Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học phân lập định danh và tuyển chọn các dòng vi khuẩn rhizobia có khả năng kích thích nảy mầm tăng trưởng ở quy mô phòng thí nghiệm

Khóa luận trình bày quy trình phân lập, định danh và tuyển chọn vi khuẩn rhizobia kích thích nảy mầm, tăng trưởng trong phòng thí nghiệm.

• Tác giả: Bùi Hoàng Nguyễn
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quang Vĩnh
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập và Tuyển Chọn Dòng Vi Khuẩn Rhizobia Kích Thích Nảy Mầm và Tăng Trưởng Cây Đậu
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• LỜI CAM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Rhizobia
• 2.2. Phân loại nhóm vi khuẩn cố định đạm
• 2.2.1. Vi khuẩn cố định đạm cộng sinh thuộc cây họ đậu
• 2.2.2. Vi khuẩn có định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu
• 2.2.3. Vi khuẩn cố định đạm sống tự do
• 2.3. Phân loại vi khuẩn Rhizobia
• 2.4. Hoạt chất điều hòa sinh trưởng ở Rhizobia
• 2.4.1. Chất điều hòa sinh trưởng IAA
• 2.4.2. Hoạt chất thứ cấp Siderophores
• 2.5. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobia trên thế giới và tại Việt Nam
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3. Thu mẫu nốt san rễ và phân lập
• 3.4. Đánh giá về hình thái, sinh hóa và định danh sinh học
• 3.5. Đánh giá đặc điểm sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn Rhizobia
• 3.6. Khảo sát khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các dòng Rhizobia
• 3.7. Đánh giá khả năng kích thích của các dòng Rhizobia lên sự nảy mầm và tăng trưởng của hạt đậu ở điều kiện phòng thí nghiệm
• 3.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thu mẫu nốt san rễ và phân lập vi khuẩn
• 4.2. Hình thái các dòng vi khuẩn Rhizobia được phân lập
• 4.3. Phân loại gram các dòng vi khuẩn đã chọn lọc từ môi trường YMCA
• 4.4. Định danh các dòng vi khuẩn phân lập bằng sinh học phân tử
• 4.5. Đánh giá đặc điểm sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn Rhizobia
• 4.5.1. Đánh giá khả năng phát triển trong điều kiện pH thay đổi
• 4.5.2. Đánh giá khả năng phát triển trong điều kiện nhiệt độ thay đổi
• 4.5.3. Đánh giá khả năng phát triển trong điều kiện mặn
• 4.5.4. Khả năng tiết axit/kiềm bằng chỉ thị màu Bromothymol Blue
• 4.5.5. Ghi nhận sử dụng nguồn đường glucose của vi khuẩn Rhizobia
• 4.6. Khả năng tổng hợp IAA từ vi khuẩn Rhizobia
• 4.7. Khả năng tổng hợp Siderophores của vi khuẩn Rhizobia
• 4.8. Hiệu quả kích thích nảy mầm lên hạt đậu của các dòng Rhizobia
• 4.9. Hiệu quả của các dòng Rhizobia lên khả năng kích thích sinh trưởng đậu ở điều kiện phòng thí nghiệm
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vi Khuẩn Rhizobia Và Vai Trò Của Chúng

Vi khuẩn Rhizobia là nhóm vi khuẩn có khả năng cố định đạm, sống cộng sinh với cây họ đậu. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng đất và tăng năng suất cây trồng. Việc phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn này có thể giúp nâng cao hiệu quả nông nghiệp bền vững.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Vi Khuẩn Rhizobia

Vi khuẩn Rhizobia thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần trên rễ cây họ đậu. Chúng có khả năng cố định nitơ từ không khí, cung cấp nguồn đạm cho cây trồng.

1.2. Phân Loại Các Dòng Vi Khuẩn Rhizobia

Các dòng vi khuẩn Rhizobia được phân loại thành nhiều chi khác nhau như Rhizobium, Bradyrhizobium, và Ensifer. Mỗi chi có những đặc điểm sinh lý và sinh hóa riêng biệt.

II. Vấn Đề Trong Việc Sử Dụng Vi Khuẩn Rhizobia Trong Nông Nghiệp

Mặc dù vi khuẩn Rhizobia mang lại nhiều lợi ích, nhưng việc sử dụng chúng trong nông nghiệp vẫn gặp phải một số thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, sự cạnh tranh với vi sinh vật khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của chúng.

2.1. Thách Thức Về Điều Kiện Môi Trường

Điều kiện môi trường như độ pH, nhiệt độ và độ ẩm có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn Rhizobia. Việc nghiên cứu các điều kiện tối ưu là cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng.

2.2. Sự Cạnh Tranh Với Vi Sinh Vật Khác

Vi khuẩn Rhizobia có thể phải cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong đất, điều này có thể làm giảm khả năng cố định đạm và ảnh hưởng đến sự phát triển của cây trồng.

III. Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Dòng Vi Khuẩn Rhizobia

Phương pháp phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn Rhizobia bao gồm thu thập mẫu nốt sần, nuôi cấy trên môi trường thích hợp và đánh giá khả năng sinh trưởng. Các phương pháp này giúp xác định các dòng vi khuẩn có khả năng kích thích nảy mầm và tăng trưởng cây đậu.

3.1. Quy Trình Thu Thập Mẫu Nốt Sần

Mẫu nốt sần được thu thập từ rễ cây họ đậu tại các vùng khác nhau. Việc chọn lọc mẫu từ các vùng có điều kiện sinh thái khác nhau giúp tăng tính đa dạng của các dòng vi khuẩn.

