Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nghề nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) giữ vai trò quan trọng trong cơ cấu xuất khẩu thủy sản của Việt Nam, đặc biệt tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. Tại huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu, các mô hình nuôi tôm thâm canh và siêu thâm canh phát triển mạnh mẽ với mật độ thả nuôi cao (khoảng 300 - 450 con/m²). Tuy nhiên, phương thức nuôi này phát sinh lượng lớn chất thải chứa hàm lượng đạm cao từ thức ăn dư thừa, phân tôm và xác tảo. Sự tích tụ liên tục của các chất ô nhiễm nitơ vô cơ như amoniac ($NH_3/NH_4^+$), nitrite ($NO_2^-$) và nitrate ($NO_3^-$) dẫn đến suy thoái chất lượng nước ao nuôi. Trong đó, nitrite gây độc trực tiếp làm giảm tăng trưởng và gây chết tôm, còn nitrate ở nồng độ cao tích lũy vào cuối vụ nuôi gây ức chế chuyển hóa, tăng tỷ lệ tử vong ở ấu trùng và gây phú dưỡng nguồn nước khi xả thải. Trong khi các nghiên cứu chuyển hóa nitơ thành nitrate đã có nhiều ứng dụng, việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật bản địa có khả năng khử nitrate ($NO_3^-$) và nitrite ($NO_2^-$) thành khí nitơ phân tử ($N_2$) trong môi trường nước lợ/mặn vẫn còn nhiều hạn chế.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể:

  1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng khử nitrate với hiệu suất cao từ các ao nuôi tôm thẻ chân trắng.
  2. Sàng lọc định tính khả năng khử nitrate và nitrite của các chủng bằng thuốc thử Griess - Ilosvay và diphenylamine.
  3. Đánh giá định lượng hiệu suất khử nitrate và nitrite của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
  4. Đánh giá ảnh hưởng của các mức độ mặn khác nhau (25‰, 30‰, 35‰, 40‰) đến sinh trưởng và hoạt tính khử nitrate.
  5. Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA).

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn có hoạt tính khử nitrate hiện diện trong 15 mẫu bùn đáy và nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng thu thập tại huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu. Thời gian thực hiện đề tài diễn ra từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh Ứng dụng (RIBE 208), Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.


Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết về chu trình chuyển hóa nitơ sinh học trong môi trường thủy sinh, trọng tâm là quá trình khử nitrate dị hóa (denitrification). Quá trình này diễn ra qua 4 phản ứng khử liên tiếp nhờ các enzyme chuyên biệt: $NO_3^- \rightarrow NO_2^- \rightarrow NO \rightarrow N_2O \rightarrow N_2$. Quá trình khử nitrate chịu tác động trực tiếp bởi nồng độ oxy hòa tan (DO < 0,2 mg/L là tối ưu cho quá trình khử truyền thống), pH môi trường (tối ưu từ 7,5 - 9,5), nguồn carbon hữu cơ bổ sung (tỷ lệ C/N) và nhiệt độ môi trường (tối ưu từ 15 - 35 °C). Các nhóm vi khuẩn khử nitrate điển hình được tác giả tổng quan gồm có Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans, Bacillus azotoformans và Thiobacillus denitrificans.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Phân lập vi sinh vật: Sử dụng môi trường thạch khử nitrate chọn lọc (chứa 0,1 g/L $NaNO_3$ và chất chỉ thị bromothymol blue 1%) ủ kỵ khí (5% $CO_2$, 37 °C) từ 2 - 5 ngày để thu nhận các khuẩn lạc làm đổi màu chỉ thị sang xanh lam.
  • Sàng lọc định tính: Đánh giá khả năng sinh khí trong ống Durham với môi trường bổ sung 1 g/L $KNO_3$; kiểm tra sự tồn lưu của $NO_2^-$ bằng thuốc thử Griess I & II và $NO_3^-$ bằng thuốc thử diphenylamine.
  • Quan sát hình thái và thử nghiệm hóa sinh: Nhuộm Gram, thử nghiệm catalase với dung dịch $H_2O_2$ 3%, thử nghiệm oxidase với thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD) 1%.
  • Định lượng nitrate và nitrite: Định lượng $NO_3^- -N$ bằng phương pháp nitrate hóa với acid salicylic trong môi trường acid sulfuric đậm đặc, đo quang phổ ở bước sóng 410 nm (Cataldo et al., 1975); định lượng $NO_2^- -N$ bằng phương pháp trắc quang 4500-$NO_2^-$ (APHA, 2012) với thuốc thử sulfanilamide và N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride ở bước sóng 543 nm.
  • Khảo sát độ mặn: Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường LB bổ sung $NaCl$ ở các mức 25‰, 30‰, 35‰ và 40‰ cùng hàm lượng ban đầu 100 mg/L $NO_3^- -N$ và 100 mg/L $NO_2^- -N$, đo nồng độ nitơ vô cơ tồn dư và xác định mật độ tế bào qua phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU/mL) sau 24 giờ.
  • Định danh phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng dung dịch Lysis Buffer kết hợp proteinase K và phenol-chloroform-isoamyl alcohol; kiểm tra độ tinh sạch trên máy BioDrop ($1,7 < A_{260}/A_{280} < 2,0$); khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'); điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%; giải trình tự gen tại Viện Sinh học Phân tử Loci, đối soát dữ liệu trên NCBI bằng BLAST và xây dựng cây phát sinh chủng loài bằng phần mềm MEGA 11.
  • Xử lý số liệu: Phân tích phương sai (ANOVA) và xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel 365.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặt vấn đề

Chương này trình bày tính cấp thiết của việc kiểm soát ô nhiễm nitơ vô cơ trong nuôi tôm thẻ chân trắng thâm canh và siêu thâm canh. Nêu rõ tác hại của sự tích tụ nitrite và nitrate đối với sinh trưởng của tôm và cân bằng sinh thái vùng ven biển huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu. Từ đó xác định mục tiêu tổng quát, mục tiêu cụ thể và 6 nội dung nghiên cứu thực nghiệm cần tiến hành.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp hệ thống cơ sở lý luận và thực tiễn gồm:

  • Đặc điểm sinh học, phân loại học, cấu tạo hình thái và tập tính của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).
  • Hiện trạng nuôi tôm tại huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu (năm 2021 có gần 450 ha nuôi siêu thâm canh, hơn 3.519 ha nuôi thâm canh/bán thâm canh, hơn 35.410 ha nuôi quảng canh cải tiến) cùng các nguy cơ ô nhiễm nguồn nước do xả thải chưa qua xử lý.
  • Chu trình nitơ trong thủy vực tự nhiên; phân biệt cơ chế khử nitrate đồng hóa và dị hóa; chi tiết 4 giai đoạn khử nitrate thành khí nitơ.
  • Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử nitrate: oxy hòa tan, pH, nguồn carbon hữu cơ bổ sung, nhiệt độ.
  • Đặc điểm sinh học của 4 loài vi khuẩn khử nitrate tiêu biểu: Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans, Bacillus azotoformans, Thiobacillus denitrificans.
  • Tổng hợp các công trình nghiên cứu vi khuẩn khử nitơ trong và ngoài nước (các nghiên cứu của Bùi Thế Vinh, Nguyễn Thanh Nam, Võ Phương Huỳnh, Hoàng Phương Hà, Guo, Rout, He, Yan).

