Nguyễn thạch phong nghiên cứu các điều kiện biểu hiện tinh sạch và đánh giá khả năng thuỷ phân arabinoxylan của xylanase tái tổ hợp từ chủng pichia pastoris gs115 luận văn thạc sĩ dược học

Nghiên cứu điều kiện biểu hiện tinh sạch và khả năng thủy phân arabinoxylan của xylanase tái tổ hợp từ Pichia pastoris GS115 trong luận văn thạc sĩ.

• Tác giả: Nguyễn Thạch Phong
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Mai Anh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Sinh Dược
• Đề tài: Nghiên cứu các điều kiện biểu hiện, tinh sạch và đánh giá khả năng thuỷ phân arabinoxylan của enzym xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nguồn gốc và phân bố trong tự nhiên
• 1.2. Phân bố trong tự nhiên
• 1.3. Xylanase từ chủng Aspergillus niger
• 1.4. Chủng Pichia pastoris GS115. Nguồn gốc, phân loại. Bộ gen di truyền
• 1.5. Điều kiện nuôi cấy
• 1.6. Tình hình nghiên cứu xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115
• 1.6.1. Trên thế giới
• 1.6.2. Tại Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.2. Môi trường
• 2.3. Thiết bị thí nghiệm
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp nuôi cấy Pichia pastoris GS115
• 2.5.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện xylanase tái tổ hợp
• 2.5.3. Phương pháp tinh sạch xylanase tái tổ hợp
• 2.5.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tái tổ hợp
• 2.5.5. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE)
• 2.5.6. Phương pháp định tính xylanase
• 2.5.7. Phương pháp định lượng xylanase
• 2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng thuỷ phân arabinoxylan
• 2.5.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện biểu hiện xylanase từ chủng Aspergillus niger DMS1957 trong Pichia pastoris GS115
• 3.2. Kết quả biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong điều kiện cơ bản
• 3.3. Khảo sát các điều kiện biểu hiện nâng cao hoạt tính xylanase tái tổ hợp
• 3.4. Kết quả tinh sạch và đánh giá đặc tính sinh học thủy phân arabinoxylan của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115
• 3.4.1. Kết quả tinh sạch xylanase tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực
• 3.4.2. Đánh giá độ tinh sạch của xylanase tái tổ hợp
• 3.4.3. Đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan
• 3.4.4. Về kết quả khảo sát điều kiện biểu hiện nâng cao hoạt tính xylanase tái tổ hợp
• 3.4.5. Khảo sát kết quả tinh sạch và đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan của xylanase tái tổ hợp
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu xylanase tái tổ hợp từ Pichia pastoris GS115

Nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp từ Pichia pastoris GS115 đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Xylanase là enzym quan trọng trong quá trình thủy phân arabinoxylan, một polysaccharid chính có trong ngũ cốc. Việc hiểu rõ về nguồn gốc, cấu trúc và ứng dụng của xylanase sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng của enzym này trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

1.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp và dược phẩm

Xylanase có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, dược phẩm và sản xuất nhiên liệu sinh học. Các sản phẩm thủy phân từ arabinoxylan có thể được sử dụng để sản xuất xylitol, một chất làm ngọt không calo, có lợi cho sức khỏe.

1.2. Tình hình nghiên cứu xylanase tại Việt Nam và thế giới

Nghiên cứu về xylanase từ Pichia pastoris đã được thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới, tuy nhiên tại Việt Nam, lĩnh vực này vẫn còn nhiều tiềm năng chưa được khai thác. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất xylanase có thể giúp giảm chi phí và tăng hiệu quả sản xuất.

II. Thách thức trong việc sản xuất xylanase tái tổ hợp

Mặc dù xylanase có nhiều ứng dụng tiềm năng, nhưng việc sản xuất enzym này vẫn gặp phải nhiều thách thức. Chi phí sản xuất cao và hoạt tính enzym thấp là những vấn đề chính cần được giải quyết. Việc sử dụng công nghệ tái tổ hợp có thể giúp cải thiện tình hình này.

