Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio spp. từ tôm thẻ chân trắng

Khóa luận trình bày phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn kháng Vibrio spp từ tôm thẻ chân trắng, góp phần bảo vệ ngành nuôi trồng thủy sản.

• Tác giả: Ngô Thị Thanh Thúy
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoàng Dũng
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Của Lactobacillus Và Bacillus Đối Với Vibrio Spp. Trong Nuôi Tôm
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM HIỆN NAY Ở VIỆT NAM
• 2.1. Tình hình dịch bệnh trong ngành nuôi
• 2.2. Vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên tôm
• 2.3. Đặc điểm hình thái của Vibrio
• 2.4. Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh trong nuôi tôm
• 2.5. Chế phẩm sinh học
• 2.6. Các đặc tính sinh học có lợi của chủng vi khuẩn probiotic
• 2.7. Đặc tính đối kháng với vi sinh vật gây bệnh
• 2.8. Tình hình nghiên cứu lợi khuẩn trong và ngoài nước ứng dụng trong nuôi tôm
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu. Môi trường nuôi cấy. Hóa chất và thuốc thử
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp thu mẫu
• 3.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
• 3.3.3. Phương pháp hoạt hóa giống
• 3.3.4. Phương pháp đối kháng với chủng Vibrio spp.
• 3.3.5. Thử nghiệm Oxidase
• 3.3.6. Thử nghiệm lên men carbohydrate
• 3.3.7. Phương pháp định danh bằng giải trình tự 16S rRNA
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu tôm ao và nước ao
• 4.2. Kết quả hoạt hóa chủng Vibrio spp. Khả năng đối kháng với Vibrio
• 4.3. Định danh vi khuẩn
• 4.4. Kết quả thử nghiệm Catalase, Oxidase và Citrate
• 4.5. Kết quả lên men đường carbohydrate
• 4.6. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• Phụ lục 1. Hình ảnh kết quả phân lập và làm thuần gồm 25 chủng từ mẫu nước ao và tôm
• Phụ lục 2. Kết quả đo OD600nm của chủng Vibrio spp.
• Phụ lục 3. Kết quả đếm mật độ khuẩn lạc pha loãng 10; 10⁰, mỗi nồng độ 2 đĩa petr
• Phụ lục 4. Kết quả đếm mật độ khuẩn lạc pha loãng 10⁰; 10⁵, mỗi nồng độ 2 đĩa petri
• Phụ lục 5. Kết quả giải trình tự gen 16S bằng cặp mồi 27F — 1492R
• Phụ lục 6. Kết quả kích thước kháng Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h theo phương pháp trực tiếp bằng khuẩn lạc
• Phụ lục 7. Kết quả kích thước kháng Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h theo phương pháp trực tiếp bằng khuẩn lạc
• Phụ lục 8. Kết quả kích thước kháng Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h theo phương pháp trực tiếp
• Phụ lục 9. Kết quả kích thước kháng Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h theo phương pháp trực tiếp

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus và Bacillus

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus và Bacillus đối với Vibrio spp. trong nuôi tôm đang trở thành một chủ đề nóng trong ngành nuôi trồng thủy sản. Các vi khuẩn này có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi. Việc sử dụng vi sinh vật có lợi không chỉ giúp cải thiện sức khỏe tôm mà còn giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, từ đó bảo vệ môi trường nuôi trồng thủy sản.

1.1. Khái niệm về Lactobacillus và Bacillus trong nuôi tôm

Lactobacillus và Bacillus là hai nhóm vi khuẩn có lợi, được biết đến với khả năng sinh enzyme và kháng khuẩn. Chúng có thể cải thiện sức khỏe đường ruột của tôm, giúp tăng cường khả năng miễn dịch và giảm thiểu bệnh tật.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu kháng khuẩn trong nuôi tôm

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các vi sinh vật này là cần thiết để phát triển các chế phẩm sinh học an toàn và hiệu quả, nhằm thay thế kháng sinh trong nuôi tôm. Điều này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe tôm mà còn bảo vệ môi trường.

II. Vấn đề và thách thức trong nuôi tôm hiện nay

Ngành nuôi tôm đang đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là sự bùng phát của các bệnh do Vibrio spp. gây ra. Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) và hội chứng chết sớm (EMS) là những bệnh nghiêm trọng, gây thiệt hại lớn cho người nuôi tôm. Việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn.

2.1. Tình hình dịch bệnh do Vibrio spp. gây ra

Bệnh do Vibrio spp. gây ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm. Các triệu chứng bệnh lý như sưng gan, phân lỏng và chết hàng loạt đã khiến nhiều trang trại nuôi tôm phải đóng cửa.

2.2. Tác động của kháng sinh đến môi trường nuôi tôm

Việc lạm dụng kháng sinh không chỉ gây ra kháng thuốc mà còn làm ô nhiễm môi trường nước, ảnh hưởng đến hệ sinh thái và sức khỏe của người tiêu dùng.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus và Bacillus

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn được thực hiện thông qua việc phân lập các chủng vi khuẩn từ mẫu tôm và nước ao. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế của các chủng vi khuẩn đối với Vibrio spp.. Kết quả cho thấy một số chủng có khả năng kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là Lactobacillus fermentum R3.1.

3.1. Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn

Quy trình phân lập bao gồm thu thập mẫu tôm và nước, sau đó nuôi cấy trên môi trường thích hợp để thu được các chủng vi khuẩn. Các chủng này sẽ được định danh bằng phương pháp sinh hóa và gen.

3.2. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn

Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch được áp dụng để xác định đường kính vòng ức chế của các chủng vi khuẩn đối với Vibrio spp.. Kết quả cho thấy Lactobacillus fermentum R3.1 có khả năng kháng khuẩn mạnh với đường kính vòng phân giải đạt 10,2 ± 0,4 mm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Lactobacillus và Bacillus trong nuôi tôm

Các chế phẩm sinh học chứa Lactobacillus và Bacillus đang được ứng dụng rộng rãi trong nuôi tôm. Chúng không chỉ giúp cải thiện sức khỏe tôm mà còn tăng cường khả năng kháng bệnh. Việc sử dụng các chế phẩm này giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh tật và nâng cao hiệu quả sản xuất.