3.2. Đánh Giá Khả Năng Sinh Trưởng Của Các Dòng Vi Khuẩn

Khả năng sinh trưởng của các dòng vi khuẩn được đánh giá thông qua các chỉ tiêu như khả năng chịu mặn, chịu nhiệt và khả năng sản xuất các hợp chất sinh học như IAA và siderophores.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Vi Khuẩn Rhizobia Trong Nông Nghiệp

Vi khuẩn Rhizobia không chỉ giúp tăng trưởng cây trồng mà còn cải thiện chất lượng đất. Việc ứng dụng các dòng vi khuẩn này trong sản xuất nông nghiệp có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng phân hóa học, từ đó bảo vệ môi trường.

4.1. Tăng Trưởng Cây Đậu Nhờ Vi Khuẩn Rhizobia

Nghiên cứu cho thấy các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng kích thích nảy mầm và tăng trưởng chiều dài thân và rễ của cây đậu xanh và đậu nành.

4.2. Cải Thiện Chất Lượng Đất

Vi khuẩn Rhizobia giúp cải thiện cấu trúc đất và tăng cường độ phì nhiêu, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loại cây trồng khác.

V. Kết Luận Về Tương Lai Của Vi Khuẩn Rhizobia Trong Nông Nghiệp

Vi khuẩn Rhizobia có tiềm năng lớn trong việc phát triển nông nghiệp bền vững. Nghiên cứu và ứng dụng các dòng vi khuẩn này sẽ góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường.

5.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các dòng vi khuẩn Rhizobia, đặc biệt là khả năng thích ứng với các điều kiện môi trường khác nhau để tối ưu hóa hiệu quả sử dụng.

5.2. Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học

Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển các chế phẩm từ vi khuẩn Rhizobia sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây họ đậu (Fabaceae/Leguminosae) giữ vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và đời sống nhờ giá trị dinh dưỡng cao, khả năng thích ứng đa dạng và vai trò cải tạo đất. Tuy nhiên, tập quán canh tác truyền thống hiện nay lạm dụng phân bón vô cơ (đặc biệt là phân đạm hóa học) cùng các chất kích thích sinh trưởng tổng hợp nhằm rút ngắn chu kỳ thu hoạch. Việc này dẫn đến suy thoái cấu trúc đất, tồn dư hóa chất độc hại trong nông sản và ô nhiễm nguồn nước ngầm do rửa trôi nitrat. Do đó, xu hướng nông nghiệp sinh học bền vững đặt trọng tâm vào việc khai thác nguồn vi sinh vật bản địa vùng rễ có khả năng cố định nitơ tự do và tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng tự nhiên.

Vi khuẩn Rhizobia thuộc nhóm $\alpha$-Proteobacteria sống cộng sinh tạo nốt sần ở rễ cây họ đậu, cung cấp từ 50% đến 70% tổng nhu cầu đạm của cây, đồng thời tiết ra các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học như Indole-3-Acetic Acid (IAA) và siderophores giúp cây phát triển và tăng sức đề kháng sinh học. Nhằm khai thác nguồn gen vi sinh vật bản địa phục vụ định hướng sản xuất phân bón vi sinh, đề tài "Phân lập, định danh và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng kích thích nảy mầm, tăng trưởng ở quy mô phòng thí nghiệm" được thực hiện bởi sinh viên Bùi Hoàng Nguyên (Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh) dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Quang Vinh và ThS. Đào Uyên Trân Đa.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể:

1. Phân lập và định danh ở mức độ loài các dòng vi khuẩn Rhizobia cộng sinh trên cây họ đậu tại khu vực các tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và TP. Cần Thơ bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
2. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học (IAA, siderophores), kích thích nảy mầm và tăng trưởng cây họ đậu, đồng thời khảo sát khả năng chống chịu điều kiện bất lợi (pH, nhiệt độ, độ mặn) ở quy mô phòng thí nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Nốt sần rễ thu thập từ các loài cây họ đậu phổ biến (đậu phộng, đậu đen, đậu xanh, đậu đỏ, đậu trắng, đậu đũa); hai giống đậu kiểm chứng sinh học gồm đậu tương DT2008 và đậu xanh DX2008 thu hoạch tại Đồng Nai ngày 25/05/2023.
• Phạm vi không gian: Mẫu nốt sần được thu thập tại huyện Trảng Bom (tỉnh Đồng Nai), Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long - quận Ô Môn (TP. Cần Thơ) và xã Gáo Giồng - huyện Cao Lãnh (tỉnh Đồng Tháp). Quá trình thực nghiệm được triển khai tại Phòng Nghiên cứu, Chi nhánh Trung tâm Nghiên cứu - Phát triển, Công ty Cổ phần Phân bón Dầu khí Cà Mau.
• Phạm vi thời gian: Đề tài thực hiện từ ngày 02/02/2023 đến ngày 01/07/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại học

Khóa luận tổng quan hệ thống phân loại nhóm vi khuẩn cố định đạm theo Saharan và Nehra (2011), Weir (2016), phân chia thành các nhóm cộng sinh bắt buộc với cây họ đậu (Rhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer, Mesorhizobium, Microvirga, Burkholderia...), cộng sinh không thuộc họ đậu (Frankia, vi khuẩn lam), vi khuẩn sống tự do hoặc nội sinh (Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas fluorescens...). Cơ chế xâm nhiễm qua lông hút rễ dưới tác động của chất dẫn dụ sinh học (flavonoid) tạo thành sợi xâm nhiễm và biệt hóa thành thể giả khuẩn (bacteroid) trong nốt sần được hệ thống hóa.