2.1. Chi phí sản xuất và hoạt tính enzym

Chi phí sản xuất xylanase từ các nguồn tự nhiên thường cao do quy trình chiết xuất phức tạp. Hơn nữa, hoạt tính của enzym chiết xuất từ tự nhiên thường không đủ để đáp ứng nhu cầu công nghiệp.

2.2. Giải pháp công nghệ sinh học trong sản xuất xylanase

Công nghệ sinh học, đặc biệt là việc sử dụng Pichia pastoris làm vật chủ, đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc sản xuất xylanase tái tổ hợp với hoạt tính cao và chi phí thấp hơn. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và biểu hiện enzym là rất quan trọng.

III. Phương pháp nghiên cứu xylanase tái tổ hợp từ Pichia pastoris GS115

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để khảo sát điều kiện nuôi cấy và biểu hiện xylanase từ Pichia pastoris GS115. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy trong môi trường thích hợp và sử dụng các kỹ thuật tinh sạch enzym.

3.1. Điều kiện nuôi cấy và biểu hiện xylanase

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ carbon nguồn được tối ưu hóa để đạt được hoạt tính enzym cao nhất. Việc sử dụng methanol làm chất cảm ứng cũng được khảo sát để tăng cường biểu hiện của xylanase.

3.2. Phương pháp tinh sạch xylanase tái tổ hợp

Các phương pháp tinh sạch như sắc ký ái lực và điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) được áp dụng để thu nhận xylanase với độ tinh khiết cao. Việc đánh giá hoạt tính enzym cũng được thực hiện để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

IV. Kết quả nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan của xylanase

Kết quả nghiên cứu cho thấy xylanase tái tổ hợp từ Pichia pastoris GS115 có khả năng thủy phân arabinoxylan hiệu quả. Các sản phẩm thu được từ quá trình thủy phân có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

4.1. Đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan

Khả năng thủy phân arabinoxylan của xylanase được đánh giá thông qua các thí nghiệm định lượng. Kết quả cho thấy enzym có thể thủy phân hiệu quả, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao.

4.2. Ứng dụng thực tiễn của sản phẩm thủy phân

Các sản phẩm thủy phân từ xylanase có thể được sử dụng trong ngành thực phẩm, dược phẩm và sản xuất nhiên liệu sinh học. Việc ứng dụng này không chỉ giúp tăng giá trị kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu xylanase

Nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp từ Pichia pastoris GS115 mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng của enzym này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả trong nhiều ngành công nghiệp.

5.1. Tương lai của nghiên cứu xylanase

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, nghiên cứu về xylanase sẽ tiếp tục được mở rộng. Các nghiên cứu mới có thể tập trung vào việc cải thiện hoạt tính enzym và giảm chi phí sản xuất.

5.2. Ứng dụng xylanase trong các lĩnh vực mới

Các ứng dụng của xylanase trong ngành dược phẩm và sản xuất nhiên liệu sinh học đang được nghiên cứu và phát triển. Điều này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người và môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Xylanase là enzym glycosidase thuộc nhóm endohydrolysis, xúc tác thủy phân các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan, một thành phần polysaccharid phi tinh bột chính trong ngũ cốc và các nguồn sinh khối lignocellulosic. Thị trường xylanase toàn cầu dự kiến tăng trưởng với tỷ lệ hàng năm kép 6,6% vào năm 2023, ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp giấy và dược phẩm. Tuy nhiên, hoạt tính xylanase tự nhiên còn thấp và chi phí sản xuất cao, hạn chế ứng dụng công nghiệp. Công nghệ ADN tái tổ hợp, đặc biệt sử dụng nấm men Pichia pastoris GS115, được xem là giải pháp hiệu quả để biểu hiện và sản xuất xylanase với năng suất cao, khả năng sửa đổi sau dịch mã và tiết protein ngoại bào tốt.

