Luận văn: Phân lập vi khuẩn Bifidobacteria ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotics

Luận văn nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng Bifidobacteria tiềm năng. Đánh giá đặc tính probiotic và khả năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng.

• Tác giả: Nguyễn Hoàng Tuấn
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Lương
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bifidobacteria ứng dụng trong sản xuất chế phẩm Probiotics
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Định Nghĩa và Tầm Quan Trọng của Bifidobacteria trong Probiotics

Bifidobacteria là một nhóm vi khuẩn lợi khuẩn quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất chế phẩm probiotics. Những vi khuẩn này có khả năng cư trú tự nhiên trong đường tiêu hóa con người, đặc biệt là trong ruột non và đại tràng. Phân lập và tuyển chọn Bifidobacteria là quá trình khoa học giúp xác định những chủng vi khuẩn có tiềm năng sử dụng cao nhất. Theo định nghĩa của WHO và FAO, probiotic là những vi khuẩn sống có lợi cho sức khỏe con người khi được sử dụng với liều lượng thích hợp. Bifidobacteria đáp ứng các tiêu chí GRAS (Generally Recognized as Safe) của FDA, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Vai trò của những vi khuẩn này trong việc cải thiện sức khỏe tiêu hóa, tăng cường miễn dịch và phòng ngừa các bệnh liên quan đến đường ruột là vô cùng quan trọng.

1.1. Tiêu Chí Lựa Chọn Chủng Bifidobacteria Tối Ưu

Việc tuyển chọn chủng Bifidobacteria cần tuân thủ các tiêu chí khắt khe về sinh học phân tử và đặc tính probiotic. Chủng được chọn phải có khả năng sinh enzyme ngoại bào, sản xuất axit hữu cơ và chịu được muối mật. Ngoài ra, cần kiểm tra khả năng kháng kháng sinh, tồn tại trong môi trường dạ dày và ruột mô phỏng. Các chủng tốt nhất cũng phải có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa hiệu quả.

1.2. Lợi Ích Sức Khỏe của Probiotics Bifidobacteria

Bifidobacteria probiotics mang lại nhiều lợi ích đáng kể cho sức khỏe. Chúng giúp giảm tiêu chảy, cải thiện không dung nạp lactose, ức chế Helicobacter pylori, phòng ngừa bệnh viêm ruột và giảm nguy cơ ung thư đại trực tràng. Các chế phẩm chứa Bifidobacteria đã được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới, chứng minh hiệu quả và độ an toàn cao.

II. Quy Trình Phân Lập và Phân Loại Bifidobacteria

Phân lập Bifidobacteria là bước đầu tiên trong quá trình phát triển chế phẩm probiotics. Quá trình này bao gồm việc lấy mẫu từ các nguồn tự nhiên như phân người, sữa mẹ hoặc các sản phẩm lên men truyền thống. Sau đó, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MRS (De Man Rogosa Sharpe) đặc biệt được thiết kế cho sự sinh trưởng tối ưu của Bifidobacteria. Phân loại sinh học phân tử sử dụng các kỹ thuật như 16S rDNA và xác định gen F-6-PPK đặc trưng để nhận dạng chính xác các chủng. Kỹ thuật FISH (Fluorescence In situ Hybridization) cũng được áp dụng để quan sát hình thái và xác nhận danh tính của vi khuẩn. Quá trình này đòi hỏi sự chính xác cao để đảm bảo chất lượng của chủng Bifidobacteria được chọn.

2.1. Lựa Chọn Môi Trường và Điều Kiện Nuôi Cấy

Điều kiện nuôi cấy Bifidobacteria phải được tối ưu hóa cẩn thận. Nhiệt độ tối ưu thường nằm trong khoảng 37-39°C, pH thích hợp từ 6,5-7,5, và các vi khuẩn này nhạy cảm với oxy nên cần môi trường yếm khí. Lựa chọn nguồn cacbon (như glucose, inulin) và nguồn nitơ phù hợp là rất quan trọng để đạt tốc độ sinh trưởng tối đa.

