Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tạo mô sẹo từ thân cây xạ đen

Tài liệu nghiên cứu phân tích ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên quá trình tạo và tăng sinh mô sẹo từ thân cây Xạ Đen một cách chi tiết.

• Tác giả: Pham Thi My Tram
• Trường học: Đại học Thủ Dầu Một
• Đề tài: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tạo mô sẹo từ thân cây Xạ đen (Ehretia asperula Zollinger & Moritzi)
• Loại tài liệu: Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp trường
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Bình Dương

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây Xạ đen và nuôi cấy mô sẹo

Cây Xạ đen (Ehretia asperula Zollinger & Moritzi) là một loài thực vật có giá trị kinh tế và dược học cao, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng. Nuôi cấy mô sẹo là một công nghệ hiện đại giúp tái tạo và nhân giống cây nhanh chóng, đặc biệt hữu ích cho các cây quý hiếm. Kỹ thuật này không chỉ bảo tồn nguồn gen cây bản địa mà còn cung cấp nguồn vật liệu phong phú cho nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp. Sự phát triển của mô sẹo từ thân non cây Xạ đen mở ra nhiều triển vọng trong sản xuất công nghệ cao và phát triển bền vững.

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học cây Xạ đen

Cây Xạ đen là loài thực vật bản địa Việt Nam, phân bố chủ yếu ở các vùng miền Trung. Đây là cây gỗ nhỏ có lá xứ nhỏ, hoa nhỏ màu trắng và quả có hạt nhỏ. Cây Xạ đen chứa nhiều alkaloid, flavonoid và acid phenolic có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm mạnh. Những đặc tính này làm cho cây trở thành đối tượng nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực dược học và công nghệ sinh học.

1.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo trong bảo tồn và phát triển

Nuôi cấy mô sẹo cho phép tạo ra lượng lớn vật liệu thực vật từ một mẫu nhỏ ban đầu. Công nghệ này bảo tồn tính trạng di truyền của cây mẹ, đồng thời giảm áp lực khai thác cây tự nhiên. Đây là giải pháp hiệu quả cho việc nhân giống các cây quý hiếm, nguy cấp và cung cấp nguyên liệu cho sản xuất các hợp chất dược hoạt.

II. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến nuôi cấy mô sẹo

Thành công của nuôi cấy mô sẹo cây Xạ đen phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường cụ thể. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật như 2,4-D, NAA và BA là những yếu tố quyết định sự hình thành và phát triển của mô sẹo. Ngoài ra, môi trường khoáng (MS và B5), độ pH, ánh sáng và nguồn cung cấp carbon cũng đóng vai trò quan trọng. Việc tối ưu hóa các điều kiện này sẽ nâng cao hiệu suất tạo mô sẹo từ lát cắt thân non và cải thiện chất lượng mô tạo thành.

2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Auxin (NAA) và cytokinin (BA) là những chất điều hòa quan trọng trong quá trình tạo mô sẹo. 2,4-D có tác dụng mạnh trong chủng loại tạo mô sẹo không định hình, trong khi kết hợp 2,4-D với NAA hoặc BA cho kết quả tối ưu hơn. Nồng độ và tỷ lệ giữa các hormone này cần được điều chỉnh cẩn thận để đạt tốc độ tăng sinh mô cao nhất và chất lượng mô sẹo tốt.

2.2. Tác động của môi trường khoáng và pH

Môi trường khoáng MS và môi trường B5 cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của mô sẹo. Độ pH tối ưu từ 5,6-5,8 giúp tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng của các tế bào. Nguồn carbon như sucrose hoặc glucose cũng ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ tăng trưởng của mô.

2.3. Điều kiện ánh sáng và thời gian nuôi cấy

Ánh sáng là yếu tố thiết yếu cho quá trình hình thành mô sẹo từ lát cắt thân non. Thời gian nuôi cấy kéo dài 4 tuần cho phép quan sát sự tăng sinh và phát triển của mô. Các điều kiện về cường độ ánh sáng, thời gian sáng cần được điều chỉnh phù hợp để tối ưu hóa quá trình.