Luận văn tập trung nghiên cứu điều kiện biểu hiện, tinh sạch và đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan của xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115 mang gen xylanase A từ Aspergillus niger DMS1957. Mục tiêu cụ thể gồm khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính enzym, tinh sạch enzym bằng sắc ký ái lực và đánh giá đặc tính sinh học thủy phân arabinoxylan. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học Enzym, Viện Công nghệ sinh học, trong năm 2022, với ý nghĩa mở rộng ứng dụng xylanase trong công nghiệp dược phẩm và các ngành công nghiệp xanh khác.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và phân loại xylanase: Xylanase thuộc nhóm glycosid hydrolase, phân loại chủ yếu vào họ GH10 và GH11 dựa trên trình tự và cấu trúc vùng xúc tác. Họ GH10 có trọng lượng phân tử cao, hoạt tính xúc tác đa dạng; họ GH11 trọng lượng thấp, chuyên thủy phân liên kết β-1,4-xylosidic bên trong xylan.

• Cơ chế xúc tác enzym: Xylanase hoạt động theo cơ chế dịch chuyển kép, giữ lại cấu hình anomeric của sản phẩm, với hai gốc glutamat đóng vai trò acid/base và cho điện tử trong vị trí hoạt động.

• Hệ biểu hiện tái tổ hợp Pichia pastoris GS115: Nấm men methylotrophic có khả năng phát triển mật độ cao, thực hiện sửa đổi sau dịch mã phức tạp, tiết protein ngoại bào hiệu quả, được sử dụng phổ biến trong sản xuất enzym công nghiệp và protein dược phẩm.

• Khái niệm arabinoxylan (AX): Polysaccharid phi tinh bột chính trong ngũ cốc, gồm trục xylose liên kết β-(1,4) được thay thế bởi arabinose, có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng và ứng dụng y sinh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng Pichia pastoris GS115 mang gen xylanase A từ Aspergillus niger DMS1957 được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu. Các hóa chất, môi trường nuôi cấy và thiết bị thí nghiệm đạt chuẩn phân tích.

• Phương pháp nuôi cấy và khảo sát điều kiện biểu hiện: Chủng được hoạt hóa trên môi trường YPD agar, nuôi trong YPD lỏng, sau đó chuyển sang môi trường YP bổ sung glycerol và methanol với các nồng độ khác nhau (0-2%) để cảm ứng biểu hiện enzym. Thời gian thu mẫu được khảo sát từ 24 đến 144 giờ. Môi trường biểu hiện gồm 6 loại khác nhau (BMMY, MMY, MM, YPM, YPTM, YPCTM).

• Phương pháp tinh sạch enzym: Sử dụng sắc ký ái lực với cột resin gắn nickel, dựa trên liên kết giữa đuôi polyhistidin của protein tái tổ hợp và ion Ni2+. Protein tinh sạch được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE.

• Phương pháp xác định hoạt tính enzym: Định tính bằng phương pháp khuếch tán enzym trên đĩa thạch, định lượng bằng phương pháp quang phổ theo Miller sử dụng phản ứng với DNS đo hấp thụ ở 540 nm, tính hoạt tính enzym dựa trên lượng xylose giải phóng.

• Phương pháp đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan: Thủy phân arabinoxylan thương mại bằng enzym xylanase tái tổ hợp, sau đó phân tích sản phẩm thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng TLC.

• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xử lý số liệu, tính trung bình và độ lệch chuẩn, phân tích trình tự gen bằng phần mềm chuyên dụng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện biểu hiện tối ưu:

   • Thời gian thu mẫu 120 giờ cho hoạt tính xylanase cao nhất với 9,49 ± 0,16 IU/ml và hoạt tính riêng 16,30 ± 0,28 IU/mg protein.
   • Nồng độ methanol cảm ứng 1% đạt hoạt tính enzym tối ưu 11,18 ± 0,16 IU/ml và hoạt tính riêng 22,35 ± 0,21 IU/mg protein, tăng lần lượt 1,18 và 1,37 lần so với điều kiện không cảm ứng.
   • Môi trường BMMY cho mật độ tế bào cao nhất (102,9 ± 1,98 mg) và hoạt tính enzym cao nhất (21,62 ± 0,12 IU/ml), hoạt tính riêng đạt 25,65 ± 0,14 IU/mg protein.