4.1. Lợi ích của chế phẩm sinh học trong nuôi tôm

Chế phẩm sinh học giúp cải thiện hệ vi sinh đường ruột, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng cho tôm. Điều này dẫn đến tăng trưởng nhanh hơn và giảm tỷ lệ chết.

4.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng Lactobacillus fermentum R3.1 trong nuôi tôm đã giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và tăng sản lượng tôm nuôi. Điều này chứng tỏ tính khả thi của việc áp dụng vi sinh vật có lợi trong nuôi trồng thủy sản.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus và Bacillus đối với Vibrio spp. mở ra hướng đi mới cho ngành nuôi tôm. Việc phát triển các chế phẩm sinh học an toàn và hiệu quả sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh tật và bảo vệ môi trường. Tương lai của ngành nuôi tôm sẽ phụ thuộc vào việc áp dụng các giải pháp bền vững và thân thiện với môi trường.

5.1. Triển vọng phát triển chế phẩm sinh học

Nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học từ Lactobacillus và Bacillus sẽ là xu hướng chính trong tương lai. Điều này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe tôm mà còn bảo vệ môi trường.

5.2. Tương lai của ngành nuôi tôm bền vững

Ngành nuôi tôm cần chuyển mình sang hướng phát triển bền vững, giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và áp dụng các biện pháp sinh học để bảo vệ sức khỏe tôm và môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là nuôi tôm nước lợ, giữ vai trò mũi nhọn trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp và xuất khẩu của Việt Nam. Theo số liệu của Cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn), ngành nuôi tôm hàng năm đóng góp khoảng 40 - 45% tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy sản cả nước. Sản lượng nuôi trồng tập trung phần lớn vào tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei / Litopenaeus vannamei), với mức tăng trưởng từ 119.700 tấn vào năm 2010 lên 735.000 tấn trong các năm sau đó. Khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là địa bàn trọng điểm khi chiếm hơn 90% diện tích và trên 95% sản lượng tôm nước lợ toàn quốc. Riêng tỉnh Sóc Trăng, năm 2022 có diện tích thả nuôi tôm nước lợ hơn 54.600 ha, sản lượng đạt trên 201.000 tấn và giá trị xuất khẩu đạt khoảng 1 tỷ USD.

Tuy nhiên, quá trình thâm canh hóa tăng nhanh cùng sự biến động môi trường ao nuôi đã kéo theo nguy cơ bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng. Trong đó, các bệnh do giống vi khuẩn Vibrio spp. gây ra là nguyên nhân chính dẫn đến thiệt hại kinh tế nặng nề:

• Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND), còn gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS), do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang gen độc tố sinh protein PirA và PirB gây ra, có khả năng làm tôm chết hàng loạt với tỷ lệ tử vong lên đến 100% trong giai đoạn 20 - 45 ngày sau khi thả giống.
• Bệnh phát sáng do vi khuẩn Vibrio harveyi tiết enzyme Luciferase dưới sự điều hòa của hệ thống lux operon (cơ chế cảm biến đại biểu - quorum sensing), gây suy giảm miễn dịch, khiến tôm bỏ ăn và chết rải rác.

Thực tế nuôi tôm cho thấy người dân thường sử dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn để phòng trừ dịch bệnh. Việc lạm dụng hóa chất không kiểm soát đã gây ra hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh, tồn dư chất độc hại trong sản phẩm xuất khẩu và làm mất cân bằng hệ vi sinh thái ao nuôi. Chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn có lợi (probiotic) như Lactobacillus và Bacillus là giải pháp thay thế bền vững. Tuy nhiên, phần lớn chế phẩm thương mại trên thị trường hiện nay được nhập khẩu với giá thành cao và khả năng thích ứng với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu tại Việt Nam chưa tối ưu.

Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Ngô Thị Thanh Thúy đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học với đề tài: "Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio spp. từ tôm thẻ chân trắng".

Mục tiêu của đề tài gồm hai nội dung:

1. Phân lập và sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio spp. (Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi) từ mẫu nước ao và mẫu nội tạng tôm ao tại tỉnh Sóc Trăng.
2. Định danh chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào để định hướng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học probiotic.

Để đạt được mục tiêu, ba nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được triển khai:

1. Nhiệm vụ 1: Thu thập mẫu tôm và nước ao, tiến hành phân lập, làm thuần và sàng lọc hình thái các chủng vi khuẩn.
2. Nhiệm vụ 2: Đánh giá khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio spp. bằng phương pháp khuếch tán trên thạch (đối kháng trực tiếp bằng khuẩn lạc và đối kháng bằng dịch ngoại bào); đồng thời khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) của chủng tuyển chọn.
3. Nhiệm vụ 3: Định danh chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng thông qua quan sát hình thái, thử nghiệm sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rRNA.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu nước ao và mẫu nội tạng (gan, ruột) tôm thẻ chân trắng thu tại tỉnh Sóc Trăng; các chủng kiểm định gây bệnh gồm Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi do Phòng Vi sinh Ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp.
• Phạm vi không gian: Thu mẫu thực địa tại các ao nuôi tôm thuộc tỉnh Sóc Trăng; toàn bộ các bước phân lập, thử nghiệm sinh hóa, hoạt tính sinh học và định danh được thực hiện tại Phòng Vi sinh Ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới (TP. Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 07/2023 đến tháng 12/2023 (khóa luận bảo vệ tháng 03/2024).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

Khóa luận xây dựng trên nền tảng vi sinh vật học ứng dụng và công nghệ sinh học thủy sản:

• Đặc điểm vi khuẩn gây bệnh giống Vibrio: Trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong (hình dấu phẩy), kỵ khí tùy nghi, di động bằng một hoặc nhiều tiên mao. Độc lực của Vibrio biểu hiện qua các yếu tố kết dính, độc tố tế bào, lipopolysaccharide và hệ thống enzyme/độc tố chuyên biệt (như phức hợp độc tố PirA/PirB ở V. parahaemolyticus phá hủy mô gan tụy; enzyme Luciferase ở V. harveyi tạo hiện tượng phát quang).
• Cơ chế tác động của vi khuẩn Probiotic: Sử dụng định nghĩa chuẩn của FAO/WHO về probiotic ("các vi sinh vật sống, khi được sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ"). Các cơ chế đối kháng bao gồm: cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột, cạnh tranh cơ chất dinh dưỡng, sản sinh các hợp chất kháng khuẩn (bacteriocin, acid hữu cơ, hydrogen peroxide) và tổng hợp các enzyme tiêu hóa ngoại bào (amylase phân giải tinh bột, protease phân giải protein, cellulase xử lý xác tảo và chất xơ) giúp làm sạch nền đáy ao nuôi và ổn định chất lượng nước.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng phương pháp thực nghiệm phòng thí nghiệm (in vitro) kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử:

1. Phương pháp thu và xử lý mẫu:

   • Thu 1 mẫu nước (100 ml) và 10 cá thể tôm khỏe mạnh trên mỗi ao tại 2 ao nuôi tôm ở Sóc Trăng, bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4°C và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 12 giờ.
   • Xử lý mẫu nước bằng cách pha loãng bậc 10 ($10^{-1}$ đến $10^{-6}$) trong nước muối sinh lý vô trùng ($NaCl$ 0,85%).
   • Tôm được mổ vô trùng lấy nội tạng (gan và ruột), nghiền đồng nhất trong ống Eppendorf 2 ml với chày nhựa chuyên dụng, lấy 100 µl dịch nổi pha loãng bậc 10 ($10^{-1}$ đến $10^{-6}$).

2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy:

   • Cấy trải 100 µl dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng lên bề mặt môi trường chọn lọc de Man, Rogosa and Sharpe Agar (MRSA) để phân lập Lactobacillus và Luria-Bertani Agar (LBA) để phân lập Bacillus.
   • Ủ ở 37°C trong 24 - 48 giờ ở điều kiện kỵ khí; cấy ria làm thuần các khuẩn lạc đặc trưng; nhuộm Gram sơ bộ để tuyển chọn trực khuẩn Gram dương.

3. Phương pháp hoạt hóa và định lượng vi khuẩn gây bệnh:

   • Vi khuẩn V. parahaemolyticus và V. harveyi được tăng sinh cấp 1 và cấp 2 trong môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) ở 37°C trong 24 giờ.
   • Kiểm tra độ thuần và đặc điểm hình thái trên môi trường chọn lọc Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS); đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm ($OD_{600}$) và định lượng mật độ tế bào đạt $10^6$ CFU/ml bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

4. Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio spp.:

   • Đối kháng trực tiếp bằng khuẩn lạc: Cấy trải dịch Vibrio ($10^6$ CFU/ml) lên đĩa thạch Mueller-Hinton Agar (MHA). Dùng dụng cụ đục lỗ đường kính 10 mm trên môi trường MHA, chuyển khối thạch chứa khuẩn lạc vi khuẩn tuyển chọn (nuôi 24 - 48 giờ trên LBA/MRSA) đặt vào lỗ thạch, ủ ở 37°C trong 24 giờ và đo đường kính vòng vô khuẩn.
   • Đối kháng bằng dịch ngoại bào: Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng (MRS/LB), ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C, thu dịch nổi và lọc qua màng lọc vô trùng kích thước lỗ 0,22 µm. Hút 100 µl dịch lọc cho vào giếng thạch (đường kính 10 mm) trên đĩa MHA đã cấy trải Vibrio, ủ 37°C trong 24 giờ và đo kích thước vòng ức chế.

5. Phương pháp khảo sát enzyme ngoại bào:

   • Khảo sát hoạt tính amylase trên môi trường thạch Starch Agar (bổ sung tinh bột 2%), phát hiện bằng dung dịch Lugol.
   • Khảo sát hoạt tính protease trên môi trường Skim Milk Agar (chứa 10% bột sữa gầy), quan sát vòng phân giải protein trực tiếp.
   • Khảo sát hoạt tính cellulase trên môi trường Carboxymethyl Cellulose (CMC Agar 2%), phát hiện vòng phân giải bằng dung dịch Congo Red 1% và rửa lại bằng dung dịch $NaCl$ 1M.

6. Phương pháp thử nghiệm đặc tính sinh hóa:

   • Nhuộm bào tử bằng thuốc nhuộm lục Malachite 5% kết hợp nhuộm đối kháng Safranin 0,5%.
   • Thử nghiệm enzyme Catalase bằng dung dịch $H_2O_2$ 3%.
   • Thử nghiệm Cytochrome c Oxidase bằng que thử Microbiology Bactident Oxidase.
   • Thử nghiệm sử dụng Citrate trên môi trường Simmons Citrate Agar.
   • Thử nghiệm lên men carbohydrate (Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose) trong môi trường lỏng có bổ sung chất chỉ thị màu Phenol Red (pH 6,8).

7. Phương pháp định danh sinh học phân tử:

   • Tách chiết DNA bộ gen vi khuẩn bằng phương pháp kết tủa muối (salting-out) sử dụng lysis buffer, Proteinase K, dung dịch $NaCl$ 6M và ethanol.
   • Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng cặp mồi chuẩn 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') với MyFi mix 2X. Chu trình nhiệt gồm: 95°C trong 5 phút; 30 chu kỳ (95°C trong 30 giây, 55°C trong 30 giây, 72°C trong 1,5 phút); kéo dài ở 72°C trong 5 phút.
   • Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, giải trình tự tại Công ty TNHH Nam Khoa, xử lý chuỗi bằng phần mềm BioEdit và so sánh mức độ tương đồng trên ngân hàng gen NCBI qua công cụ BLAST.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương 1 thiết lập tính cấp thiết của đề tài dựa trên vai trò kinh tế của ngành nuôi tôm thẻ chân trắng tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực ĐBSCL. Tác giả phân tích tác hại của các dịch bệnh đường ruột do Vibrio spp. (như EMS/AHPND và bệnh phát sáng), thực trạng lạm dụng kháng sinh gây tồn dư độc chất và hiện tượng lờn thuốc. Từ đó, chương nêu rõ mục đích khoa học là tìm kiếm nguồn vi khuẩn probiotic bản địa từ chính hệ tiêu hóa tôm và môi trường ao nuôi tôm Sóc Trăng, đồng thời xác lập 3 nội dung nghiên cứu cụ thể.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp cơ sở lý luận và các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước:

• Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh: Cung cấp số liệu thống kê sản lượng tôm nước lợ Việt Nam năm 2021 - 2022 (năm 2022 đạt 745.000 tấn, tôm thẻ chân trắng đạt 474.000 tấn, tôm sú đạt 271.000 tấn; kim ngạch xuất khẩu đạt 4,1 - 4,2 tỷ USD). Trình bày chi tiết cơ chế bệnh sinh của V. parahaemolyticus (tiết độc tố PirA, PirB) và V. harveyi (hệ thống lux operon và enzyme luciferase).
• Tổng quan về Probiotic: Trình bày vị trí phân loại học theo Bergey của hai chi vi khuẩn có lợi chính là Bacillus (Gram dương, hình que, sinh nội bào tử, catalase dương tính) và Lactobacillus (thuộc nhóm vi khuẩn Lactic - LAB, Gram dương, không tạo bào tử, catalase âm tính, kỵ khí tùy nghi).
• Hoạt tính sinh học có lợi: Phân tích vai trò của các enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) trong việc hỗ trợ tiêu hóa và làm sạch nước ao; cơ chế đối kháng của probiotic thông qua cạnh tranh không gian, cạnh tranh dinh dưỡng và sản sinh bacteriocin, acid hữu cơ, $H_2O_2$.
• Lịch sử nghiên cứu: Điểm qua các công trình quốc tế (Liu và cộng sự, 2009; Kongnum và Hongpattarakere, 2012; Yang Du và cộng sự, 2022) và trong nước (Trịnh Thị Phương Thảo và cộng sự, 2022 với chủng Lactobacillus farciminis HN12; Đỗ Thị Thanh Dung và cộng sự, 2017 với chủng Lactobacillus TA7L1; Phạm Thị Tuyết Ngân và cộng sự, 2021; Nguyễn Văn Minh và cộng sự, 2019 với chế phẩm CPVS 01).

Chương 3: Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ điều kiện thực nghiệm, bao gồm danh mục 18 dụng cụ và 20 thiết bị chuyên dụng; công thức định lượng chi tiết cho 8 loại môi trường nuôi cấy (LB Broth, MRS Broth/Agar, TCBS Agar, MHA, TSB, CMC Agar, Starch Agar, Skim Milk Agar, Carbohydrate fermentation broth); hóa chất và thuốc thử (bộ nhuộm Gram, bộ nhuộm bào tử, Congo Red 1%, Lugol, $H_2O_2$ 3%, que thử Bactident Oxidase). Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa từ khâu thu mẫu tại Sóc Trăng, xử lý mẫu, phân lập, hoạt hóa mầm bệnh, thử nghiệm đối kháng kép (khuẩn lạc và dịch lọc ngoại bào), thử nghiệm enzyme, các phản ứng sinh hóa và quy trình tách chiết DNA, chạy PCR khuếch đại gen 16S rRNA.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 công bố toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được:

• Phân lập và tuyển chọn sơ bộ: Từ mẫu nước và nội tạng tôm ao tại Sóc Trăng, phân lập được tổng cộng 25 chủng vi khuẩn thuần (6 chủng từ gan, 10 chủng từ ruột, 9 chủng từ nước ao). Qua kiểm tra nhuộm Gram, chọn lọc được 9 chủng có dạng hình que, bắt màu Gram dương (ký hiệu gồm G2, G3, R1, R2, R3, R4, R3.1, N1, N3).
• Hoạt hóa mầm bệnh: Hoạt hóa thành công chủng V. parahaemolyticus và V. harveyi, xác nhận khuẩn lạc thuần chủng màu xanh/vàng đặc trưng trên đĩa thạch TCBS, tế bào hình dấu phẩy bắt màu Gram âm.
• Khả năng đối kháng với Vibrio spp.: Trong 9 chủng trực khuẩn Gram dương đem thử nghiệm, duy nhất chủng ký hiệu R3.1 (phân lập từ ruột tôm) thể hiện hoạt tính ức chế rõ rệt đối với cả 2 chủng kiểm định qua 3 lần lặp lại:
  • Phương pháp đối kháng trực tiếp: Đường kính vòng ức chế trung bình đối với V. parahaemolyticus đạt $10,0 \pm 1,2$ mm; đối với V. harveyi đạt $8,3 \pm 0,9$ mm.
  • Phương pháp đối kháng dịch ngoại bào: Đường kính vòng vô khuẩn đối với V. parahaemolyticus đạt $10,2 \pm 0,4$ mm; đối với V. harveyi đạt $7,7 \pm 0,9$ mm.
• Đặc điểm hình thái và sinh hóa chủng R3.1: Khuẩn lạc nhỏ, hình tròn trơn, màu trắng đục, rìa mép không đều; tế bào hình que, Gram dương, không tạo nội bào tử. Kết quả thử nghiệm sinh hóa: Catalase âm tính (không sủi bọt khí với $H_2O_2$ 3%), Oxidase âm tính (que thử không đổi màu tím), Citrate âm tính (môi trường không đổi sang màu xanh đậm), có khả năng lên men sinh acid từ các nguồn đường Glucose, Lactose, Maltose và Saccharose (chuyển môi trường từ hồng sang vàng).
• Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Dịch enzyme của chủng R3.1 tạo vòng phân giải rõ rệt trên cả 3 môi trường thạch cơ chất Starch (amylase), Skim Milk (protease) và CMC (cellulase).
• Định danh sinh học phân tử: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA cho một băng điện di duy nhất có kích thước khoảng 1500 bp. Kết quả so sánh trình tự nucleotide trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST xác định chủng R3.1 có mức độ tương đồng cao với loài Lactobacillus fermentum (đặt tên là Lactobacillus fermentum R3.1).