Cơ sở sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng tập trung vào hai chất chuyển hóa thứ cấp:

• Indole-3-Acetic Acid (IAA): Phytohormone thuộc nhóm auxin được vi sinh vật tổng hợp qua tiền chất L-Tryptophan, thúc đẩy sự giãn nở và phân chia tế bào rễ, tăng hấp thu dưỡng chất.
• Siderophores: Phối tử liên kết sắt có ái lực cao với $Fe^{3+}$, khử thành $Fe^{2+}$ giúp cây trồng dễ hấp thu, đồng thời cạnh tranh sắt với vi nấm gây bệnh và giảm độc tính kim loại nặng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm được thiết kế theo các tiêu chuẩn vi sinh và sinh học phân tử:

• Thu mẫu và phân lập: Đào rễ ở độ sâu 20 cm, rộng 15 cm; khử trùng bề mặt nốt sần nguyên vẹn bằng ethanol 95% trong 10 giây, hydrogen peroxide ($H_2O_2$) 3% trong 3 phút, rửa 6 lần bằng nước cất vô trùng; nghiền nốt sần trong dung dịch NaCl 0,85%, pha loãng bậc 10 ($10^{-2}$ đến $10^{-4}$) và cấy trải trên môi trường Yeast Extract Mannitol Congo Red Agar (YMCA) bổ sung 4 g/L $CaCO_3$, ủ ở 28°C trong 3–7 ngày. Bảo quản thuần trong glycerol 20% ở -80°C.
• Quan sát hình thái và nhuộm Gram: Đánh giá đặc điểm khuẩn lạc (màu sắc, độ trong, độ nhầy, đường viền); nhuộm Gram theo phương pháp chuẩn với bộ kít Nam Khoa, quan sát ở vật kính 40X.
• Định danh phân tử: Ly trích DNA bằng bộ kít GeneAll Exgene Cell SV mini Kit. Khuếch đại vùng V3 đoạn gen 16S rDNA (~1.400 bp) bằng phản ứng PCR (30 chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi 60°C) sử dụng cặp mồi 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 1389R (5’-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3’) với hóa chất OneTaq 2X Master Mix (NEB - Mỹ). Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm GelRed, tinh sạch bằng Expin Combo GP (GeneAll) và gửi giải trình tự tại First BASE (Malaysia). Phân tích độ tương đồng bằng công cụ BLAST (NCBI) và thiết lập cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA X.
• Khảo sát đặc tính sinh lý - sinh hóa:
  • Thử nghiệm pH: Nuôi cấy trong môi trường YMB ở các mức pH 4,0; 4,5; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 8,5; 9,0 trong đĩa 16 giếng, cấy trải kiểm tra trên YMA, đánh giá thang điểm cảm quan 0–5.
  • Thử nghiệm nhiệt độ: Cấy trải trên YMA, ủ ở 5°C, 15°C, 28°C, 40°C, 48°C trong 2–7 ngày.
  • Thử nghiệm chịu mặn: Nuôi cấy trên YMA bổ sung NaCl ở các nồng độ 0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%.
  • Thử nghiệm tiết axit/kiềm: Môi trường YMB-BTB bổ sung chỉ thị màu Bromothymol Blue 0,025 g/L (chuyển vàng: sinh axit; chuyển xanh lam: sinh kiềm).
  • Sử dụng glucose: Nuôi cấy đối chứng trên môi trường Glucose Peptone Agar (GPA) để phân biệt với Agrobacterium sp.
• Định lượng hoạt chất sinh học:
  • Định lượng IAA: Theo tiêu chuẩn TCVN 10784:2015, nuôi cấy vi khuẩn trong YMB bổ sung 0,1% L-Tryptophan ở 28°C trong 7 ngày, ly tâm thu dịch nổi, phản ứng với thuốc thử Salkowski (1:4 v/v), ủ tối 25 phút, đo mật độ quang ở bước sóng 530 nm, tính toán qua đường chuẩn $y = ax + b$ ($R^2 > 0,95$).
  • Định lượng siderophores: Phương pháp Chrome Azurol S (CAS), ly tâm dịch nuôi 7 ngày, chỉnh pH 2,0 bằng HCl 6N, phối trộn với thuốc thử CAS tỉ lệ 1:1, thêm CAS shuttle solution, ủ tối 30 phút, đo OD ở 630 nm, tính hàm lượng tương đối theo công thức $%SU = [(Ar - As) / Ar] \times 100$.
• Đánh giá sinh học trên cây đậu:
  • Thí nghiệm nảy mầm: Ngâm 30 hạt đậu xanh DX2008 và đậu tương DT2008 trong dịch huyền phù vi khuẩn 4 giờ, ủ ẩm trong đĩa petri vô trùng ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, đếm tỉ lệ nảy mầm sau 36 giờ.
  • Thí nghiệm tăng trưởng cây con: Chuyển 10 hạt mầm đậu xanh đồng đều (dài ~1 cm) vào ống nghiệm chứa 10 mL thạch agar 1%, nuôi 7 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm; đo chiều dài thân và chiều dài rễ chính.
• Xử lý số liệu: Phân tích phương sai một yếu tố (One-Way ANOVA) và kiểm định phân tách trung bình Tukey's HSD trên phần mềm Minitab 16.4 và Microsoft Excel.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Mở đầu

Chương này thiết lập tính cấp thiết của việc tìm kiếm giải pháp sinh học thay thế phân bón hóa học trong canh tác cây họ đậu. Tác giả xác định rõ mục tiêu phân lập, định danh phân tử và sàng lọc các dòng Rhizobia bản địa có hoạt tính sinh học cao tại 3 tỉnh phía Nam (Đồng Nai, Cần Thơ, Đồng Tháp), phục vụ công tác nghiên cứu phát triển chế phẩm vi sinh nông nghiệp tại Công ty Cổ phần Phân bón Dầu khí Cà Mau.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Nội dung chương tổng hợp hệ thống lý thuyết về:

• Phân loại học vi khuẩn cố định đạm, đặc điểm hình thái và sinh thái học của Rhizobia.
• Cơ chế hình thành nốt sần, quan hệ cộng sinh trao đổi dinh dưỡng giữa vi khuẩn và thực vật chủ.
• Vai trò nông học của Rhizobia: cung cấp đạm sinh học, hòa tan lân, tiết auxin (IAA), siderophores, hỗ trợ cây chống chịu kim loại nặng và kiểm soát sinh học nấm bệnh.
• Lược khảo các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về tuyển chọn vi sinh vật sản xuất IAA và kích thích sinh trưởng cây trồng (lúa, ngô, đậu tương, rau muống, hoa lan, cà phê...).

