Nghiên cứu và tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm trên cây keo lai

Chuyên khảo phân tích Khoá luận tốt nghiệp tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu

• Tác giả: Bùi Văn Tuấn
• Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Thị Minh Hằng
• Trường học: Trường Đại Học Lâm Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Xạ Khuẩn Sinh Chất Kháng Sinh Chống Nấm Trên Cây Keo Lai
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về cây keo
• 1.2. Tình hình trồng keo lai tại Việt Nam
• 1.3. Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai
• 1.4. Giới thiệu về xạ khuẩn
• 1.4.1. Vị trí phân loại và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên
• 1.4.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
• 1.4.2.1. Đặc điểm hình thái
• 1.4.2.2. Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
• 1.4.2.3. Sự hình thành bào tử xạ khuẩn
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU - MỤC TIÊU – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
• 2.3. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp phân lập nấm bệnh
• 2.5.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ đất
• 2.5.3. Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống
• 2.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh
• 2.5.5. Phương pháp lên men thu sinh khối tế bào xạ khuẩn
• 2.5.6. Xác định hoạt tính enzyme của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
• 2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn
• 3.2. Phân lập xạ khuẩn
• 3.3. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu
• 3.4. Thuần khiết và lưu trữ giống xạ khuẩn phân lập được
• 3.5. Phân lập, thuần khiết và lưu trữ giống nấm gây bệnh trên cây keo lai
• 3.6. Phân lập nấm gây bệnh
• 3.7. Thuần khiết và bảo quản chủng giống
• 3.8. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh
• 3.8.1. Tuyển chọn sơ bộ ban đầu bằng phương pháp thỏi thạch
• 3.8.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao
• 3.9. Thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
• 3.10. Xác định hoạt tính của các loại enzyme ngoại bào
• 3.11. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cao
• 3.11.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
• 3.11.2. Quan sát đặc điểm hình thái và cuống sinh bào tử của một số chủng xạ khuẩn dưới kính hiển vi
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm

Nghiên cứu về xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm trên cây keo lai đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Xạ khuẩn, với khả năng sản sinh ra nhiều loại kháng sinh, đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc chống lại các loại nấm bệnh gây hại cho cây trồng. Việc tìm hiểu về các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

1.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu về xạ khuẩn đã được thực hiện từ nhiều năm qua. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc phân lập và xác định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn từ đất và môi trường tự nhiên. Kết quả cho thấy nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh mạnh mẽ, đặc biệt là trong việc chống lại các loại nấm bệnh trên cây trồng.

1.2. Vai trò của cây keo lai trong nông nghiệp

Cây keo lai (Acacia mangium x Acacia auriculiformis) được trồng rộng rãi tại Việt Nam nhờ vào khả năng sinh trưởng nhanh và chất lượng gỗ tốt. Tuy nhiên, cây keo lai cũng dễ bị tấn công bởi các loại nấm bệnh, gây thiệt hại lớn cho năng suất. Việc nghiên cứu các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh sẽ giúp bảo vệ cây trồng hiệu quả hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu xạ khuẩn

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng nghiên cứu về xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vẫn gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là việc phân lập và xác định các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao. Ngoài ra, việc phát triển các phương pháp nuôi cấy và bảo quản các chủng xạ khuẩn cũng là một thách thức không nhỏ.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập xạ khuẩn

Phân lập xạ khuẩn từ môi trường tự nhiên thường gặp khó khăn do sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Hơn nữa, các phương pháp phân lập truyền thống có thể không đủ nhạy để phát hiện các chủng xạ khuẩn hiếm gặp. Do đó, cần phát triển các phương pháp phân lập hiện đại hơn để tối ưu hóa quá trình này.

2.2. Thách thức trong việc xác định hoạt tính kháng sinh

Xác định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Tuy nhiên, việc này thường yêu cầu các phương pháp phức tạp và tốn thời gian. Cần có các tiêu chuẩn rõ ràng và phương pháp thử nghiệm hiệu quả để đánh giá chính xác hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn.

III. Phương pháp nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Để nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phân lập, nuôi cấy, và xác định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn. Việc áp dụng công nghệ sinh học hiện đại cũng giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

3.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ đất

Phân lập xạ khuẩn từ đất thường được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy đặc biệt. Các mẫu đất được thu thập từ các khu vực khác nhau và được xử lý để kích thích sự phát triển của xạ khuẩn. Sau đó, các khuẩn lạc được phân lập và xác định.