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Chương tổng hợp các phát hiện chính về chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum R3.1 và đưa ra các đề xuất nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện tiềm năng ứng dụng thực tế.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và phát hiện chính

Khóa luận đã phân lập, tuyển chọn và định danh thành công chủng vi khuẩn đối kháng từ nguồn mẫu thực địa tại Sóc Trăng với các số liệu cụ thể:

Chỉ tiêu khảo sát	Đối tượng / Phương pháp	Kết quả ghi nhận trên chủng R3.1
Nguồn gốc phân lập	Mẫu nội tạng tôm thẻ chân trắng	Phân lập từ mẫu ruột tôm (1/25 chủng ban đầu)
Đặc điểm hình thái	Đại thể & Vi thể	Khuẩn lạc tròn trơn, trắng đục; trực khuẩn Gram (+), không sinh bào tử
Khả năng đối kháng trực tiếp	Khuẩn lạc trên thạch MHA	Vòng ức chế V. parahaemolyticus: $10,0 \pm 1,2$ mm Vòng ức chế V. harveyi: $8,3 \pm 0,9$ mm
Khả năng đối kháng dịch lọc	Màng lọc 0,22 µm trên thạch MHA	Vòng ức chế V. parahaemolyticus: $10,2 \pm 0,4$ mm Vòng ức chế V. harveyi: $7,7 \pm 0,9$ mm
Thử nghiệm sinh hóa	Catalase, Oxidase, Citrate	Catalase (-), Oxidase (-), Citrate (-)
Lên men Carbohydrate	Môi trường Phenol Red broth	Dương tính (+) với Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose
Enzyme ngoại bào	Đĩa thạch cơ chất chuyên biệt	Dương tính (+) với Amylase, Protease và Cellulase
Định danh phân tử	Giải trình tự gen 16S rRNA (~1500 bp)	Xác định loài: Lactobacillus fermentum R3.1

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Ứng dụng chủng Lactobacillus fermentum R3.1 làm nguồn chủng vi sinh vật bản địa tiềm năng để sản xuất chế phẩm sinh học probiotic dùng trong nuôi tôm thẻ chân trắng.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa các thông số môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, tỷ lệ tiếp giống) để nâng cao hiệu suất sinh khối và nồng độ chất kháng khuẩn trong dịch ngoại bào.

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

• Bổ sung vào tập đoàn chủng vi sinh vật bản địa tại khu vực ĐBSCL một chủng Lactobacillus fermentum phân lập trực tiếp từ đường ruột tôm thẻ chân trắng khỏe mạnh, có khả năng đối kháng kép đồng thời với cả hai tác nhân nguy hiểm nhất hiện nay là Vibrio parahaemolyticus (gây EMS/AHPND) và Vibrio harveyi (gây bệnh phát sáng).
• Chứng minh cơ chế đối kháng không chỉ qua cạnh tranh tiếp xúc trực tiếp mà còn thông qua các hợp chất kháng khuẩn thứ cấp tiết ra trong dịch ngoại bào (kích thước vòng ức chế dịch lọc đạt tới $10,2 \pm 0,4$ mm).
• Chủng R3.1 tích hợp đồng thời cả ba hoạt tính enzyme ngoại bào quan trọng (amylase, protease, cellulase), tạo tiềm năng kép: vừa ức chế mầm bệnh đường ruột, vừa hỗ trợ tiêu hóa thức ăn và phân hủy mùn bã hữu cơ trong môi trường nuôi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trong phòng thí nghiệm; chưa tiến hành khảo sát in vivo (thử nghiệm trực tiếp trên tôm sống tại ao nuôi thực tế).
• Địa bàn thu mẫu còn hẹp (chỉ thu thập tại 2 ao nuôi tôm thuộc tỉnh Sóc Trăng) và thời gian thực hiện ngắn (tháng 07/2023 - 12/2023), dẫn đến số lượng chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh thu được còn hạn chế (1/9 chủng trực khuẩn Gram dương).
• Chưa tiến hành phân tích chi tiết thành phần hóa học cụ thể của các hợp chất kháng khuẩn trong dịch chiết ngoại bào (như xác định cấu trúc bacteriocin hay nồng độ acid hữu cơ).

Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo đề xuất của tác giả)

• Khảo sát các điều kiện lên men tối ưu (pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng) để thu nhận lượng sinh khối và hoạt tính kháng khuẩn cao nhất của chủng Lactobacillus fermentum R3.1.
• Thử nghiệm đánh giá độ an toàn sinh học và hiệu quả đối kháng Vibrio trên mô hình tôm thẻ chân trắng thực tế (in vivo challenge test).
• Nghiên cứu công nghệ tạo chế phẩm (dạng bột hoặc dạng dịch phối trộn với chất mang) nhằm kéo dài thời gian bảo quản và ứng dụng thực tế tại các vùng nuôi tôm.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho sinh viên, giảng viên và các nhóm nghiên cứu thuộc các ngành:

• Công nghệ Sinh học, Vi sinh học Ứng dụng: Tham khảo quy trình phân lập, sàng lọc và định danh vi khuẩn acid lactic (LAB) từ mẫu động vật thủy sản; quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp salting-out và chu trình nhiệt phản ứng PCR gen 16S rRNA.
• Bệnh học Thủy sản, Nuôi trồng Thủy sản: Tham khảo phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối kháng với các chủng Vibrio spp. (kỹ thuật đục giếng thạch trực tiếp và sử dụng dịch lọc vi khuẩn); công thức pha chế các môi trường nuôi cấy chuyên dụng (TCBS, MRSA, CMC, Skim Milk).
• Các nhà phát triển chế phẩm sinh học: Cung cấp dẫn liệu khoa học về đặc tính sinh học, khả năng sinh enzyme ngoại bào và hoạt tính đối kháng mầm bệnh của chủng bản địa Lactobacillus fermentum R3.1 phục vụ phát triển chế phẩm vi sinh thay thế kháng sinh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận đã phân lập được bao nhiêu chủng vi khuẩn và có bao nhiêu chủng thể hiện hoạt tính kháng Vibrio spp.?
Từ mẫu nước và nội tạng tôm (gan, ruột) tại Sóc Trăng, nghiên cứu phân lập được tổng cộng 25 chủng vi khuẩn thuần. Qua kiểm tra hình thái nhuộm Gram, tác giả chọn lọc được 9 chủng trực khuẩn Gram dương. Khi thử nghiệm đối kháng với V. parahaemolyticus và V. harveyi, chỉ có duy nhất 1 chủng ký hiệu là R3.1 (tỷ lệ 1/9) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt.