Chương 3. Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện vật chất, nguồn gốc mẫu rễ thực vật, danh mục hóa chất, môi trường nuôi cấy (YMCA, YMA, YMB, GPA, YMB-BTB) và quy trình 4 nội dung thực nghiệm:

1. Thu thập nốt sần và phân lập vi sinh vật.
2. Định danh phân tử bằng giải trình tự vùng V3 đoạn gen 16S rDNA.
3. Đánh giá đặc tính sinh lý - sinh hóa (pH, nhiệt độ, độ mặn, BTB, GPA) và định lượng hoạt chất sinh học (IAA, siderophores).
4. Khảo nghiệm tác động in vitro lên khả năng nảy mầm và kéo dài thân/rễ đậu xanh, đậu tương.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương kết quả trình bày chi tiết các dữ liệu thực nghiệm qua từng bước sàng lọc:

• Thu mẫu và phân lập: Thu nhận 10 nhóm mẫu nốt sần từ 6 loài đậu tại Đồng Nai, Cần Thơ và Đồng Tháp, phân lập được tổng cộng 59 dòng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc khác biệt trên môi trường YMCA (màu trắng đục, hồng nhạt, hồng đậm, cam đỏ do mức độ hấp thụ Congo red khác nhau).
• Phân loại Gram và chọn lọc: Thử nghiệm nhuộm Gram xác định 39/59 dòng là trực khuẩn Gram âm (chiếm 66%), loại bỏ 20 dòng Gram dương.
• Định danh phân tử 16S rDNA: Tinh sạch sản phẩm PCR ~1.400 bp của 39 dòng Gram âm và giải trình tự; kết quả đối chiếu cơ sở dữ liệu NCBI BLAST xác định được 15 dòng vi khuẩn có mức độ tương đồng cao ($\ge 98%$) thuộc nhóm Rhizobia và các chủng vi khuẩn vùng rễ liên quan:
  • 06 dòng thuộc chi Rhizobium: M-8 (R. mesoamericanum - 98,07%), M-18 (R. vallis - 98,75%), M-30 (Rhizobium sp. - 98,38%), M-51 (R. grahamii - 98,93%), M-55 (R. pusense - 98,56%), M-56 (R. miluonense - 98,67%).
  • 03 dòng thuộc loài Ensifer adhaerens: M-3 (98,67%), M-4 (98,92%), M-5 (98,23%).
  • 03 dòng thuộc loài Pseudomonas fluorescens: M-43 (98,97%), M-57 (98,42%), M-59 (98,86%).
  • 01 dòng thuộc loài Bradyrhizobium liaoningense: M-39 (98,20%).
  • 01 dòng thuộc chi Microvirga: M-16 (Microvirga sp. - 98,60%).
  • 01 dòng thuộc chi Ochrobactrum: M-2 (Ochrobactrum sp. - 98,01%).
• Cây phát sinh loài (MEGA X): Phân chia 15 dòng thành 2 nhánh tiến hóa chính: Nhánh 1 gồm Pseudomonas fluorescens (M-43, M-57, M-59) và Bradyrhizobium liaoningense (M-39); Nhánh 2 gồm Ensifer adhaerens (M-3, M-4, M-5), Ochrobactrum sp. (M-2), các phân nhóm Rhizobium sp. (M-8, M-18, M-51, M-56, M-30, M-55) và Microvirga sp. (M-16).
• Khảo sát đặc tính sinh lý - sinh hóa:
  • pH: 100% dòng phát triển tối ưu ở pH 6,0–8,0. Bốn dòng M-2, M-55, M-57, M-59 phát triển ổn định trên dải pH rộng từ 4,0 đến 9,0. Các dòng Ensifer adhaerens không phát triển được ở pH $\le 4,5$.
  • Nhiệt độ: 100% dòng phát triển mạnh nhất ở 28°C (cấp 5/5); 67% (10/15 dòng) duy trì sinh trưởng ở 40°C; không dòng nào tồn tại ở 5°C hoặc 48°C. Bốn dòng (M-30, M-55, M-57, M-59) có khả năng sinh trưởng ở 15°C.
  • Độ mặn: Đa số dòng chịu mặn kém ($\le 2%$ NaCl). Riêng dòng M-43 (Pseudomonas fluorescens) thể hiện khả năng chịu mặn nổi bật: sinh trưởng tốt ở 2% (cấp 4), 4% (cấp 3), 6% (cấp 4) và duy trì sống ở 8% NaCl (cấp 1).
  • Chỉ thị BTB: 11/15 dòng sinh axit làm môi trường chuyển màu vàng (trong đó M-2, M-8, M-16, M-51 sinh axit mạnh); 4/15 dòng sinh kiềm làm chuyển màu xanh lam.
• Khả năng tổng hợp hoạt chất sinh học:
  • Dòng M-18 (Rhizobium vallis) đạt khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất với hàm lượng $118,21\ \mu\text{g/mL}$.
  • Dòng M-56 (Rhizobium miluonense) đạt hoạt tính tổng hợp siderophores cao nhất với $93,07\ %SU$.
• Thử nghiệm sinh học in vitro:
  • Nảy mầm: Các chủng Rhizobia không tạo ra sai khác có ý nghĩa thống kê đối với hạt đậu xanh, nhưng cải thiện rõ rệt tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương, nổi bật là nhóm Ensifer adhaerens (M-3, M-4, M-5).
  • Tăng trưởng mầm đậu xanh (7 ngày): Đa số các dòng tạo sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) so với đối chứng. Các dòng thuộc chi Ensifer, Pseudomonas và Ochrobactrum có xu hướng kích thích kéo dài chiều cao thân, trong khi các dòng thuộc chi Rhizobium thúc đẩy mạnh sự phát triển chiều dài rễ.