2.2. Xác Định Đặc Tính Sinh Lý Sinh Hóa

Đặc tính sinh lý sinh hóa của Bifidobacteria bao gồm khả năng sản xuất axit hữu cơ, sinh enzyme ngoại bào như amylase và cellulase. Việc đo mật độ quang học (OD) và số lượng CFU (Colony Forming Unit) giúp theo dõi sinh trưởng. Khả năng chịu muối mật (bile salt tolerance) là chỉ số quan trọng chứng minh vi khuẩn có thể sống sót trong ruột.

III. Đặc Tính Probiotic và Khả Năng Kháng Sinh của Bifidobacteria

Những đặc tính probiotic của Bifidobacteria là yếu tố quyết định trong việc tuyển chọn chủng tốt nhất. Các chủng được chọn phải có khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh như Salmonella, E. coli O157:H7 và Clostridium difficile thông qua sản xuất các chất kháng khuẩn tự nhiên. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa được mô phỏng bằng dịch dạ dày (pH 3,0) và dịch ruột (chứa muối mật) là rất quan trọng. Ngoài ra, khả năng chịu kháng sinh cũng được đánh giá để đảm bảo chúng không mang các gen kháng sinh có thể chuyển vào các tế bào khác. Những vi khuẩn Bifidobacteria chất lượng cao phải đạt được tất cả các tiêu chí này để đảm bảo hiệu quả và an toàn trong sản xuất chế phẩm probiotics thương mại.

3.1. Khả Năng Kháng Lại Vi Khuẩn Gây Bệnh

Bifidobacteria sản xuất các chất kháng khuẩn tự nhiên như axit lactic, axit acetic và các bacteriocin. Những chất này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của Helicobacter pylori và các vi khuẩn gây tiêu chảy khác. Nghiên cứu cho thấy chủng Bifidobacteria được chọn có thể kháng 90% vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa, góp phần cải thiện đáng kể sức khỏe ruột.

3.2. Khả Năng Chịu Đựng Môi Trường Tiêu Hóa

Khả năng tồn tại trong dịch dạ dày có pH 3,0-3,5 là thử thách lớn với vi khuẩn. Bifidobacteria chất lượng cao có thể sống sót 95-98% sau 3 giờ ở điều kiện dạ dày mô phỏng. Trong môi trường ruột mô phỏng chứa muối mật, chúng duy trì khả năng sinh trưởng và hoạt tính probiotic hiệu quả.

IV. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Lên Men và Ứng Dụng Thương Mại

Quá trình tối ưu hóa điều kiện lên men cho Bifidobacteria trên quy mô công nghiệp là bước quan trọng để sản xuất chế phẩm probiotics hiệu quả. Nghiên cứu cho thấy việc lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp (từ 200-300 vòng/phút) giúp duy trì môi trường yếm khí tối ưu trong thiết bị lên men. Tỷ lệ giống cấy ban đầu cần được xác định chính xác để đạt mật độ tế bào cao nhất (trên 10^9 CFU/mL). Thời gian nuôi cấy tối ưu thường từ 24-48 giờ tùy chủng vi khuẩn. Ngoài ra, việc lựa chọn chất mang thích hợp cho quá trình đông khô (freeze-drying) cũng quan trọng để bảo quản Bifidobacteria và duy trì tính sống sót của vi khuẩn. Các chế phẩm này có thể được ứng dụng trong sản xuất sữa lên men, thực phẩm chức năng và các bổ sung dinh dưỡng.

4.1. Lựa Chọn Điều Kiện Lên Men Trên Thiết Bị Công Nghiệp

Nghiên cứu trên thiết bị lên men 5 lít cho thấy chế độ khuấy đảo cần được điều chỉnh để cân bằng giữa cung cấp dinh dưỡng và duy trì môi trường yếm khí. Tỷ lệ giống cấy từ 5-10% mang lại kết quả tốt nhất. Việc kiểm soát pH bằng cách thêm các chất đệm buffer giúp duy trì sinh trưởng ổn định của Bifidobacteria và tối đa hóa sản xuất axit hữu cơ.