2. Kích thước vòng vô khuẩn của chủng R3.1 đối với hai loài Vibrio kiểm định đạt bao nhiêu?

• Đối với phương pháp đối kháng trực tiếp bằng khuẩn lạc: Vòng ức chế trung bình đối với V. parahaemolyticus là $10,0 \pm 1,2$ mm và đối với V. harveyi là $8,3 \pm 0,9$ mm.
• Đối với phương pháp đối kháng bằng dịch lọc ngoại bào: Vòng ức chế trung bình đối với V. parahaemolyticus đạt $10,2 \pm 0,4$ mm và đối với V. harveyi đạt $7,7 \pm 0,9$ mm.

3. Chủng vi khuẩn R3.1 có những đặc điểm sinh hóa và khả năng sinh enzyme ngoại bào nào?
Chủng R3.1 có phản ứng Catalase âm tính (không sủi bọt khí khi gặp $H_2O_2$ 3%), Oxidase âm tính, Citrate âm tính, có khả năng lên men sinh acid đối với cả 4 loại đường (Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose). Về hoạt tính enzyme ngoại bào, dịch enzyme của chủng R3.1 có khả năng sinh tổng hợp cả 3 loại enzyme: amylase (phân giải tinh bột), protease (phân giải protein sữa gầy) và cellulase (phân giải carboxymethyl cellulose).

4. Chủng R3.1 được định danh chính xác là loài vi khuẩn nào và bằng phương pháp gì?
Chủng R3.1 được định danh là loài Lactobacillus fermentum (đặt tên là Lactobacillus fermentum R3.1) dựa trên sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái (trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử), các chỉ tiêu sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen 16S rRNA (khuếch đại bằng cặp mồi 27F - 1492R, kích thước ~1500 bp) so sánh độ tương đồng trên ngân hàng gen NCBI qua công cụ BLAST.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Ngô Thị Thanh Thúy đã phân lập và sàng lọc thành công chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum R3.1 từ ruột tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Sóc Trăng, có khả năng đối kháng hiệu quả đối với hai mầm bệnh nguy hiểm là Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi. Chủng R3.1 thể hiện hoạt tính ức chế thông qua dịch tiết ngoại bào với đường kính vòng kháng khuẩn đạt trên 10 mm, đồng thời có khả năng sinh tổng hợp đồng thời ba loại enzyme tiêu hóa và xử lý môi trường gồm amylase, protease và cellulase. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc cho định hướng ứng dụng nguồn vi khuẩn probiotic bản địa vào sản xuất chế phẩm sinh học an toàn, góp phần thay thế kháng sinh trong nuôi tôm bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC PHAN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUAN CÓ KHẢ NĂNG DOI KHANG VỚI Vibrio spp. TỪ TOM THE CHAN TRANG Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC Sinh viên thực hiện =: NGO THỊ THANH THUY Mã số sinh viên : 19126277 Niên khóa : 2019 — 2023 TP. Thu Đức, 03/2024 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP PHAN LAP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUAN CÓ KHẢ NĂNG DOI KHANG VỚI Vibrio spp. TỪ TÔM THẺ CHAN TRANG Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện TS.

NGUYÊN HOÀNG DŨNG NGÔ THỊ THANH THÚY ThS. LÊ QUỲNH LOAN TP. Thủ Đức, 03/2024 LOI CAM ON Thời gian bốn năm gắn bó tại trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đặc biệt là khoa Khoa học Sinh học không phải là hành trình quá dài, nhưng những gì em nhận được từ các thầy cô là vô cùng to lớn. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giảng viên trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã trang bị cho em những kiến thức và những chia sẻ kinh nghiệm vô cùng quý báu đề làm hành trang vững chắc bước vào đời.

Qua thời gian học tập và nghiên cứu về chuyên ngành Công nghệ Sinh học tại Trường, em đã được quý Thầy/Cô ở Khoa tin tưởng cho em thực hiện đề tài tốt nghiệp “Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio spp từ tôm thẻ chân trắng”. Đây là đề tài rất thiết thực và ứng dụng thực tế vào giai đoạn phát triển hiện đại ngày nay giúp cho chúng em có thêm những kiến thức, trải nghiệm thực tế cụ thể và sâu sắc hơn về đề tài nghiên cứu. Em xin cảm ơn sâu sắc đến toàn thể quý Thầy/Cô khoa Khoa học Sinh học nói chung cũng như gửi đến thầy Tiến Sĩ Nguyễn Hoàng Dũng, cô Thạc Sĩ Lê Quỳnh Loan nói riêng cùng với đó là phòng Vi sinh Ung dụng thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, thực hiện đề tai. Trong quá trình thực hiện đề tài, tuy thời gian không quá dai nhưng em đã cô gắng hết sức dé hoàn thiện nhưng cũng không thé tránh khỏi những thiếu sót.

Em rất mong nhận được sự thông cảm và tận tình chỉ bảo, góp ý của quý Thây/Cô. Kính chúc quý Thay/C6 dồi dào sức khoẻ dé có nhiều cống hiến hơn nữa trong sự nghiệp phát triển của ngành và cũng như tiếp tục diu dắt những thế hệ trẻ tương lai của dat nước ngày một phát triển tốt hơn. Chân thành cảm ơn! XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN Tôi tên: Ngô Thị Thanh Thúy, MSSV: 19126277, Lớp: DH19SHB (Số di động: [phone], Email: [e-mail]) thuộc nganh Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, xin cam đoan tất cả kết quả đạt được trong khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio spp.

từ tôm thẻ chân trang” do chính tôi thực hiện, các số liệu, thông tin trong nghiên cứu này là hoàn toàn trung thực và khách quan. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này. H6 Chí Minh, ngày thang nam Người viet cam đoan il TÓM TẮT Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gây ra được xem là bệnh nguy hiểm gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành nuôi trồng thủy sản nói chung và ngành nuôi tôm nói riêng, trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) hay còn gọi là bệnh hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) được xem là một bệnh nguy hiểm trên tôm đã ảnh hưởng đến nhiều trang trại nuôi tôm trong khu vực Đông Nam A.