Chương 3. Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết thông số của 15 mẫu bùn và nước thu thập từ các xã Long Điền Tây và Điền Hải (pH dao động 7,3 - 8,5; nhiệt độ 27,0 - 28,3 °C; độ mặn 15‰ - 24,6‰). Quy định chi tiết các bước thực nghiệm: phân lập trên môi trường chọn lọc, thử nghiệm sinh khí ống Durham, định tính Griess và diphenylamine, nhuộm Gram, thử nghiệm enzyme catalase và oxidase. Thiết lập công thức tính hiệu suất khử $H = \frac{a - b}{a} \times 100%$ và công thức tính mật độ vi khuẩn CFU/mL. Mô tả chi tiết quy trình chuẩn độ gốc, dựng đường chuẩn trắc quang nitrate/nitrite, quy trình tách chiết DNA, thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt 40 chu kỳ khuếch đại gen 16S rRNA.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương 4 phân tích toàn bộ số liệu thu được từ các giai đoạn thực nghiệm:

Chỉ tiêu theo dõi Kết quả quan sát / Giá trị đo đạc
Số lượng chủng phân lập sơ bộ 32 chủng (làm đổi màu chỉ thị bromothymol blue sang xanh lam)
Chủng có hoạt tính khử hoàn toàn 02 chủng ký hiệu V9 và V15 (sinh khí ống Durham, âm tính với cả thử nghiệm Griess và diphenylamine)
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc V9 Tròn, lồi, màu xanh lục đậm, hơi nhầy, đường kính 3 mm
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc V15 Tròn, lồi, màu xanh lục nhạt, hơi nhầy, đường kính 3 mm
Đặc điểm tế bào và hóa sinh Cả 2 chủng là trực khuẩn ngắn, Gram âm, Catalase (+), Oxidase (+)
Hiệu suất khử $NO_3^- -N$ sau 24h V9 đạt 99,8% (còn 0,231 mg/L); V15 đạt 99,4% (còn 0,589 mg/L)
Hiệu suất khử $NO_3^- -N$ sau 48h Cả V9 và V15 đều đạt 100% (nồng độ còn 0,000 mg/L)
Hiệu suất khử $NO_2^- -N$ sau 24h V9 đạt 99,9% (còn 0,073 µg/mL); V15 đạt 99,9% (còn 0,020 µg/mL)
Hiệu suất khử $NO_2^- -N$ sau 48h Cả V9 và V15 đều đạt 100% (nồng độ còn 0,0002 mg/L)

Về ảnh hưởng của độ mặn sau 24 giờ khảo sát ở nồng độ ban đầu 100 mg/L $NO_3^- -N$ và 100 mg/L $NO_2^- -N$:

  • Ở độ mặn 25‰: Chủng V15 đạt hiệu suất khử nitrate 65,7% (hàm lượng còn 33,718 mg/L), tích lũy nitrite thấp nhất ($4,107\ \mu\text{g/mL}$), mật độ tế bào đạt $10^{10,407}\ \text{CFU/mL}$; chủng V9 đạt hiệu suất khử nitrate 41,5% (hàm lượng còn 57,564 mg/L), mật độ tế bào đạt $10^{10,153}\ \text{CFU/mL}$ ($1,4 \times 10^{10}\ \text{CFU/mL}$).
  • Ở các độ mặn cao hơn (30‰, 35‰, 40‰): Hiệu suất khử nitrate giảm rõ rệt (V9 đạt từ 8,6% - 9,8%; V15 đạt từ 10,1% - 16,1%), mật độ tế bào giảm xuống mức $10^{4,832} - 10^{5,098}\ \text{CFU/mL}$ ở chủng V9 và $10^{5,785} - 10^{6,110}\ \text{CFU/mL}$ ở chủng V15.

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy cả hai chủng xuất hiện vạch kích thước khoảng 1,5 kb. Phân tích BLAST trình tự nucleotide gen 16S rRNA xác định chủng V9 tương đồng 99,93% (độ bao phủ 100%) và chủng V15 tương đồng 99,71% (độ bao phủ 100%) với loài Pseudomonas sp.

Chương 5. Kết luận và đề nghị

Chương cuối tóm lược 4 kết luận chính về số lượng chủng, khả năng khử nitrate/nitrite, ảnh hưởng của độ mặn và tên định danh khoa học của hai chủng V9 và V15. Đồng thời đề xuất 5 định hướng thực nghiệm tiếp nối nhằm đưa chủng vi khuẩn vào ứng dụng thực tế.


Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu mang lại các kết quả thực nghiệm định lượng rõ ràng:

  • Phân lập thành công 2 chủng vi khuẩn bản địa ký hiệu V9 và V15 từ bùn đáy ao nuôi tôm thẻ chân trắng Bạc Liêu có khả năng khử đồng thời nitrate và nitrite với hiệu suất trên 99% sau 24 giờ và đạt 100% sau 48 giờ ở điều kiện kỵ khí phòng thí nghiệm.
  • Làm sáng tỏ đáp ứng sinh trưởng và khả năng xử lý nitơ của 2 chủng ở dải độ mặn từ 25‰ đến 40‰, trong đó chỉ ra độ mặn 25‰ là điều kiện tối ưu để vi khuẩn duy trì mật độ cao ($> 10^{10}\ \text{CFU/mL}$) và hiệu suất chuyển hóa nitrate đạt từ 41,5% đến 65,7%.
  • Cung cấp dữ liệu sinh học phân tử xác định cả hai chủng thuộc chi Pseudomonas sp. với độ tương đồng giải trình tự 16S rRNA đạt lần lượt 99,93% (V9) và 99,71% (V15).

So với nghiên cứu trước đây của Hoàng Phương Hà và cộng sự (2020) trên chủng Pseudomonas sp. BL5 (đạt hiệu suất khử nitrate 94,7% sau 7 ngày và khử nitrite 99,5% sau 4 ngày) hoặc nghiên cứu của Guo và cộng sự (2013) trên Pseudomonas stutzeri T1 (loại bỏ 75% nitrate), hai chủng V9 và V15 trong khóa luận này thể hiện tốc độ chuyển hóa nhanh hơn trong 24 - 48 giờ nuôi cấy ban đầu.


Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận một số hạn chế gắn liền với phạm vi thực nghiệm:

  • Hoạt tính khử nitrate và nitrite của hai chủng V9 và V15 mới chỉ được đánh giá trong điều kiện thiếu khí/kỵ khí ($5%\ CO_2$), trong khi môi trường ao nuôi tôm thương phẩm ngoài thực tế thường xuyên duy trì nồng độ oxy hòa tan (DO) cao qua hệ thống quạt nước.
  • Hoạt tính chuyển hóa nitơ và mật độ tế bào bị ức chế đáng kể khi độ mặn môi trường tăng từ 30‰ đến 40‰.

Từ các hạn chế trên, tác giả đề xuất 5 hướng nghiên cứu tiếp theo:

  1. Khảo sát khả năng đối kháng của hai chủng vi khuẩn với các vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên tôm thẻ chân trắng.
  2. Đánh giá hoạt tính khử nitrate của chủng V9 và V15 trong điều kiện hiếu khí.
  3. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa ở các mức nồng độ nitrate cao hơn 100 mg/L.
  4. Đánh giá ảnh hưởng của các dải pH và nhiệt độ khác nhau đến động thái tăng trưởng và hiệu suất khử.
  5. Thử nghiệm khả năng xử lý nước trong hệ thống bể nuôi tôm quy mô phòng thí nghiệm và mở rộng ra mô hình ao nuôi thực địa.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho sinh viên, học viên và nghiên cứu viên thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Môi trường và Nuôi trồng Thủy sản. Tài liệu có giá trị tham khảo cụ thể ở các nội dung:

  • Quy trình sàng lọc từng bước kết hợp giữa môi trường chỉ thị màu bromothymol blue, kiểm tra sinh khí ống Durham và định tính hóa học (thuốc thử Griess, diphenylamine).
  • Phương pháp luận chi tiết và công thức pha hóa chất trong định lượng $NO_3^- -N$ bằng acid salicylic và $NO_2^- -N$ theo tiêu chuẩn trắc quang APHA 4500.
  • Quy trình tách chiết DNA, thông số chu trình nhiệt PCR nhân đoạn gen 16S rRNA và phương pháp phân tích cây phát sinh loài phục vụ định danh vi khuẩn xử lý nước thải.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác giả đã thu thập bao nhiêu mẫu và ở đâu để phân lập vi khuẩn?
Tác giả đã thu thập 15 mẫu bùn đáy (lấy ở độ sâu 0 - 20 cm) và nước từ 15 ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại xã Long Điền Tây và xã Điền Hải thuộc huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu.

