật

Nghiên cứu này bổ sung thêm những chủng nấm men Moniliella vào kho tàng giống vi sinh vật của Việt Nam. Việc phân loại và mô tả chi tiết các loài giúp nâng cao hiểu biết về đa dạng sinh học của đất nước. Các chủng chuẩn (type strain) được gửi đến các cơ sở lưu trữ quốc tế để chia sẻ kiến thức khoa học toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí phân loại cho 2 loài mới tìm đƣợc khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella tomentosa. Năm 2009, căn cứ vào sự tƣơng đồng nhất định về di truyền cũng nhƣ một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác là Trichosporonoides vào Moniliella. Nhƣ vậy, trƣớc khi nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M. Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chƣa rõ ràng.

Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata, một thành viên của Agaricomycotina. Với những trình tự khác, Moniliella thuộc Ustilagionomycotina. Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2. Do vậy việc tìm kiếm những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của Moniliella.

Moniliella đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đƣờng chức năng có giá trị thƣơng mại cao. Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chƣa đƣợc biết tới của Moniliella nhƣ khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone (tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại kháng sinh (zymocin) mới. Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này đƣợc thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam. - Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc bằng hình thái; PCR fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ.

- Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài, phân bố. K20 – Vi sinh vật 1 Đinh Đức Luận văn thạc Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1. Nhóm nấm men đen Nấm men đen đƣợc phát hiện từ khoảng đầu thế kỷ 20 nhƣng khi đó ngƣời ta mới chỉ biết đến một vài chi trong số chúng. Nấm men đen sinh sản vô tính là chủ yếu, bằng nảy chổi, tạo sợi hay mô phân sinh.

Điều tạo nên sự khác biệt giữa chúng và các nhóm nấm men khác là chúng có melanin trong thành tế bào làm cho khuẩn lạc có thể có màu vàng lục, màu ô liu đến nâu sẫm, đen. Ngoài ra, nấm men đen còn chứa carotenoid và mycosporines. Một trong các lý do khiến những hiểu biết về nấm men đen kém xa so với các vi sinh vật khác có lẽ là do sự sinh trƣởng chậm, khả năng cạnh tranh thấp với loài khác nên dễ bị bỏ qua trong các nghiên cứu, thêm nữa cấu trúc bào tử đính của chúng lại ít đặc điểm phân biệt, trong khi hiện tƣợng đa hình thái của cùng một chủng lại khá phổ biến và gây khó khăn trong quá trình phân loại [9]. Một số chi nấm men đen 1.

Chi Phaeococcomyces Gồm 3 loài đã đƣợc công nhận là: P.nigricans Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc sinh trƣởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp nhăn, màu đen. Tế bào dạng hình cầu đến elip. Bào tử đính chuyển từ không màu sang nâu đậm hoặc đen [5, 7]. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650.org) K20 – Vi sinh vật 2 Đinh Đức Luận văn thạc 1.

Chi Exophiala Đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1966 bởi Carmichael với loài mới Exophiala salmonis [5]. Đến nay chi này gồm 28 loài: E. Exophiala phân bố nhiều trong đất, nƣớc, thực vật, gỗ mục,. và là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở ngƣời.

Exophiala có đặc điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể tóm tắt nhƣ sau: Chiếm ƣu thế trong môi trƣờng nuôi cấy là tế bào là dạng phân đốt, thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào, đôi khi gồm hai tế bào. Khi còn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy chồi giống nhƣ nấm men thông thƣờng, xếp thành chuỗi dài. Sau một thời gian nuôi cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt. Các đốt này có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trƣng bởi các eo thắt hẹp.

Sau đó, từ các đốt sinh ra các bào tử hình elip kích thƣớc 1-3 3-6 μm. Các bào tử này thƣờng gồm một tế bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [5, 7]. Hình ảnh tế bào của Exophiala salmonis CBS 157. Chi Aureobasidium Các loài thuộc Aureobasidium có phổ phân bố tƣơng đối rộng và đƣợc tìm thấy trong đất, xác thực vật, lá cây.

Aureobasidium gồm 14 loài trong đó A. pullulans đƣợc biết đến nhiều nhất. Về mặt hình thái, Aureobasidium tạo khuẩn lạc lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm từ 2-10 μm.

K20 – Vi sinh vật 3 Đinh Đức Luận văn thạc Không phát hiện thấy cuống bào tử đính. Aureobasidium sinh sản vô tính với bào tử đơn bào, kích thƣớc 2-3 4-6 µm, không màu, hình bầu dục đến hình trụ, tập trung thành từng đám. Các bào tử này sau đó tiếp tục sinh sản bằng nảy chồi hoặc hình thành túi bào tử thứ cấp [7]. Hình ảnh tế bào chủng Aureobasidium pullulans (Nguồn www.

Chi Moniliella Sau khi chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi Stolk & Dakin (1966) cho hai loài mới là M. Tiếp theo hai loài Moniliella suaveolens và Moniliella mellis, đã đƣợc miêu tả bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975), đến năm 1984, de Hoog miêu tả một loài mới là M. Chi Trichosporonoides đƣợc coi là tƣơng tự nhƣ chi Moniliella, khác biệt chủ yếu bởi kích thƣớc khuẩn lạc và tế bào nhỏ hơn [8]. Trong các nghiên cứu sau đó, cho thấy hai chi này tƣơng đồng với nhau [8].