III. Quy trình nuôi cấy mô sẹo từ thân non cây Xạ đen

Quy trình nuôi cấy mô sẹo bắt đầu từ việc khử trùng thân non cây Xạ đen trồng ngoài vườn. Sau đó, lát cắt thân non được đặt trên các môi trường khoáng khác nhau bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng cụ thể. Trong 4 tuần nuôi cấy, sẽ quan sát sự hình thành và tăng sinh mô sẹo. Kết quả cho thấy rằng tỷ lệ hình thành mô sẹo, chỉ số tăng trưởng và chất lượng mô phụ thuộc chặt chẽ vào các yếu tố môi trường được lựa chọn. Quy trình này đòi hỏi kỹ thuật tài tèo và kiểm soát môi trường chặt chẽ.

3.1. Chuẩn bị mẫu cấy và khử trùng

Lá, hoa, quả cây Xạ đen được chọn từ cây trồng ngoài vườn khỏe mạnh. Thân non được cắt thành các lát nhỏ có độ dài 1-1,5 cm. Mẫu cấy được khử trùng bằng dung dịch NaOCl để loại bỏ các vi khuẩn, nấm gây hại. Quá trình này quan trọng để đảm bảo thành công của nuôi cấy.

3.2. Đặt mẫu cấy và theo dõi sự phát triển

Lát cắt thân non được đặt trên môi trường MS bổ sung NAA, 2,4-D, BA ở các nồng độ khác nhau. Mẫu được nuôi cấy trong phòng có điều kiện ánh sáng, nhiệt độ được kiểm soát. Chỉ số tăng trưởng của mô sẹo được đo đạc theo thời gian để đánh giá hiệu quả của từng xử lý môi trường.

IV. Kết quả nghiên cứu và hướng phát triển tiếp theo

Các kết quả nghiên cứu từ đề tài khoa học cấp trường cho thấy rằng sự tạo mô sẹo từ thân non cây Xạ đen có thể đạt được với tỷ lệ hình thành cao khi sử dụng môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/L. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với NAA hoặc BA cũng mang lại kết quả tích cực trong tăng sinh mô sẹo. Những phát hiện này không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mà còn mở ra tiềm năng lớn cho ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất các hợp chất dược hoạt từ cây Xạ đen. Các hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào quy mô hóa sản xuất, phân tích hóa học và hoạt tính sinh học của mô sẹo.

4.1. Tóm tắt kết quả chính từ các thí nghiệm

Thí nghiệm 1 cho thấy NAA ở nồng độ 1 mg/L là tối ưu cho hình thành mô sẹo. Thí nghiệm 2 chứng minh kết hợp 2,4-D với NAA/BA tăng hiệu suất tăng sinh. Thí nghiệm 3 xác nhận môi trường MS và pH 5,6-5,8 là điều kiện tối ưu. Thí nghiệm 6 cho thấy sucrose là nguồn carbon tốt nhất.

4.2. Ứng dụng thực tiễn và tương lai

Công nghệ nuôi cấy mô sẹo cây Xạ đen có thể áp dụng để sản xuất các hợp chất dược hoạt quy mô lớn. Đây là giải pháp bền vững cho bảo tồn cây bản địa và giảm áp lực khai thác tự nhiên. Các nghiên cứu tiếp theo nên tối ưu hóa quy mô sản xuất và phát triển công nghệ xử lý để tạo ra sản phẩm có giá trị cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, có tất cả những thông tin di truyền đặc trƣng của cơ thể chứa đựng nó. Vì vậy mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn năng [1]. Thực vật bậc cao là một trong những nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học rất quan trọng cho con ngƣời.