4.2. Bảo Quản và Ứng Dụng Sản Phẩm Cuối Cùng

Chất mang thích hợp như inulin, skim milk hoặc trehalose giúp bảo vệ vi khuẩn trong quá trình đông khô. Các chế phẩm probiotics Bifidobacteria được bảo quản ở nhiệt độ 4°C có thể duy trì tính sống sót 85-95% trong 12 tháng. Sản phẩm được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, từ sữa lên men, yogurt đến các bổ sung dinh dưỡng chức năng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Định nghĩa probiotic Probiotic xuất phát từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là "cho cuộc sống", ban đầu được nó được sử dụng với ý nghĩa trái ngược với từ "kháng sinh". Tuy nhiên, định nghĩa này đã được cải tiến trong những năm qua. Ban đầu, probiotic được mô tả là chất tăng cường sức khoẻ của bệnh nhân suy dinh dưỡng, kích thích sự phát triển của các vi sinh vật khác, hoặc góp phần vào cân bằng vi khuẩn đường ruột.

Các định nghĩa gần đây cho thấy rằng probiotic bao gồm các vi sinh vật sống [62]. Trong đó, định nghĩa của Fuller (1992) được sử dụng rộng rãi: “Probiotic như là một chất bổ sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột”. Theo khuyến cáo của một nhóm làm việc cho FAO / WHO về việc đánh giá probiotic trong thực phẩm, probiotic được định nghĩa là "các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi ích cho sức khoẻ"[23]. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic [62] Tiêu chuẩn an toàn  Có nguồn gốc rõ ràng.

 Xác định chính xác về phân loại.  Không độc hại, không gây bệnh, đạt tiêu chuẩn GRAS.  Đặc tính chủng: Chịu kháng sinh ở nồng độ thấp và có hoạt động trao đổi chất trong cơ thể vật chủ. Tính phù hợp về công nghệ  Có khả năng sản xuất và bảo quản số lượng lớn  Mật độ cao (ưu tiên 106 -108 CFU/ml,g).

 Mang lại các tính chất cảm quan mong muốn (hoặc không có những phẩm chất không mong muốn).  Ổn định di truyền.  Kháng Phage. 3 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia 20 Tiêu chuẩn chức năng  Kháng với muối mật và axit.

 Bám dính được vào bề mặt niêm mạc.  Có khả năng sống sót, tăng sinh và hoạt động trao đổi chất ở vị trí mục tiêu trong cơ thể sống.  Có khả năng sinh bacteriocin, axit hữu cơ và một số các chất kháng khuẩn để cạnh tranh với các vi khuẩn khác.  Có khả năng mang lại một hoặc nhiều lợi ích về sức khoẻ được kiểm chứng lâm sàng.

Tiêu chuẩn sinh lý và ảnh hưởng đến sức khỏe mong muốn  Phản ứng đối với vi khuẩn gây bệnh / ung thư.  Sản sinh các chất chống vi khuẩn (bacteriocin, hydrogen peroxide, axit hữu cơ hoặc hợp chất ức chế khác).  Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vắc-xin, peptide).  Cải thiện các phản ứng miễn dịch.

 Giảm dị ứng lactose.  Giảm cholesterol huyết thanh.  Phòng ngừa một số loại bệnh tiêu chảy. Lợi ích của probiotic Các tác động có lợi cho sức khoẻ của probiotic, được ghi nhận đối với một số chủng nhất định, bao gồm ngăn ngừa một số loại bệnh tiêu chảy, đặc biệt do rotavirus, giảm các triệu chứng liên quan đến việc sử dụng kháng sinh quá nhiều, giảm tỷ lệ dị ứng ở người dễ bị dị ứng, cải thiện đáp ứng miễn dịch, giảm hiện tượng không dung nạp lactose và giảm các chất chuyển hóa không có lợi.