Chương 5. Kết luận và đề nghị

Tổng kết toàn bộ các kết quả định danh và tuyển chọn dòng tiềm năng; đề xuất phương hướng thử nghiệm diện rộng ở quy mô nhà lưới, đánh giá hiệu lực trên các loại đất nhiễm phèn, nhiễm mặn thực tế.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu thập, sàng lọc và cung cấp bộ dữ liệu hoàn chỉnh về đặc tính sinh học của 15 dòng vi khuẩn nốt sần bản địa tại khu vực phía Nam.

Bảng tổng hợp các dòng vi khuẩn tuyển chọn và đặc tính sinh học

Ký hiệu	Định danh phân tử NCBI BLAST	Tỷ lệ tương đồng (%)	Nguồn gốc mẫu phân lập	Khả năng thích ứng môi trường tiêu biểu	Hoạt tính sinh học nổi bật
M-18	Rhizobium vallis	98,75%	Đồng Nai (Đậu phộng)	Phát triển tốt ở pH 4,0–9,0; nhiệt độ 28°C	Sinh tổng hợp IAA cao nhất ($118,21\ \mu\text{g/mL}$); kích thích rễ
M-56	Rhizobium miluonense	98,67%	Đồng Tháp (Đậu xanh)	Chịu mặn 2% NaCl; pH 5,0–9,0	Tổng hợp siderophores cao nhất ($93,07\ %SU$)
M-43	Pseudomonas fluorescens	98,97%	Đồng Tháp (Đậu đũa)	Chịu mặn vượt trội từ 2% đến 8% NaCl; pH 5,0–9,0	Kích thích tăng trưởng chiều cao thân cây mầm
M-3	Ensifer adhaerens	98,67%	Đồng Nai (Đậu phộng)	Ưa kiềm (pH 6,0–9,0); chịu nhiệt 40°C	Tăng tỷ lệ nảy mầm hạt đậu tương; kích thích thân
M-4	Ensifer adhaerens	98,92%	Đồng Nai (Đậu phộng)	Ưa kiềm (pH 6,0–9,0); phát triển tốt ở 28°C	Tăng tỷ lệ nảy mầm hạt đậu tương
M-5	Ensifer adhaerens	98,23%	Đồng Nai (Đậu phộng)	Ưa kiềm (pH 6,0–9,0); chịu nhiệt 40°C	Tăng tỷ lệ nảy mầm hạt đậu tương; kích thích thân
M-2	Ochrobactrum sp.	98,01%	Đồng Nai (Đậu phộng)	Dải pH 4,0–9,0; chịu mặn 2% NaCl; sinh axit mạnh	Kích thích tăng trưởng chiều cao thân mầm đậu
M-55	Rhizobium pusense	98,56%	Đồng Tháp (Đậu trắng)	Dải pH 4,0–9,0; chịu nhiệt 15–40°C; chịu mặn 2%	Thúc đẩy kéo dài hệ rễ đậu xanh
M-57	Pseudomonas fluorescens	98,42%	Đồng Tháp (Đậu xanh)	Dải pH 4,0–9,0; chịu lạnh 15°C; chịu mặn 2%	Kích thích phát triển thân mầm
M-59	Pseudomonas fluorescens	98,86%	Đồng Tháp (Đậu xanh)	Dải pH 4,0–9,0; chịu lạnh 15°C; chịu mặn 2%	Kích thích phát triển thân mầm

Đóng góp thực tiễn và khoa học

• Cung cấp nguồn giống bản địa: Khóa luận bổ sung 15 dòng vi sinh vật nốt sần có dữ liệu giải trình tự 16S rDNA vào ngân hàng chủng vi sinh vật phục vụ nông nghiệp, chứng minh sự đa dạng của các loài Rhizobium, Ensifer, Pseudomonas, Ochrobactrum, Microvirga, Bradyrhizobium trên đất trồng đậu tại Đồng Nai, Cần Thơ, Đồng Tháp.
• Phát hiện các chủng có đặc tính chống chịu chuyên biệt: Xác định dòng M-43 (Pseudomonas fluorescens) có khả năng sinh trưởng ở nồng độ mặn lên đến 8% NaCl và các dòng M-2, M-55, M-57, M-59 thích ứng dải pH rộng (4,0–9,0), tạo tiền đề nghiên cứu chế phẩm cho vùng đất phèn mặn Đồng bằng sông Cửu Long.
• Xác lập tiềm năng ứng dụng phân bón sinh học: Định lượng thành công chủng M-18 sinh IAA cao ($118,21\ \mu\text{g/mL}$) và M-56 sinh siderophores ($93,07\ %SU$), chứng minh hiệu quả phân hóa chức năng rõ rệt giữa kích thích kéo dài thân (Ensifer, Pseudomonas) và kích thích hệ rễ (Rhizobium).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Các khảo nghiệm sinh học kích thích nảy mầm và sinh trưởng mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro) trên môi trường đĩa petri và ống nghiệm thạch agar 1% trong thời gian 7 ngày.
  • Chưa đánh giá hiệu lực cộng sinh hình thành nốt sần thực tế và khả năng cạnh tranh sinh thái của các dòng vi khuẩn trong điều kiện đất tự nhiên có hệ vi sinh vật bản địa phức tạp.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng thử nghiệm hiệu lực sinh học của các dòng tuyển chọn (M-18, M-56, M-43, M-3, M-5) trong điều kiện chậu cát, nhà lưới và ngoài đồng ruộng.
  • Khảo sát khả năng phối trộn đa chủng vi sinh vật (consortium) nhằm tận dụng đồng thời khả năng kích thích thân và kích thích rễ.
  • Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men mật số cao và lựa chọn cơ chất chất mang (than bùn, bã mía, biochar) để hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột hoặc lỏng.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa học Cây trồng, Nông học và Vi sinh học ứng dụng: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết từ khâu xử lý nốt sần rễ, kỹ thuật cấy trang phân lập trên môi trường chọn lọc YMCA, các bước tách chiết DNA, chạy PCR mồi 27F/1389R đến các phương pháp trắc quang định lượng IAA (Salkowski) và siderophores (CAS).
• Cán bộ nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp phân bón, chế phẩm sinh học: Cung cấp thông số sàng lọc thực tế về khả năng chịu mặn, biên độ pH, nhiệt độ và hiệu lực tác động in vitro của các chủng vi khuẩn nốt sần bản địa tại miền Nam Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Dòng vi khuẩn nào trong nghiên cứu có khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA cao nhất và hàm lượng đạt bao nhiêu?