Tuy nhiên, các loài cây này đang có nguy cơ tiệt chủng hoặc hàm lƣợng các hợp chất có giá trị rất thấp trong tự nhiên. Điển hình nhƣ nhu cầ u taxol trên thế giới rấ t cao như ng hàm lư ơ ̣ng chiế t xuấ t tƣ̀ các loa ̣i thông đ ỏ ngoài tƣ̣ nhiên rấ t ít do lớp vỏ mỏng và khi v ỏ cây bị khai thác thì cây sẽ chết [2]. Phƣơng pháp nuôi cấy mô-tế bào thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên. Đây là m ột kỹ thuật quan tro ̣ng trong công ngh ệ sinh ho ̣c th ực vật mà ư u điể m lớn nhấ t là có thể chủ động tăng nguồ n cung cấ p các dư ơ ̣c liệu.

Ehretia asperula Zollinger & Moritzi thuộc họ Boraginaceae, đƣợc gọi là cây Xạ đen, thƣờng mọc hoang trên các vùng núi cao. Do có giá trị dƣợc liệu cao nên gần đây Xạ đen đã bắt đầu đƣợc trồng ở các tỉnh Sơn La, Hòa Bình, Hà Nam và Quảng Bình [3]. Theo y học cổ truyền, Xạ đen có vị thơm mát, là vị thuốc đa công dụng. Cây có tác dụng hữu hiệu trong điều trị mụn nhọt, tiêu ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch, tăng cƣờng sức đề kháng của cơ thể [4].

Năm 1997, Kuo và Kuo cho biết dịch chiết cồn từ vỏ cây Xạ đen có thể ức chế sự phân chia của tế bào ung thƣ gan (Hep G2), ung thƣ mũi, ung thƣ ruột kết và kháng virus HIV H-9 [5]. Năm 1999, Lê Thế Trung và cộng sự đã phát hiện 4 loại hợp chất chính ở cây Xạ đen là flavonoid, quinon, saponin triterpenoid và pyrocatechin có tác dụng hạn chế sự phát triển của u ác tính [6]. Nhiều hợp chất từ cây Xạ đen cũng ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn gây bệnh, điển hình là Staphylococcus aureus [7]. Với những giá trị về y học nhƣ trên nên hiện nay, cây Xạ đen đƣợc sử dụng nhiều trong việc hỗ trợ điều trị ung thƣ và vì vậy việc thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây Xạ đen rất cần thiết.

Trong những năm 1 qua nguồn dƣợc liệu này trong tự nhiên bị giảm sút dần do khai thác quá mức, rừng tự nhiên bị thu hẹp. Nhằm bảo tồn giống cây quý cũng nhƣ tạo nguồn nguyên liệu cho ngành dƣợc, cây Xạ đen chỉ mới đƣợc nghiên cứu nhân giống bằng phƣơng pháp in vitro [8], [9], [10], [11], phƣơng pháp gieo hạt và giâm hom [12] và thu nhận các hợp chất có giá trị từ cây ngoài tự nhiên. Việc thu nhận hợp chất thứ cấp từ cây Xạ đen bằng phƣơng pháp nuôi cấy tế bào vẫn là hƣớng nghiên cứu mới và chƣa đƣợc công bố. Vì vậy, đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy lên sự tạo mô sẹo từ thân cây Xạ đen (Ehretia asperula Zollinger & Moritzi)” đƣợc thực hiện nhằm tìm kiếm nguồn nguyên liệu ban đầu cho sự nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng để thu sinh khối chứa các hoạt chất có giá trị trong y học.

Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung - Tìm ra các điều kiền môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho quá trình hình thành mô sẹo từ thân cây Xạ đen (Ehretia asperula Zollinger & Moritzi).2 Mục tiêu cụ thể - Xác định đƣợc điều kiện chiếu sáng ảnh hƣởng đến quá trình hình thành mô sẹo từ cây Xạ đen. - Xác định đƣợc điều kiện môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng đến quá trình hình thành mô sẹo từ thân cây Xạ đen. - Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của mô sẹo hình thành mô sẹo từ thân cây Xạ đen. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.