Một số ảnh hưởng có lợi khác liên quan đến sức khoẻ, thông qua việc sử dụng probiotic như sau: phòng ngừa hoặc giảm triệu chứng viêm ruột mạn tính, giảm nguy cơ tiêu chảy cấp ở trẻ em, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường hô hấp, ức chế Helicobacter pylori và giảm cholesterol huyết thanh [45]. 4 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia 20 Hơn nữa, probiotic có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và các cơ quan khác bằng cách điều biến các thông số miễn dịch, tính thấm qua ruột hoặc bằng cách cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học. Các cơ chế được nghiên cứu bởi De Vrese và Schrezenmeir (2008) bao gồm: Giảm pH ruột; Sản xuất các chất diệt khuẩn (ví dụ axit hữu cơ, H2O2 và bacteriocin); Sự kết tụ các vi sinh vật gây bệnh; Tăng cường sự vững chắc cho các chất nền lên men hoặc thụ thể trên bề mặt tế bào niêm mạc ruột; Hấp thu và chuyển hóa các chất có khả năng gây bệnh, độc hại hoặc ung thư; Điều biến các cơ chế miễn dịch; Kích thích nhu động ruột và sản xuất chất nhầy [16]. Giới thiệu Năm 1899, Tissier quan sát và phân lập vi khuẩn hình chữ Y trong phân của trẻ sơ sinh bú mẹ và gọi nó là "Bacillus bifidus communis" (Lat.

Bifidus: đứt đoạn, phân nhánh). Tuy nhiên, do sự tương đồng với lactobacilli, bifidobacteria đã được đưa vào chi Lactobacillus. Và mãi cho đến khi đến khi hệ thống phân loại vi khuẩn mới của Bergey ra đời trong ấn bản cùng tên tái bản lần thứ VIII, chúng mới được phân loại lại và công nhận là một chi riêng. Khác với Lactobacillus, bifidobacteria có fructose-6-phosphate phosphoketolase, không có aldolase hoặc glucose-6-phosphate dehydrogenase và có hàm lượng G+C trong DNA cao nằm trong khoảng từ 55 đến 67%.

Bifidobacteria catalase âm tính, ngoại trừ B. Chi Bifidobacterium, gồm 42 loài, thuộc Họ Bifidobacteriaceae, Bộ Bifidobacteriales, Phân lớp Actinobacteridae, Lớp Actinobacteria, Ngành Firmicutes, Giới Vi khuẩn[7]. Hình thái Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, sống kỵ khí, không di động, không hình thành bào tử , tế bào thường cong, hình que phân nhánh, dạng đơn lẻ, xếp chuỗi hoặc tạo thành các cụm, dạng chữ “Y” hoặc “V” (Hình 1. 5 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia 20 Hình 1.1: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium [71] 1.

Sinh học phân tử Phân loại đến chi Bifidobacteria có enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK) (EC 4.22), tham gia vào quá trình phân huỷ glucose qua con đường phosphoketolase hay còn gọi là "bifid shunt" thông qua erythrose-4-phosphate và acetyl-phosphate, đây là điểm khác biệt với vi khuẩn đường ruột khác. Do đó enzyme này cũng như gen mã hóa cho nó được dùng để làm phân tử chỉ thị cho nhóm này [5]. Phân loại đến loài Sự khác biệt của các loài trong chi thường dựa vào sự đồng nhất DNA-DNA hoặc các đặc tính hình thái khác nhau. Trong những năm gần đây, sự chú ý của nhiều nhà khoa học về mặt phân loại đã được thu hút vào các đầu dò DNA và gen rRNA.