Dòng vi khuẩn ký hiệu M-18, được định danh là Rhizobium vallis (phân lập từ nốt sần cây đậu phộng tại huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai với độ tương đồng 98,75%), có khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất trong 15 dòng khảo sát, đạt hàm lượng $118,21\ \mu\text{g/mL}$ sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường YMB bổ sung 0,1% L-Tryptophan.

2. Dòng vi khuẩn nào thể hiện khả năng chịu mặn cao nhất và thích ứng ở những nồng độ muối nào?

Dòng vi khuẩn M-43, được định danh là Pseudomonas fluorescens (phân lập từ cây đậu đũa tại tỉnh Đồng Tháp với độ tương đồng 98,97%), có khả năng chịu mặn vượt trội so với các dòng còn lại: phát triển tốt ở các nồng độ NaCl 2% (cấp 4/5), 4% (cấp 3/5), 6% (cấp 4/5) và vẫn duy trì khả năng sinh trưởng ở nồng độ NaCl 8% (cấp 1/5).

3. Từ 59 dòng phân lập ban đầu, quy trình đã sàng lọc và xác định được bao nhiêu dòng thuộc nhóm vi khuẩn Rhizobia?

Từ 59 dòng phân lập dựa trên hình thái khuẩn lạc trên môi trường YMCA, tác giả nhuộm Gram và chọn ra 39 dòng Gram âm (chiếm 66%). Qua phân tích trình tự vùng V3 gen 16S rDNA và tra cứu cơ sở dữ liệu NCBI BLAST, có 15 dòng vi khuẩn được xác định thuộc nhóm Rhizobia và các chủng vi khuẩn vùng rễ liên quan (gồm 6 dòng Rhizobium, 3 dòng Ensifer adhaerens, 3 dòng Pseudomonas fluorescens, 1 dòng Bradyrhizobium liaoningense, 1 dòng Microvirga sp. và 1 dòng Ochrobactrum sp.) với độ tương đồng $\ge 98%$.

4. Tác động kích thích nảy mầm của các dòng vi khuẩn lên hạt đậu xanh và đậu tương khác nhau như thế nào?

Thực nghiệm ghi nhận các dòng vi khuẩn Rhizobia không tạo ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ nảy mầm đối với hạt đậu xanh DX2008 so với đối chứng nước cất. Tuy nhiên, trên hạt đậu tương DT2008, nghiệm thức xử lý vi khuẩn tạo ra sự khác biệt rõ rệt, đặc biệt các dòng thuộc loài Ensifer adhaerens (M-3, M-4 và M-5) giúp gia tăng đáng kể tỷ lệ nảy mầm của hạt sau 36 giờ ủ tối.

5. Sự khác biệt về khả năng kích thích tăng trưởng thân và rễ cây đậu xanh giữa các chi vi khuẩn được ghi nhận ra sao?

Sau 7 ngày nuôi cấy in vitro trên thạch agar 1%, các dòng vi khuẩn thuộc chi Ensifer sp. (M-3, M-5), Pseudomonas sp. (M-43, M-57, M-59) và Ochrobactrum sp. (M-2) thể hiện ưu thế vượt trội trong việc kích thích kéo dài chiều cao thân cây con, trong khi các dòng thuộc chi Rhizobium sp. (đặc biệt là M-18 và M-55) lại thúc đẩy mạnh mẽ sự phân nhánh và phát triển chiều dài rễ chính.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Bùi Hoàng Nguyên đã phân lập thành công 59 dòng vi sinh vật nốt sần từ 3 tỉnh phía Nam và định danh được 15 dòng thuộc nhóm Rhizobia cùng các vi khuẩn vùng rễ hữu ích qua phân tích trình tự 16S rDNA. Nghiên cứu đã xác định được dòng M-18 (Rhizobium vallis) có năng lực sinh IAA cao nhất ($118,21\ \mu\text{g/mL}$), dòng M-56 (Rhizobium miluonense) sinh siderophores mạnh nhất ($93,07\ %SU$) và dòng M-43 (Pseudomonas fluorescens) có khả năng chống chịu độ mặn tới 8% NaCl. Các kết quả khảo nghiệm in vitro làm sáng tỏ vai trò kích thích sinh trưởng thân rễ đặc thù của từng nhóm vi khuẩn, cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm và nguồn giống vi sinh vật bản địa phục vụ hướng phát triển chế phẩm sinh học trong nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Cây họ đậu có giá trị cao về mặt đinh dưỡng, kinh tế và đóng vai trò quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp. Các cây họ đậu phé biến như đậu phộng, đậu đen, đậu xanh, và đậu đỏ được trồng trên điện rộng và có mức tiêu thụ cao vì chúng dé canh tác, dễ chế biến, giàu giá trị dinh dưỡng, đặc biệt đối với sản xuất thực phẩm dành cho người ăn chay. Trong canh tác, người nông dân thường lạm dụng việc sử dụng phân hóa học, đặc biệt là phân đạm và các chất kích thích sinh trưởng nhằm rút ngắn thời gian trồng trọt, thu được năng suất và lợi nhuận cao. Điều này dẫn đến sự tồn dư chất độc gây hại trong đất cũng như trong sản phẩm, gây ảnh hưởng tiêu cực cho môi trường và con người.