Đối tượng nghiên cứu Cây Xạ đen (Ehretia asperula Zollinger & Moritzi) 3. Phạm vi nghiên cứu - Thời gian: Từ tháng 1 năm 2021 đến tháng 5 năm 2022 2 - Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng - Phạm vi nghiên cứu: Nuôi cấy in vitro hình thành mô sẹo trong phòng thí nghiệm. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây Xạ đen 1.1 Nguồn gốc, phân bố cây Xạ đen Ehretia asperula Zoll. là tên khoa học của một loài thuộc chi Ehretia, họ Boraginaceae), đƣợc Zollinger và Moritzi mô tả lần đầu vào giữa những năm 1840 [13].

Cây xa ̣ đen đư ơ ̣c phân bố nhiề u ở các nư ớc như : Trung Quố c, Việt Nam , Myanmar, Thái-lan. Ở Trung Quốc , loại cây này thƣờng mọc ở đ ộ cao tƣ̀ 1. Ở Việt Nam , xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh nhƣ : Hà Nam , Quảng Ninh, Ninh Bình , Hòa Bình , Vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng , Vƣờn qu ốc gia Ba Vì , Thƣ̀a Thiên - Huế , Gia Lai [14]. Chúng cũng có thể mo ̣c tƣ̣ nhiên trong rƣ̀ng ho ặc đư ơ ̣c trồ ng ta ̣i các vư ờn h ộ, trang tra ̣i ho ặc trồ ng rải rác.

Cây xa ̣ đen rấ t dễ trồ ng , thƣờng lấy bộ phận lá để làm thuốc.2 Đặc điểm sinh học cây Xạ đen Xạ đen là loài cây ti ểu mộc, có thể leo thành bu ̣i, dài 5 – 7 m, có khi tới 10 m, thân già có vỏ nâu đố m trắ ng, chồ i và lá non có màu tím đỏ. Lá của cây Xạ đen là lá đơn, mọc cách, hình trái xoan, có chiều dài lá từ 10 đến 20 cm, rộng từ 5 đến10 cm, mép lá có răng cư a. Xạ đen ra hoa từ tháng 3 đến tháng 5, hình thành quả từ khoảng tháng 8 đến tháng 9 và chín từ tháng 10 đến tháng 11. Quả Xạ đen khi chín có màu vàng đậm (Hình 1.1 Lá, hoa, quả của cây Xạ đen [14].3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Xạ đen Từ những năm 1990 đến nay, Xạ đen đã đƣợc nghiên cứu nhiều và phân lập đƣợc nhiều hợp chất có hoạt tính có giá trị trong y học nhƣ: các hợp chất phenolic, terpene, alkaloid…với các thử nghiệm in vitro nhƣ: kháng oxy hoá, kháng vi sinh vật và kháng phân chia tế bào của một số dòng tế bào ung thƣ.

Năm 1995, Kuo và cộng sự phân lập đƣợc một alkaloid sesquyterpene pyridin mới, có khả năng gây độc tế bào tên là celahinine A từ cây Xạ đen [15]. Tiếp đó, nhóm tác giả cũng đã phân lập đƣợc hai ester sesquyterpene mới là celahin B, celahin C [16]. Năm 1997, Kuo và Kuo đã cho biết 4 hợp chất triterpene mới bao gồm celasdin A, celasdin C, celasdin B và maytenfolone A đƣợc phân lập từ cây này. Đánh giá sinh học cho thấy maytenfolone A có khả năng gây độc cho tế bào ung thƣ gan (HEPA-2B, ED50 = 2,3 µg/mL) và ung thƣ biểu mô vòm họng (KB, ED50 = 3,8 µg/mL).

Celasdin B có khả năng chống HIV nhân rộng trong các tế bào lympho H9 với EC50 là 0,8 µg/mL [5]. Năm 2006, Ly và cộng sự đã phân lập đƣợc các hợp chất kháng oxy hóa từ dịch chiết methanol 50% của lá Xạ đen khô. Tám hợp chất phenol đƣợc định tính bằng sắc ký lỏng đảo pha hiệu năng cao và cấu trúc của chúng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp quang phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. Năm hợp chất đƣợc biết đến là rutin, kaempferol 3-rutinoside, acid rosmarinic (RA), acid lithospermic, acid lithospermic B và ba oligomer mới của RA gồm một dimer và hai trimer.