2. Tăng cường hoạt tính enzym sau khảo sát điều kiện:

   • Hoạt tính xylanase tăng 10,4 lần (từ 2,07 ± 0,06 lên 21,62 ± 0,12 IU/ml).
   • Hoạt tính riêng tăng 3,6 lần (từ 7,09 ± 0,24 lên 25,65 ± 0,14 IU/mg protein), cho thấy đồng thời tăng lượng protein tạp.

3. Kết quả tinh sạch enzym:

   • Hoạt tính riêng của dịch tinh sạch đạt trung bình 34,06 ± 0,17 IU/mg protein, tăng 1,33 lần so với dịch nổi.
   • Hiệu suất thu hồi enzym đạt 9,3%, độ tinh sạch gấp 1,97 lần.
   • Điện di SDS-PAGE cho thấy băng protein đặc trưng khoảng 35 kDa, phù hợp với khối lượng phân tử xylanase tái tổ hợp.

4. Khả năng thủy phân arabinoxylan:

   • Enzym xylanase tái tổ hợp có khả năng thủy phân arabinoxylan thương mại hiệu quả, sản phẩm thủy phân được xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC, cho thấy sự phân giải các oligoxylan và monosaccharide.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, đặc biệt là thời gian thu mẫu, nồng độ methanol cảm ứng và lựa chọn môi trường BMMY, đã nâng cao đáng kể hoạt tính xylanase tái tổ hợp. Sự tăng hoạt tính riêng sau tinh sạch chứng tỏ hiệu quả của phương pháp sắc ký ái lực trong loại bỏ protein tạp, giúp thu được enzym tinh khiết hơn phục vụ cho các ứng dụng tiếp theo.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, hoạt tính enzym đạt được tương đương hoặc vượt trội, ví dụ hoạt tính 21,62 IU/ml cao hơn nhiều so với mức 10,035 U/ml trong một nghiên cứu lên men 10 L. Khả năng thủy phân arabinoxylan thành các sản phẩm có giá trị sinh học mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm chức năng và nhiên liệu sinh học.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường biểu diễn hoạt tính enzym theo thời gian nuôi cấy, nồng độ methanol và môi trường nuôi cấy, cũng như bảng so sánh hoạt tính trước và sau tinh sạch. Điện di SDS-PAGE minh họa độ tinh khiết protein và khối lượng phân tử đặc trưng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình nuôi cấy tối ưu: Thực hiện nuôi cấy Pichia pastoris GS115 trong môi trường BMMY, cảm ứng bằng 1% methanol, thu mẫu sau 120 giờ để đạt hiệu suất biểu hiện xylanase cao nhất. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, timeline: 3-6 tháng.

2. Triển khai quy trình tinh sạch enzym bằng sắc ký ái lực: Áp dụng phương pháp sắc ký nickel để thu nhận enzym tinh khiết, nâng cao hoạt tính riêng và giảm protein tạp, phục vụ nghiên cứu ứng dụng sâu hơn. Chủ thể: phòng thí nghiệm, timeline: 2-3 tháng.

3. Nghiên cứu ứng dụng enzym trong thủy phân arabinoxylan: Mở rộng đánh giá sản phẩm thủy phân, tối ưu điều kiện phản ứng enzym để sản xuất các hợp chất có giá trị như xylitol, oligosaccharide chức năng. Chủ thể: nhóm nghiên cứu phát triển sản phẩm, timeline: 6-12 tháng.

4. Phát triển quy mô sản xuất enzym công nghiệp: Dựa trên kết quả nghiên cứu, xây dựng quy trình lên men quy mô lớn, kiểm soát chất lượng enzym để ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm và nhiên liệu sinh học. Chủ thể: doanh nghiệp công nghệ sinh học, timeline: 1-2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ enzym và sinh học phân tử: Tài liệu cung cấp dữ liệu chi tiết về biểu hiện, tinh sạch và đặc tính enzym xylanase tái tổ hợp, hỗ trợ phát triển các nghiên cứu tương tự.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzym công nghiệp: Tham khảo quy trình tối ưu nuôi cấy và tinh sạch enzym, giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và giảm chi phí.