Do đó, nhu cầu về thực phẩm sạch, an toàn nhưng có năng suất, chất lượng cao, thời gian thu hoạch ngắn là van đề thiết yếu trong canh tác cây họ đậu. Việc phát triển nông nghiệp bền vững đi cùng hạn chế tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng là một trong những chiến lược quan trọng canh tác cây họ đậu cũng như ngành nông nghiệp nói chung. Canh tác theo định hướng sinh học thông qua việc giảm tải phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học, chú trọng sử dụng các sản phẩm phân - thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ vi sinh vật có lợi cho cây trồng là tâm điểm đáng chú ý trong nông nghiệp bền vững. Nguồn vi sinh vật có lợi trong cây trồng đã được nghiên cứu từ rất lâu và mang lại hiệu quả tốt trong việc tăng năng suất và chất lượng nông sản.

Tuy nhiên, để phát triển và có nhiều ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp bền vững, việc nghiên cứu sâu hơn về tác động của vi sinh lên khả năng tăng cường chất dinh dưỡng, sinh trưởng ở cây trồng, đặc biệt là nhóm cây họ đậu, cũng như sự tương tác giữa hệ vi sinh vật đất và cây trồng là những nghiên cứu mang tính thiết thực nhất, tạo nền tảng cho xây dựng và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Tăng cường chất dinh dưỡng nhờ vi khuẩn cộng sinh có định đạm trên cây họ đậu đã được biết đến trong nhiều nghiên cứu trước đây. Những nghiên cứu chứng minh sự cộng sinh này đã được bat đầu vào thé kỷ 19 và nó đã cho thay rằng vi khuẩn hiện diện trong các nốt san trên rễ cây họ đậu có chức năng trong việc có định N: trong khí quyền (Deshwal và ctv, 2011; Malisorn và Prasarn, 2014). Vi khuẩn Rhizobia thuộc nhóm vi khuẩn ơ-Proteobacteria sống trong đất, chúng có khả năng cố định N2 trong mối quan hệ cộng sinh với cây họ đậu.

Sự cộng sinh của vi khuẩn Rhizobia và cây họ đậu là sự tương sinh hỗ trợ, được nghiên cứu rộng rãi vì cây họ đậu là cây lương thực quan trọng. Ước tính được rằng vi khuẩn Rhizobia sông cộng sinh với gần 100 cây họ đậu trong ngành nông nghiệp và chiếm hơn một nửa trên hệ sinh thái vi khuẩn có định đạm trong đất (Zahran, 1991; Sobti va ctv, 2015). Ung dung vi khuan Rhizobia dé tang độ phi nhiêu cho đất, năng suất cây trồng nông nghiệp là một giải pháp dé dàng va tốn chi phí thấp (Shahzad và ctv, 2012; Sobti va ctv, 2015). Vi khuẩn Rhizobia xâm nhập vào rễ cây một cách hiệu quả và giúp tăng sự phát triển của cây thông qua việc sản xuất các hormone tang trưởng thực vật (Deshwal và ctv, 2011; Malisorn và Prasarn, 2014).

Cùng với những tóm lượt bên trên, việc ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất phân bón, các chế phẩm, hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật đang được quan tâm, nghiên cứu và phát triển mạnh trên thế giới cũng như trong nước. Việc khai thác được nguồn vi sinh vật bản địa có lợi cho cây trồng, phù hợp với từng vùng canh tác và từng nhóm cây trồng là những nghiên cứu cơ bản tạo tiền dé cho phát triển nông nghiệp bền vững. Do đó, đề tài “Phân lập, định danh và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng kích thích nảy mam, tăng trưởng ở quy mô phòng thí nghiệm” được thực hiện, nhằm hướng đến việc tuyên chọn các chủng Rhizobia có khả năng khích thích sinh trưởng - phát triển cây trồng và phục vụ cho sản xuất phân bón trong tương lai. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và định danh ở mức độ loài vi khuẩn Rhizobia trên cây họ đậu tại khu vực tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và Cần Thơ.

Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng khích thích nay mam, tăng trưởng ở cây họ đậu và chịu được điều kiện tự nhiên bắt lợi nhằm hướng tới sản xuất chế phẩm sinh học. Nội dung thực hiện Đề tài được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu, Chi nhánh Trung tâm Nghiên cứu — Phát triển, Công ty Cô phần Phân bón Dầu khí Ca Mau với những nội dung như sau: Nội dung 1: Thu thập mẫu rễ đậu và phân lập. Nội dung 2: Định danh các dòng phân lập bằng sinh học phân tử. Nội dung 3: Khảo sát đặc tinh sinh lý và sinh hóa của các chủng Rhizobia.

Nội dung 4: Đánh giá khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng lên cây họ đậu. TONG QUAN TAI LIEU 2. Giới thiệu chung về vi khuẩn Rhizobia 2. Phần loại nhóm vỉ khuẩn cố định đạm Theo Saharan và Nehra (2011), vi sinh vật tham gia vào tiến trình có định đạm - Rhizobia bao gồm 3 nhóm chính như sau: Nhóm vi khuẩn cố định đạm sống cộng sinh bắt buộc với rễ cây họ đậu gồm các chi Rhizobium, Bradyrhizobium, Burkholderia, Sinorhizobium va Mesorhizobium (Saharan và Nehra, 2011).