Ngoài ra chủng Vibrio harveyi cũng là một chủng gây bệnh nguy hiểm trên tôm, chúng không chỉ gây bệnh tôm phát sáng mà còn liên quan chặt chẽ với bệnh AHPND/EMS, đây là những chủng vi khuẩn nguy hiểm khó kiểm soát gây thiệt hại nghiêm trong cho ngành nuôi tôm. Việc phân lập vi khuẩn lactic và Bacillus từ nguồn mẫu tôm ao và mẫu nước thu từ ao nuôi tôm được đánh giá có khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus va Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm. Khi khảo sát khả năng đối kháng của 9/25 chủng vi khuẩn phân lập được tuyển chọn có khả năng là vi khuẩn Lactobacillus và Bacillus bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, kết quả phân lập va sang lọc thu được 1/9 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Ching Lactobacillus fermentum R3.1 có khả năng kháng khuẩn tương đối mạnh với đường kính vòng phân giải lớn nhất đạt 10,2 + 0,4 mm.1 có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bảo.

Từ các khả năng trên, Lactobacillus fermentum R3.1 là chủng vi khuẩn tiềm năng trong ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học. Từ khóa: Lactobacillus, Bacillus, Vibrio, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, EMS/AHPND, enzyme 11 ABSTRACT The disease is caused by the group of bacteria Vibrio spp. is considered a dangerous disease that causes serious damage to the aquaculture industry in general and the shrimp farming industry in particular, including acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND), also known as acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). Early Mortality Syndrome (EMS) 1s considered a dangerous shrimp disease that has affected many shrimp farms in Southeast Asia.

In addition, the Vibrio harveyi strain 1s also a dangerous pathogenic strain on shrimp. They not only cause glowing shrimp disease but are also closely related to AHPND/EMS disease. These are dangerous bacterial strains that are difficult to control and cause damage. serious for the shrimp farming industry.

Isolation of lactic bacteria and Bacillus from shrimp pond samples and water samples collected from shrimp ponds was assessed as having the ability to oppose Vibrio parahaemolyticus and Vibrio harveyi that cause disease in shrimp. When examining the antagonistic ability of 9/25 selected isolated bacterial strains that were likely Lactobacillus and Bacillus bacteria using the diffusion method on agar plates, the isolation and screening results yielded 1/9 strains. exhibits antibacterial activity.1 strain has relatively strong antibacterial ability with the largest resolution circle diameter reaching 10,2 + 0,4 mm.1 is capable of synthesizing many types of extracellular enzymes. From the above capabilities, Lactobacillus fermentum R3.1 1s a potential bacterial strain in biological product production applications.

Keyword: Lactobacillus, Bacillus, Vibrio, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, EMS/AHPND, enzyme 1V MỤC LỤC /2/ g7 00 uy 1.Ô iv DANH SÁCH CAC CHU VIET TẮTT.------52222¿+22222+22£EE+ttEEEEtrrrrrkrrrrrrrrrrrrrriee viii ETHEETE HT Guugeeeseeennnntnitroaaiotarooiotaotinggsvroiaidiogadgrgterggkai ix TATE BC GC FT TS uengeenenssarrsnbetobsorstioiet0ioiSiGGBENGNGEE0SNNEBSGIGG08/000000500 % mã ¡i^¬.- - + 2221 2122121121121112112121121111112121211121212211212112122 211cc eerrreu 1 JÂU 8 ẢẺẺ Ẩn nen 2 3. 2 ‘ee eee oe 3 2. Tinh hình nuôi tôm hiện nay ở Việt Nam. Tình hình dịch bệnh trong ngành nuôi (6101 sssc0sc.

Vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên tôm. Đặc điểm hình thái của Vibrio .Cae bệnh: do: Vibrio spp GAy 0a snore vemeencousesceuen samen eer eI 6 2. Anh hưởng của thuốc kháng sinh trong nuôi tôm .-- 2 22 222S+22222z2zz2Zzzzz+zs22 9 5.5, Chế phim sinh trig PHO WIG scvaccevtasersncievecervervonevrevmsvereavenercnsvrewexvineeastovsneenverciae 10 2.6, Cú04eHHmw Promotie TOs BaD sauoseseiesaaniiisogiiiisiidogigi800440435E80G02480560Lxi. Các đặc tinh sinh học có lợi của chủng vi khuẩn probiotic.

Đặc tinh sinh tổng hợp enzyme ngoại bảo .---2- 2-56 cSS2zcz2zcrerreerreee 13 2. Đặc tính đối kháng với vi sinh vật gây bệnh. Tình hình nghiên cứu lợi khuẩn trong và ngoài nước ứng dụng trong nuôi tôm.l« [inh hình: ne bieis cir THỨG NRO sasebspnstie-gaehiablietoegsiokkiiugsigxgi0is8ieescslggkokgsssbesi 15 2. Tình hình nghiên cứu trong nue .-- --- --- 5 <2 +*£+*£+*E+*E£vE£vEeeErrerreeeerxerereereere 16 CHUONG 3, VAT LIEU = PHUGNG PHÁP NGHIÊN CỨỮU.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu.----¿ 2 222z+2+£EE+EE+2E+2EE2EE22E22E2E222222222xee. 17 221, UAL ee pưngganggstiitigst9igi4gipf4gtfQ0380S810/0 men aerate aaa ees T7 3. Đối tượng nghiên cứu. Môi trường nuôi cấy.