3. Chuyên gia phát triển sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng: Nghiên cứu khả năng ứng dụng enzym trong thủy phân arabinoxylan để tạo ra các sản phẩm có lợi cho sức khỏe như xylitol, oligosaccharide.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành Hóa sinh, Công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo thực tiễn về phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân tích và xử lý số liệu trong lĩnh vực enzym tái tổ hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. Xylanase tái tổ hợp là gì và tại sao sử dụng Pichia pastoris GS115?
   Xylanase tái tổ hợp là enzym được biểu hiện từ gen xylanase chuyển vào vật chủ Pichia pastoris GS115, một nấm men có khả năng phát triển mật độ cao, thực hiện sửa đổi sau dịch mã và tiết protein hiệu quả, giúp sản xuất enzym với năng suất cao và chất lượng tốt.

2. Điều kiện nuôi cấy nào tối ưu để biểu hiện xylanase?
   Nghiên cứu cho thấy môi trường BMMY, cảm ứng bằng 1% methanol, thu mẫu sau 120 giờ nuôi cấy là điều kiện tối ưu, đạt hoạt tính enzym 21,62 IU/ml và hoạt tính riêng 25,65 IU/mg protein.

3. Phương pháp tinh sạch enzym được sử dụng như thế nào?
   Sử dụng sắc ký ái lực với cột resin gắn nickel, dựa trên liên kết giữa đuôi polyhistidin của protein tái tổ hợp và ion Ni2+, giúp loại bỏ protein tạp và thu được enzym tinh khiết với hoạt tính riêng tăng lên 34,06 IU/mg protein.

4. Khả năng ứng dụng của enzym xylanase tái tổ hợp trong công nghiệp?
   Enzym có thể ứng dụng trong thủy phân arabinoxylan để sản xuất các hợp chất giá trị như xylitol, oligosaccharide, phục vụ ngành dược phẩm, thực phẩm chức năng, nhiên liệu sinh học và công nghiệp giấy.

5. Làm thế nào để đánh giá hoạt tính enzym xylanase?
   Hoạt tính được định lượng bằng phương pháp quang phổ theo Miller, đo lượng đường khử xylose giải phóng từ cơ chất xylan sau phản ứng enzym, đơn vị hoạt tính là µmol xylose giải phóng trong một phút.

Kết luận

• Đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu cho biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115 với hoạt tính enzym đạt 21,62 IU/ml và hoạt tính riêng 25,65 IU/mg protein.
• Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực hiệu quả, nâng cao độ tinh khiết enzym với hoạt tính riêng trung bình 34,06 IU/mg protein, hiệu suất thu hồi 9,3%.
• Enzym xylanase tái tổ hợp có khả năng thủy phân arabinoxylan thương mại, tạo ra sản phẩm có giá trị ứng dụng trong dược phẩm và công nghiệp sinh học.
• Nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ sản xuất enzym tái tổ hợp chất lượng cao, mở rộng ứng dụng trong các ngành công nghiệp xanh.
• Đề xuất triển khai quy trình sản xuất quy mô lớn và nghiên cứu ứng dụng sâu hơn trong sản xuất xylitol và các hợp chất chức năng.

Hành động tiếp theo: Áp dụng quy trình nuôi cấy và tinh sạch đã tối ưu vào sản xuất thử nghiệm, đồng thời mở rộng nghiên cứu ứng dụng enzym trong các lĩnh vực công nghiệp và y sinh. Đề nghị các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp liên hệ hợp tác để phát triển sản phẩm từ enzym xylanase tái tổ hợp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Định nghĩa Arabinoxylan (AX) là polysaccharid phi tinh bột chính có trong ngũ cốc. AX bao gồm trục xương sống của các gốc xylose liên kết  - (1,4), được thay thế bằng các gốc arabinose ở vị trí C(O)-2 và/hoặc C(O)-3 [12]. Vì AX chủ yếu bao gồm xylose và arabinose, nên nó thường được gọi là pentosan.