Năm 2009, Rosa và cộng sự đã xác định các giả thuyết này bằng so sánh trình tự vùng D1/D2 của rDNA 26S và đi đến kết luận Moniliella và Trichosporonoides đƣợc xếp vào cùng một chi, loài M. pollinis có trình tự vùng D1/D2 giống với Trichosporonoide madida, chỉ khác nhau bởi tỉ lệ G+C tƣơng ứng là 50.2, do đó hai loài này thống nhất tên là M. pollinis đƣợc mô tả khác với M. tomemtosa về hình thái và mức độ chuyển hóa tạo erythritol, nhƣng về trình tự D1/D2 cho thấy chúng tƣơng đồng nhau.

Nhƣ vậy cho đến trƣớc nghiên cứu này chi Moniliella gồm 9 loài nhƣ sau [24]. K20 – Vi sinh vật 4 Đinh Đức Luận văn thạc Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin (1966) Moniliella fonsecae Rosa, Jindamorakot, Limtong, Nakase, Lachance, Fidalgo- Jiménez, Daniel, Pagnocca, Inácio & Morais (2008) Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance (2008) Moniliella mellis (Fabian & Quinet) V. Rao & de Hoog (1975) Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008) Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008) Moniliella pollinis (Hennebert & Verachtert) de Hoog & Guého (1984) Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008) Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx (1972) Phần lớn các loài thuộc chi Moniliella phân lập đƣợc thƣờng phân bố ở những nơi có nhiều dầu mỡ hoặc nơi có nồng độ đƣờng cao nhƣ phấn hoa, mật ong…Ví dụ, M. acetoabutens cho tới nay chỉ gặp trên các mẫu thực phẩm lên men có độ chua cao nhƣ xốt hoa quả, dƣa muối, M.

mellis từ mật ong, M. nigrescens từ jam, marmalade hỏng, M. spathulata từ sữa trâu, M. suaveolens từ sữa, bơ, phomat … M.

fonsecae phân lập từ hoa Angelonia pilosella, M. megachiliensis phân lập từ côn trùng, M. oedocephalis từ mật ong, M. pollinis từ phấn hoa.

Về mặt hình thái học, những loài thuộc chi Moniliella có khuẩn lạc màu hơi xám đến đen oliu, sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và hình thành sợi nấm và bào tử đốt. fonsecae, những loài thuộc chi Moniliella mang những đặc tính đặc biệt trong số những nấm đảm (Basidiomycetous) với khả năng chịu áp suất thẩm thấu và lên men. Moniliella có những đặc trƣng về cấu trúc nhƣ thành tế bào gồm nhiều lớp và thiếu xylose, fucose. Vách tế bào có các cấu trúc lỗ, vách ngăn (dolispores) với các kênh hẹp [20].

Moniliella phản ứng dƣơng tính với Diazonium blue. Tất cả các loài có khả năng đồng hóa nitrat và sản sinh urease. Ubiquinone isoprenologue chính đƣợc xác định trong Moniliella là Co-Q9. Sự phân nhánh các loài của chi Moniliella đƣợc nghiên cứu bởi phân tích trình tự vùng D1/D2 của gen LSU rRNA, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các loài là cao.

Trong đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA, các loài có thể sai khác nhau đến K20 – Vi sinh vật 5 Đinh Đức Luận văn thạc 15% thậm chí là hơn [22]. Di truyền không đồng nhất trong chi cũng đƣợc thể hiện qua hơn 16% sai khác về tỷ lệ G+C trong DNA [4]. Mặc dù các loài thuộc chi Moniliella biểu hiện một số hóa phân loại và siêu cấu trúc giống những loài thuộc ngành Ustilaginomycotina, thế nhƣng việc sắp xếp vào bậc phân loại cao hơn là không đảm bảo bởi phân tích D1/D2 LSU rRNA hoặc các đoạn gen rRNA khác [22]. Một sự hiểu biết rõ ràng hơn về sự tiến hóa của chi sẽ đƣợc xác định dựa trên việc phát hiện ra nhiều loài mới để lấp vào các khoảng trống giữa các đơn vị phân loại đã đƣợc thiết lập.

Thêm nữa, nghiên cứu về chi Moniliella ngày càng đƣợc thúc đẩy do những đặc tính trong sinh trƣởng của chúng nhƣ ƣa lipit, chịu áp suất thẩm thấu, điều này hứa hẹn triển vọng cho các quá trình công nghệ sinh học. Thực tế, những loài thuộc chi Moniliella đang đƣợc dùng trong sản xuất erythritol thƣơng mại [23]. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella acetoabuten CBS 169.org) K20 – Vi sinh vật 6 Đinh Đức Luận văn thạc Hình 5. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella.

Phylloporia pectinata đƣợc sử dụng nhƣ nhóm ngoài. Mã số GenBank của trình tự rDNA đƣợc đƣa ra sau tên loài. Thanh chèn tƣơng ứng 5% khác biệt trình tự. So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp có thể bị nhầm lẫn với Moniliella.

Chi Đặc điểm Phân bố Khuẩn lạc mịn, sau đó bông xù, thƣờng từ Phân bố ở những nơi có màu trắng rồi chuyển dần sang màu vàng nhiều dầu mỡ hoặc Moniliella xanh, xám, đen. Sinh sản bằng phƣơng thức những nơi có áp suất này chồi hoặc phân đốt. Thành tế bào dày, có thẩm thấu cao nhƣ mật sắc tố đen. ong, phấn hoa.

Khuẩn lạc màu trắng, bột hoặc lông xù giống Moniliella nhƣng khuẩn lạc không chuyển Phân bố trong đất, nƣớc Geotrichum sang màu xám đen.