Hóa chất và thuốc thử.T re 21 Bd: Ê Hương pháp nghiện BÚIceseeeeanesoaotonodbrdgliotootEgiontuietibdstk.0fGIE0G301851uG044000000800010L-0038 0 0ng. Phương pháp thu mẫu.---¿- 2 22 S22SE2EE2E22ESEE2EE2EE2E123212212112117121 21112112. 1 3,3,7, Phương pháp xử 19 HH. Fhương pháp phân lập ví KHUẨN: seeesesesnaiseeniadiosioLiovrilisokodiongrrutoitbi00840001000 06 23 3.

Phương pháp hoạt hóa giống .---- ¿22 2 122E2EE22E22EE2E1221221221221212212221221 2 xe 24 2751518N/01u010106ii701i7770707 7 ÖÒÔốẽẽaẽ. ố me neu ae emcee ees ẽ eee 25 3. Phương pháp đối kháng với chủng Vibrio Spp. 26 Su Be Thịt:ng niệm eet assoc sennsaaoeedkiioi0Aa dùGSu9sg1009400L44G010S80151/440001G04004/38000040020800I4GS00Hj.

Thur nghiém Oxidase 0., TUE mS Si. CEA oe aeseeomenoatere seemed vata te oat a weet teseathensesieniraeaRt 28 3. Thứ nghiệm lên men carbohrydrate. Phương pháp định danh bằng giải trình ty 16S rRNA.

KET QUA VÀ THẢO LUAN 0ooeocecceccecsscssessessessessessesessessetsessssessesseeseaseaeess 31 4. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn từ mau tôm ao và nước ao.------------- al ROM a Ng lbsseeegerendogrtrxitoetggcepcrs9l4tg9i6:GBLG500000G004610700900. Kết quả hoạt hóa chủng Vibrio spp. Khả năng: đồi kháng với.

Vibrio GDDse«eesssausaeeiieidSnlGiAk0àa 136 Eg880036. Định danh vi khuẩn .--2- + ++S+E+E£EE+E+E£EEEE+E+EEEEEEEEEEEEEEEEEEE21212111712111E1E2Exe 37 4. Kết qua thử nghiệm Catalase, oxidase và citrate. Kết quả lên men đường earbolrydtatienci:esacanzeicxsursencincnsexctnorvencencesennvrweverecanetevesvens 39 VI 4.

Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào.1 8 Pt danh sinh Wee THIÊN ẲssepseguainaiddidiatiagtttotritoidioiliSgS042800g0/0010n6304030Áã0gi8608 00a 40 4. KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ .- 2-2 s+E+EE£ESEE£ESEEEEEEEEErErrerrerees 44 5. - - +52 S21 3221212212121211212111121111 2111111112211 1121112121111111212121 121g 44 SC suagnannountrtginotilG0NGL0I00095000G800000400000001g05400/4G30t1GIG401I05GG(GG1g0050003301G014G00030046 44 TÀI LIEU THAM KHẢO. 2-2 2 52+S2+E£EE£EE£EE2EE2EEEE2212212112112111211211211111 1110 PHU LLỤC.---2-©2¿222222222E221127122112211221221127121121112111112112211211211211121121121121211211 e6 Phụ lục 1: Hình ảnh kết quả phân lập và làm thuần gồm 25 chủng từ mẫu nước ao và tôm Phụ lục 2: Kết quả đo ODøoonm của chủng Vibrio spp.----52-52-55-55255225222zcszcsccec Phụ lục 3: Kết quả đếm mật độ khuẩn lạc pha loãng 10; 10°, mỗi nồng độ 2 đĩa petr.

Phụ lục 4: Kết qua đếm mật độ khuẩn lạc pha loãng 10°; 105, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Phụ lục 5: Kết quả giải trình tự gen 16S bằng cặp mồi 27F — 1492R.-- --2-©+5++S22E22E22E221221211211121121121121211121121121 2y c6 Phụ lục 6: Kết quả kích thước kháng Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h theo phương pháp trực tiếp bằng khuẩn lạc.--- 2 +s+2S+SE+EE2E221221221221211211212111221211211212121121 1 e6 Phụ lục 7: Kết quả kích thước kháng Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h theo phương pháp trực tiếp bằng khuẩn lạc. 2222 5s+22222S22E22E2EE2EE2222522121222222222 22-5 Phụ lục 8: Kết quả kích thước kháng Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h theo phương Đ9È1)989)1000015197)001 02. Phụ lục 9: Kết quả kích thước kháng Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h theo PNR ñhp: dịch TO HÀ saxeeasseeeeebdiibidndA410u0lAi 0080 062000d0006018061883000/683088i/36440312923501200 4030:8085 VII DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT PCR Polymerase Chain Reaction LB Broth Luria Bertani Broth LBA Luria Bertani Agar MRS Man Rogosa Sharpe MRSA Man Rogosa Sharpe Agar TCBS Thiosulfate Citrate Bile Sucrose MHA Mueller Hinton Agar TSB Tryptic Soy Broth CMC Carboxymethyl Cellulose ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long EMS Early Mortality Syndrome AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease V.

parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus V. harveyi Vibrio harveyi LAB Lactic Acid Bacteria B. subtilis Bacillus subtilis OD Optical Density SCA Simmons Citrate Agar KTTB Kích thước trung bình Vill DANH SÁCH CAC BANG Bảng 3. Danh mục dụng cụ trong quá trình thực hiện | PP.

Danh mục thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài. Thành phần môi trường LB Brotth. -2- 2 222+2E22E£2EE2EE2EE2ZE2E22222222zxze 18 Bang 3. Thành phần môi trường MMRS.

2-2222 2S+SS2EE2E22E2E22122122122221221221221 22 Xe2 19 Bang 3. Thành phần môi trường TCBS. 22 2 2+SE+2E22E22EE2EE2EE22122522222222222x 19 Bảng 3. Thanh phần môi trường MHA.--22- 22 ©2222222E++EE+2EE+2E+2EE+2E2zZE+zzxzzzrez 20 Bang 3.

Thành phần môi trường TSB.-- 2 2222+2S22E22E22EE2EE22E221221223222222222xe.