Nhóm cô định đạm sống cộng sinh với rễ không thuộc cây họ đậu gồm Frankia và vi khuẩn lam. Nhóm vi khuẩn cô định đạm sống tự đo có thé liên kết hoặc nội sinh vào bên trong các bộ phận của cây như: Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter diazotrophicus, Azoarcus, , Klebsiella và Clostridium. Vi khuẩn cố định đạm cộng sinh thuộc cây họ đậu Nhóm vi sinh vật cộng sinh đóng vai trò quan trọng nhất cho quá trình cố định đạm trong đất. Hiện nay, hệ vi sinh vật cộng sinh và có khả năng cé định đạm được tìm thấy ở vùng rễ của hơn 600 loài cây trồng, đặc biệt là cây họ đậu (Leguminosales) (Saharan và Nehra, 2011).

Chi Rhizobium là nhóm vi khuẩn chính, có khả năng sinh trưởng nhanh và có hoạt động có định đạm mạnh nhất (Saharan và Nehra, 2011). Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chi Bradyrhizobium thuộc nhóm vi khuẩn sinh trưởng chậm, có khả năng cô định đạm và tạo nốt san ở rễ ở cây đậu nành và đậu phộng (Saharan và Nehra, 2011; Karthik và ctv, 2017). Vi khuẩn có định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu Hai nhóm vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu được nghiên cứu rộng rãi gồm Frankia và vi khuẩn lam. Trong đó, Frankia là đại diện của vi khuẩn xạ khuẩn có định đạm và có một số đặc cô định đạm không chỉ trong điều kiện sống tự do mà còn cộng sinh với trên 200 loài thực vật không thuộc họ đậu (Kucho và ctv, 2017).

Theo Nguyễn Lân Dũng (1984), rất nhiều loài vi khuẩn lam sống trong ruộng, nước đã được chứng minh là có khả năng cố định đạm. Chúng đã góp phan không nhỏ vào cân bằng nguồn đạm cho nông nghiệp ở nhiều nước, nhất là các nước nhiệt đới (Nguyễn Lân Dũng, 1985). Vi khuẩn cố định đạm sống tự do Vi khuẩn cô định đạm tự do có vai trò quan trọng trong quá trình tạo ra nguồn đạm cho cây trồng sử dụng. Nhóm vi khuẩn có định đạm sống tự do nảy có thé tạo ra lượng chất hữu cơ đáng kê.

Một hạn chế chính mà vi khuẩn nhóm này gặp phải đó là sự thiếu hụt nguồn carbon và nguồn năng lượng cho quá trình cố định dam, vì tiến trình có định đạm cần nhiều năng lượng. Tuy nhiên, hạn chế này có thể được khắc phục. Một số vi khuân nhóm này có thé di chuyển gan rễ cây dé liên kết hoặc nội sinh bên trong rễ cây (Lê Thị Xã, 2021). Phân loại vi khuẩn Rhizobia Các loại vi khuẩn có định đạm cộng sinh trên cây họ đậu thuộc các chi khác nhau của bộ Rhizobiales được gọi chung là Rhizobia (Soto va ctv, 2006).

Việc phân loại vi khuẩn Rhizobia đã trải qua một sự thay đôi đáng ké trong những năm gan đây do việc bồ sung một số chi và loài mới cho nhóm vi khuẩn quan trọng này. Ngày càng có nhiều dòng vi khuan Rhizobia được phân lập và xác định đặc điểm mỗi ngày. Thông qua đó, nhiều loài vi khuân mới đã được xác định và phân nhóm cụ thể hơn (Berrada và Fikri- Benbrahim, 2014). Hiện nay, vi khuẩn Rhizobia được công bố hợp lệ bao gồm 98 loài trong 13 chi.

Hầu hết các loài vi khuẩn này thuộc họ Rhizobiacae trong alpha- proteobacteria và thuộc các chi Rhizobium, Mesorhizobium, Ensifer hoặc Bradyrhizobium. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng còn có nhiều loài thuộc Rhizobia khác ngoài những loài này (Weir, 2016). Cac chi thuộc Rhizobia bao gồm: Chi Rhizobium được mô tả bởi Frank vào năm 1889 hiện có 49 loài, chi Mesorhizobium được mô tả bởi Jarvis và cộng sự vào năm 1997 hiện tại có 21 loài, chi Ensifer (trước đây là Sinorhizobium) được mô tả bởi Chen và cộng sự vào năm 1988 hiện có 17 loài, chi Bradyrhizobium được Jordan mô tả năm 1982 hiện bao gồm 9 loài, chi Burkholderia hiện có 7 thành viên chi này đã được đặt tên, chi Phyllobacterium hiện có 3 loài, chỉ Microvirga gồm 3 loài, chi Azorhizobium gồm có 2 loài, chi Ochrobactrum hiện có 2 loài, chi Methylobacterium, Cupriavidus, Devosia, Shinella đều có một loài duy nhất (Weir, 2016). Bên cạnh đó, nhiều chủng Pseudomonas fluorescens thường tìm thay trong đất và vùng rễ cũng được phân loại là vi khuẩn Rhizobia giúp tăng trưởng ở thực vật (Cook va ctv, 1995).

Ngoài ra, một số cách phân loại khác cũng được sử dụng cho việc xác định vi khuẩn Rhizobia dựa vào tốc độ phát triển của khuẩn lạc trên môi trường thạch nuôi cấy bao gồm nhóm vi khuẩn phát triển nhanh và phát triển chậm. Một số dòng vi khuẩn đã được nghiên cứu như: Rhizobium meliloti — nhóm vi khuan phát triển nhanh sống cộng sinh với cây linh lăng có chu kỳ sinh trưởng 2 — 4 giờ và hình thành khuẩn lạc có đường kính 2 — 4 mm sau 3 — 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch. Nhóm vi khuan phát triển chậm điền hình như Bradyrhizobium japonicum, sông cộng sinh với cây đậu tương hoặc Bradyrhizobium sp. (lupines) trong cỏ lupin.