Các acid phenolic như acid ferulic có thể được liên kết este trên vị trí C (O) -5 của arabinose. Trong điều kiện oxy hóa, các dư lượng axit ferulic này trải qua quá trình liên kết chéo oxy hóa giữa các gốc axit ferulic khác nhau tạo thành các cầu nối axit diferulic trong chuỗi [15].1: Cấu trúc của arabinoxylan (AX) và các vị trí bị tấn công bởi các enzym xylanolytic liên quan đến sự phân hủy của nó 1. Nguồn gốc và phân bố trong tự nhiên Arabinoxylan là thành phần quan trọng của chất xơ trong ngũ cốc [9]. Ngoài ra, AX cũng được tìm thấy trong vỏ ngô và vỏ chuối với tỷ lệ là 40% và 10%.

Tuy 3 nhiên chuối có tiềm năng lớn hơn trong việc cung cấp AX do chất lượng và số lượng AX vượt trội hơn [40], [41], [14], [25]. Phân loại Arabinoxylan thường được phân loại thành arabinoxylan có thể chiết xuất được trong nước (WEAX) và arabinoxylan không thể chiết xuất được trong nước (WUEAX). Trong đó, WEAX liên kết lỏng lẻo với bề mặt thành tế bào [20]. Ngược lại, WUEAX được giữ lại trong thành tế bào bởi các tương tác cộng hóa trị và không cộng hóa trị với AX và protein, lignin và cellulose [19].

Ứng dụng AX đã được nghiên cứu rất nhiều trên thế giới để sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là lĩnh vực chăm sóc sức khỏe. Một số ứng dụng của AX được trình bày tóm tắt trong bảng 1.1: Một số ứng dụng của arabinoxylan Lĩnh vực Ứng dụng Thực Sử dụng khả năng giữ nước của arabinoxylan để mang lại các đặc phẩm tính lưu biến cần thiết cho bột mì => Cải thiện chất lượng sử dụng cuối cùng của bánh mì [24], [29], [30], [7]. Chăm sóc Bổ sung chất xơ [42], [32], [8]. => kiểm soát bệnh đái tháo đường, sức khỏe rối loạn lipid, cải thiện chức năng hệ tiêu hoá [23], [21], [25].

AX tác động mạnh lên đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thu được [4]. Hoạt tính chống khối u [4]. Định nghĩa Endo – 1,4 – xylanase (EC 3.8) là một enzym phân cắt xylan thành các đoạn nhỏ bằng cách thủy phân các liên kết β – 1,4 – glycosidic bộ khung cấu trúc của xylan [54].2: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong phản ứng thuỷ phân xylan [82] 1. Phân loại Xylanase về cơ bản thuộc nhóm enzym glycosid hydrolase.

Việc phân loại glycosid hydrolase dựa trên trình tự đã chia xylanase vào hai họ GH10 và GH11. Tuy nhiên xylanase cũng được tìm thấy trong các họ glycosid hydrolase khác, chẳng hạn như GH 5, 7, 8 và 43 [70]. Họ GH10 là nhóm có trọng lượng phân tử 5 cao bao gồm cả endo-1,4-β-xylanase và endo-1,3-β-xylanase, nhưng phần lớn là endo-1,4-β-xylanase với ít endo-1,3-β-xylanase. Họ GH11 là nhóm có trọng lượng phân tử thấp, chúng chỉ bao gồm các endo-β-1,4-xylanase thực sự phân cắt các liên kết β-1,4-xylosidic bên trong.