2. Tiêu chuẩn nào được sử dụng để chọn lọc 2 chủng V9 và V15 từ 32 chủng ban đầu?
Tiêu chuẩn chọn lọc là chủng vi khuẩn phải làm đục môi trường, sinh khí trong ống Durham sau 5 - 6 ngày nuôi cấy trong môi trường chứa 1 g/L $KNO_3$, đồng thời phải cho kết quả âm tính với cả thử nghiệm định tính nitrite (thuốc thử Griess không đổi màu hồng) và định tính nitrate (thuốc thử diphenylamine không xuất hiện màu xanh dương), chứng tỏ nitrate đã được chuyển hóa hoàn toàn thành khí chứ không dừng lại ở dạng nitrite tích lũy.

3. Khả năng khử nitrate và nitrite của hai chủng V9 và V15 đạt mức bao nhiêu sau 24 giờ?
Ở nồng độ ban đầu 100 mg/L, sau 24 giờ, chủng V9 làm giảm $NO_3^- -N$ xuống 0,231 mg/L (hiệu suất 99,8%) và $NO_2^- -N$ xuống 0,073 µg/mL (hiệu suất 99,9%). Chủng V15 làm giảm $NO_3^- -N$ xuống 0,589 mg/L (hiệu suất 99,4%) và $NO_2^- -N$ xuống 0,020 µg/mL (hiệu suất 99,9%).

4. Độ mặn ảnh hưởng như thế nào đến khả năng khử nitrate của hai chủng vi khuẩn?
Khi độ mặn tăng từ 25‰ lên 30‰, 35‰ và 40‰, mật độ tế bào và hiệu suất khử nitrate sau 24 giờ đều giảm mạnh. Tại độ mặn 25‰, hiệu suất khử nitrate đạt cao nhất (V15 đạt 65,7%, V9 đạt 41,5%) và mật độ tế bào đạt trên $10^{10}\ \text{CFU/mL}$. Ở các mức độ mặn từ 30‰ đến 40‰, hiệu suất khử nitrate của cả hai chủng chỉ còn dao động trong khoảng từ 8,6% đến 16,1%.

5. Kết quả định danh phân tử 16S rRNA xác định hai chủng V9 và V15 là loài gì?
Kết quả khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F/1492R tạo ra đoạn sản phẩm 1,5 kb. Sau khi giải trình tự và tra cứu BLAST trên ngân hàng gen NCBI, chủng V9 đạt độ tương đồng 99,93% và chủng V15 đạt độ tương đồng 99,71% với chi Pseudomonas sp. (100% query cover).


Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Bùi Văn Tuấn Vũ đã phân lập thành công 2 chủng vi khuẩn Gram âm Pseudomonas sp. V9 và Pseudomonas sp. V15 từ bùn ao nuôi tôm tại tỉnh Bạc Liêu có khả năng khử nitrate và nitrite với hiệu suất đạt trên 99% sau 24 giờ ở điều kiện kỵ khí. Nghiên cứu đã xác định độ mặn 25‰ là ngưỡng thích hợp nhất cho sự phát triển và hoạt tính chuyển hóa nitơ của hai dòng vi khuẩn này. Đây là công trình thực nghiệm cung cấp đầy đủ quy trình vi sinh - hóa sinh và dữ liệu sinh học phân tử có giá trị ứng dụng cho định hướng phát triển chế phẩm sinh học xử lý nước thải ao nuôi tôm.