Các chuỗi DNA được sử dụng phổ biến nhất để nhận diện bifidobacteria ở chi và mức độ loài là gen 16S rRNA và 23S rRNA, cũng như vùng gen internal transcribed spacer (ITS) nằm giữa các gen rRNA 16S và 23S. Đặc biệt, trình tự rDNA 16S có 9 vùng biến đổi, đặc biệt thích hợp để thiết kế oligonucleotides dùng để định danh đến loài nhóm bifidobacteria. Ngoài ra, ưu điểm của việc sử dụng các gen rRNA là số lượng bản sao của chúng trong một tế bào vi khuẩn khá cao. Roy và cộng sự (1996) đã nghiên cứu thiết kế được các oligonucleotides dựa trên chuỗi 16S rDNA sử dụng cho B.

Sau đó, Matsuki và cộng sự (1998, 1999) đã 6 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia 20 thiết kế được các cặp primer đặc hiệu cho hầu hết các loài Bifidobacterium sống ở đường ruột của con người như: B. Ngoài phân tích trình tự rDNA 16S, SR 23S và 16S-23S, hiện nay để phân biệt các loài có mối quan hệ gần gũi cùng thuộc chi Bifidobacterium, trình tự gen của protein ưa nhiệt 60 kDa (HSP60) được sử dụng. HSP60 là một protein thuộc họ chaperonin, thành viên họ này có trong tất cả các vi khuẩn và tế bào eukaryote ở các cơ quan như ty thể và lục lạp, gen HSP60 không dễ dàng chuyển từ một vi khuẩn này sang vi khuẩn khác, tính bảo thủ cao và có một bản sao trong gần như tất cả các loài vi khuẩn, do đó rất đặc trưng cho từng loài vi khuẩn. Những đặc điểm trên cho thấy HSP60 một đại phân tử thích hợp cho nghiên cứu phát sinh loài của các loài vi khuẩn có mối quan hệ gần gũi với nhau.

7 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia 20 Hình 1.2: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA 16S [24] 8 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia 20 1. Môi trường sống Môi trường sống của bifidobacteria chủ yếu là trong đường ruột của động vật máu nóng. Đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh ở con người (chủ yếu là sâu răng) nhưng thường chúng được coi là không gây bệnh. Thông thường, các loài Bifidobacterium là đặc trưng đối với người và động vật; Ngoài ra, đã có nghiên cứu chứng minh rằng bifidobacteria có trong nước thải và trong các sản phẩm sữa lên men [6].

Ruột của trẻ sơ sinh bị xâm chiếm bởi vi sinh vật từ hệ sinh dục của người mẹ và môi trường bên ngoài. Ngoài ra, các nghiên cứu mới cho thấy việc di chuyển vi khuẩn từ tuyến ruột sang tuyến vú của người mẹ có thể là nguồn lây nhiễm cho sữa mẹ và dẫn đến sự lây lan sang ruột của trẻ sơ sinh [47]. Các nghiên cứu sử dụng công nghệ lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) cho thấy bifidobacteria chiếm tới 75% tổng số vi khuẩn trong phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và đến 91% trẻ bú sữa mẹ [28]. Theo thời gian số lượng bifidobacteria trong đường tiêu hoá của con người giảm dần, các vi sinh vật trong phân của trẻ em tương tự như người lớn sau hai năm đầu đời.

Ở người cao tuổi, số lượng bifidobacteria thấp hơn, trong khi số lượng Clostridium trong phân tăng lên [51]. 9 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia 20 Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium Loài Chủng Nguồn Phân lập từ người B. adolescentis ATCC15703T Phân, ruột thừa, răng bị sâu và âm đạo người lớn B. angulatum Phân người lớn B.

bifidum DSM 20215 Phân trẻ sơ sinh và phân, âm đạo JCM 1254 người trưởng thành NCIMB 41171 B. infantis ATCC 15697 Phân và âm đạo trẻ sơ sinh B. breve UCC2003 Phân và âm đạo trẻ sơ sinh B. catenulatum Phân người trưởng thành Phân lập từ động vật B.