Hoạt tính xúc tác của chúng thấp hơn họ GH10, và các sản phẩm của hoạt động của chúng có thể được thủy phân thêm bởi các enzym thuộc họ 10. Đây được coi là "xylanase thực sự", vì chỉ hoạt động trên D-xylose chứa chất nền [76], [48], [50]. Tuy nhiên, một số trường hợp ngoại lệ đã được tìm thấy [82], [73] và khoảng 30% các xylanase đã được xác định hiện nay, đặc biệt là các xylanase của nấm, không thể được phân loại theo hệ thống này. Sau này, một hệ thống phân loại hoàn chỉnh hơn đã được giới thiệu [62] cho phép phân loại không chỉ xylanase, mà cả glycosidase nói chung (EC 3.x), và hiện đã trở thành hệ thống chuẩn để phân loại các enzym này.

Hệ thống này dựa trên sự so sánh cấu trúc cơ bản của các vùng xúc tác chỉ và các nhóm enzym trong các họ có trình tự liên quan [63]. Phân bố trong tự nhiên Các xylanase được sản xuất chủ yếu bởi vi sinh vật, tảo biển, động vật nguyên sinh, giáp xác, côn trùng, ốc và hạt của thực vật trên cạn. Những nguồn xylanase từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm và nấm men đang được tìm thấy với tính chất lý hoá như độ pH, nhiệt độ ổn định [82]. Trong nấm sợi, Aspergillus và Trichoderma spp.

được xác định là nguồn xylanase tốt nhất với mức sản xuất xylanase ngoại bào cao [17]. Ứng dụng Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là thuỷ phân các xylan, arabinoxylan…. Quá trình thủy phân và các sản phẩm thuỷ phân của xylanase có thể sử dụng trong nhiều giai đoạn của các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, dược phẩm, thực phẩm…. Một số ứng dụng cụ thể được trình bày sau đây: 6 - Tẩy trắng sinh học trong ngành công nghiệp giấy - bột giấy: Tầm quan trọng của việc sử dụng xylanase trong các ngành công nghiệp giấy - bột giấy nằm ở việc thủy phân xylan tương ứng với việc loại bỏ lignin.

Loại bỏ lignin làm trắng giấy do đó nâng cao chất lượng của giấy. Trong những năm qua, clo, chất tẩy trắng hóa học, đã được sử dụng để loại bỏ lignin nhưng nó có một số hạn chế bao gồm việc tạo ra các sản phẩm nguy hiểm cho sức khỏe con người. Các sản phẩm phụ này đôi khi được cho là độc hại, gây đột biến, bền và có khả năng chống phân hủy sinh học cao cho thấy mức độ ô nhiễm môi trường cao. Ứng dụng của xylanase trong bột giấy để loại bỏ lignin được gọi là tẩy trắng sinh học.

Một số nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng xylanase chịu axit để tẩy trắng bột giấy đã tăng lên vì nó có lợi ở một số khía cạnh hơn so với việc sử dụng clo [78], [37]. - Ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi: Xylanase ưa axit rất quan trọng đối với ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Chúng giữ vai trò rất quan trọng trong sản xuất nước trái cây, làm bánh mì, sản xuất xylooligosaccharid vv…. Đối với mục đích làm bánh mì trong ngành công nghiệp thực phẩm, xylanase ưa axit được áp dụng vì độ pH của bột nhào vì pH nằm trong khoảng có tính axit [31].

- Sản xuất nhiên liệu sinh học: Việc tiêu thụ quá nhiều nhiên liệu hóa thạch trong vài thập kỷ qua không chỉ dẫn đến cạn kiệt nguồn cung nhanh chóng mà còn gây ra những tác động có hại đến môi trường. Những tác động tiêu cực như vậy của việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch làm nảy sinh suy nghĩ về các giải pháp thay thế thân thiện với môi trường cũng như bền vững trong tự nhiên. Ngày nay, năng lượng tái tạo dưới dạng nhiên liệu sinh học từ chất nền lignoxenluloza đã trở thành một trong những phương thức sản xuất năng lượng bền vững quan trọng. Sinh khối lignocellulosic rất dồi dào vì sản lượng sinh khối này được ước tính là 10–50 tỷ tấn khô trên toàn thế giới [5], [60].