Thành phần chính trong dịch chiết là RA và acid lithospermic B. Các hợp chất phenol đƣợc chứng minh có hoạt tính kháng oxy hóa [7]. Từ năm 2007 đến 2008, Trinh Thi Thuy và cộng sự đã phân lập và làm rõ đƣợc cấu trúc của của ba triterpene là 3-friedelanol, 3-friedelanone và canophyllol từ cây Xạ đen trồng ở Quảng Bình [17]. Tiếp đó, các tác giả cũng đã xác định đƣợc cấu trúc của clionasterol và ba triterpene là: D:A-friedo-oleanon-3,21-dion, lup- 20(29)-en-3β-ol và lup-12-en-3β-ol [18].

Năm 2016, Ly đã nghiên cứu và tìm ra quy trình chiết xuất RA từ lá Xạ đen. Dung môi sử dụng là ethanol. Các điều kiện tối ƣu để chiết xuất nhƣ sau: tỷ lệ dung 5 môi/vật liệu là 12/1 (v/m), hai lần chiết với tổng thời gian chiết là 3 giờ; tinh chế bằng cột Diaion HP-20 đã nhận đƣợc RA có độ tinh khiết 83,30% và hiệu suất thu hồi đạt 2,86% trọng lƣợng khô nguyên liệu [19]. Năm 2018, Vũ Thị Nguyệt và cộng sự đã báo cáo tác dụng gây độc tế bào đối với một số dòng tế bào ung thƣ của một số hợp chất chiết xuất từ thân cây Xạ đen.

Tất cả các chất chiết xuất thể hiện tác dụng gây độc trên ít nhất một dòng tế bào ung thƣ khảo sát. Cao chiết phân đoạn n-hexan thể hiện hoạt tính với dòng tế bào ung thƣ gan (HEP-G2), ung thƣ vú (MCF-7) và ung thƣ cổ tử cung (Hela) với các giá trị IC50 tƣơng ứng là 28,3; 14,42 và 18,59 μg/mL. Cao chiết phân đoạn methanol, ethyl acetate và nƣớc chỉ có hoạt tính với dòng tế bào MCF-7 với các giá trị IC50 lần lƣợt là: 16,45; 13,4 và 39,78 μg/mL. Chất methyl caffeate thể hiện hoạt tính với các dòng tế bào Hep-G2, Hela và MCF-7 với giá trị IC50 tƣơng ứng là: 2,83; 3,38 và 4,4 μg/mL [20].

Năm 2019, Tran Duc Viet và cộng sự đã phân lập đƣợc 15 hợp chất từ lá Xạ đen bao gồm các acid béo, amino acid, flavonoid, sterol, terpene và phenol. Trong số các hợp chất này, α-amyrin, β-amyrin, hydrazine carboxamide, hexadecanoic acid, fucosterol, (3β)-D:C-friedours-7-en-3-ol, rutin và 2-hydroxy-1-ethyl ester có hàm lƣợng đáng kể. Theo nhóm tác giả, các hợp chất đƣợc xác định này có khả năng kháng oxy hóa rất tốt cũng nhƣ các đặc tính dƣợc phẩm tiềm năng [21]. Năm 2020, Bùi Thị Thanh Duyên và cộng sự đã khảo sát tác du ̣ng ƣ́c chế m ột số dòng tế bào ung thư và kh ả năng chố ng oxy hóa của lá Xa ̣ đen.

Mẫu lá đư ơ ̣c chiế t bằ ng eth anol 90% và tiế n hành chiế t phân đoa ̣n lầ n lư ơ ̣t với n -hexane (Hex), ethyl acetate (EtOAc) và n-butanol (n-BuOH). Kế t quả cho thấ y phân đoa ̣n EtOAc có tác du ̣ng gây đ ộc tế bào ung thư gan , phổ i ma ̣nh nhấ t với IC 50 lầ n lư ợt là 33,7 μg/mL và 13 μg/mL.