7 - Ngoài ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác, xylanase được biết đến là có nhiều tiềm năng trong công nghiệp dược phẩm. Tuy nhiên, trên thế giới vẫn còn có ít nghiên cứu về xylanase trong lĩnh vực này. Xylanase đôi khi được thêm vào kết hợp với phức hợp các enzym (hemicellulase, protease và những loại khác) như một chất bổ sung chế độ ăn uống hoặc để điều trị tiêu hóa kém [18]. Các sản phẩm thủy phân của xylan, chẳng hạn như gốc β-D-xylopyranosyl, có thể được lên men, chủ yếu là bởi nấm men (Pichia spititis và Candida shehatae), để sản xuất xylitol.

Xylitol là một polyalcohol có khả năng làm ngọt tương đương với sucrose [26]. Nó là một chất làm ngọt không tạo năng lượng, thích hợp cho bệnh nhân tiểu đường và béo phì và được khuyến nghị để phòng ngừa loãng xương và nhiễm trùng đường hô hấp, rối loạn chuyển hóa lipid, tổn thương thận và đường tiêu hóa. Xylanase từ chủng Aspergillus niger 1. Gen mã hoá Mặc dù một cơ sở dữ liệu rất lớn về các xylanase khác nhau và các gen mã hóa chúng từ A.

niger đã được tạo ra, nhưng vẫn chưa rõ có bao nhiêu gen xylanase được mã hóa trên mỗi bộ gen của chủng A. niger phân lập được và những xylanase nào sẽ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy. Đây thực sự là trở ngại lớn đối với việc nghiên cứu về gen mã hóa xylanase của A. Nghiên cứu đầy đủ và rõ ràng nhất về hệ gen của A.

niger được Pel và cộng sự tiến hành năm 2007. Trong nghiên cứu này, Pel và cộng sự đã chỉ ra, với chủng A.88 có 5 gen mã hóa cho xylanase bao gồm: một gen mã hoá cho xylanase thuộc họ GH 10 và bốn gen mã hoá cho xylanase thuộc họ GH 11 [75]. Đối với chủng Aspergillus niger DMS1957, phòng Công nghệ sinh học Enzym, Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu và giải trình tự được 3 gen mã hoá xylanase lần lượt là: xylanase A mARN với chiều dài 984 bp, xylanase B 8 mARN với chiều dài 678 bp, và xylanase D mARN với chiều dài 957 bp (Hình 1. Trình tự nucleotid của 3 gen này được thể hiện trong phụ lục 1 [11].3: Sơ đồ gen xylanase A từ chủng Aspergillus niger DMS1957 Hình 1.4: Sơ đồ gen xylanase B từ chủng Aspergillus niger DMS1957 Hình 1.5: Sơ đồ gen xylanase D từ chủng Aspergillus niger DMS1957 1.

niger xylanase I có một nếp gấp rất đặc trưng (Hình 1.6), đặc trưng cho họ G xylanase. Hình dạng của nó đã được so sánh với hình dạng của bàn tay phải [83], với '' ngón tay '' ở phía dưới, '' lòng bàn tay '' ở phía bên tay phải và '' ngón 9 tay cái '' ở đầu phân tử như được biểu diễn trong Hình 3 (a). Cấu trúc bao gồm một miền duy nhất và chứa một chuỗi xoắn  và 13 sợi , được sắp xếp thành hai tấm  chủ yếu là đối song song. Chuỗi  lớn hơn, tám sợi (b) được xoắn nhiều xung quanh một khe sâu và dài, đủ lớn để chứa ít nhất bốn dư lượng xyloza.

Một chuỗi xoắn duy nhất được nhúng ở mặt sau của trang tính này. Nó được ổn định chủ yếu bởi các tương tác kỵ nước với chuỗi , nhưng cũng bởi một số liên kết hydro và tương tác tĩnh điện giữa các gốc axit amin được bảo tồn cao.6: Hai quan điểm đại diện về cấu trúc tổng thể của endoxylanase I từ A. Hai gốc glutamat xúc tác, Glu79 (trên) và Glu170 (dưới), được chỉ ra trong (a) 1. Cơ chế xúc tác Một số mô hình đã được đề xuất để giải thích cơ chế hoạt động của xylanase.