3.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

Để xác định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch thường được sử dụng. Phương pháp này cho phép đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của các loại nấm bệnh khác nhau, từ đó xác định được các chủng xạ khuẩn có tiềm năng cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Nghiên cứu về xạ khuẩn sinh chất kháng sinh không chỉ có ý nghĩa lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Các chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn có thể được sử dụng để bảo vệ cây trồng, giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại trong nông nghiệp.

4.1. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật

Các chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn có thể được sử dụng để phòng ngừa và điều trị các bệnh do nấm gây ra trên cây trồng. Việc sử dụng các sản phẩm này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn đảm bảo an toàn cho môi trường và sức khỏe con người.

4.2. Kết quả nghiên cứu và triển vọng

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh mạnh mẽ có thể giúp nâng cao năng suất cây trồng. Việc áp dụng các chế phẩm sinh học này trong sản xuất nông nghiệp sẽ góp phần vào việc phát triển nền nông nghiệp bền vững.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu xạ khuẩn

Nghiên cứu về xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm trên cây keo lai đang mở ra nhiều triển vọng mới cho nông nghiệp. Việc phát triển các phương pháp nghiên cứu hiện đại và ứng dụng các chế phẩm sinh học sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường.

5.1. Tương lai của nghiên cứu xạ khuẩn

Trong tương lai, nghiên cứu về xạ khuẩn sẽ tiếp tục được mở rộng với sự phát triển của công nghệ sinh học. Các phương pháp mới sẽ giúp phát hiện và phát triển các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao hơn, từ đó ứng dụng hiệu quả hơn trong nông nghiệp.

5.2. Định hướng phát triển bền vững

Việc sử dụng các chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần vào việc phát triển nền nông nghiệp bền vững. Định hướng này sẽ giúp giảm thiểu tác động tiêu cực của hóa chất đến môi trường và sức khỏe con người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một nƣớc nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm lƣợng mƣa lớn, nền nhiệt độ và độ ẩm không khi cao là điều kiện hết sức thuận lợi cho vi sinh vật phát triển trong đó có rất nhiều các loại vi sịnh vật có hại gây ảnh hƣởng tới đời sống con ngƣời và đặc biệt là với quá trình sản xuất nông nghiệp. Có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cho động vật, thực vật và theo ghi nhận hàng năm g y thiệt hại lớn cho ngành sản xuất nông – lâm – ngƣ nghiệp. Để giảm thiểu sự nguy hại của vi sinh vật gây bệnh chúng ta đã sử dụng 1 lƣợng lớn chất bảo vệ thực vật hóa học tuy đem lại hiệu quả nhanh và tức thời xong hệ lụy của nó để lại không hề nhỏ. Các chất độc hóa học khó tan, lắng đọng, gây ô nhiễm nguồn nƣớc không kh đất.

ảnh hƣởng xấu tới cuộc sống con ngƣời và sinh vật. Chính vì vậy tại Hội nghị tƣ vấn khu vực h u Thái Bình ƣơng của F O năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của trƣơng trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lƣợc là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phá hoại của vi sinh vật gây bệnh. Một trong những hƣớng giải quyết tối ƣu đƣa ra là sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh chất kháng sinh, chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Xạ khuẩn là một trong các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh đƣợc quan t m hàng đầu, bởi khả năng sinh chất kháng sinh với hàm lƣợng lớn đa dạng và hoạt tính cao.

Trong tổng số các chất kháng sinh đƣợc ghi nhận sinh ra từ vi sinh vật thì có tới 80% là do xạ khuẩn, trong số đó có những kháng sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988)[27], eo lai đã đƣợc 1 nghiên cứu nhân giống thành công bằng hom (Griffin, 1991).

Năm 1996 diện tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết năm 2004 diện tích trồng c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính diện tích trồng Keo lai khoảng 200. Nhƣng bên cạnh đó hàng năm nấm g y bệnh trên c y keo lai g y hậu quả rất nặng nề ảnh hƣởng lớn tới năng suất cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm c y giống, việc sử dụng thuốc hóa học BVTT gây ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe con ngƣời, vật nuôi và môi trƣờng sống. Vì vậy việc sử dụng các chế phẩm sinh học từ VSV là rất cần thiết và việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm g y bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật x y dựng một nền nông nghiệp an toàn và bền vững. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên theo xu hƣớng của công nghệ sinh học thế giới hiện nay cũng nhƣ để góp phần khai thác nguồn lợi VSV phong phú của khu vực Xuân Mai tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Tu n họn v n hiên u ts h n hu n h năn sinh hất hán sinh h n nấ ệnh trên o i ph n p ư Xuân Mai - Chươn Mỹ - Hà N i" 2 Ƣ NG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Tổng quan về cây keo 1.1 Tình hình trồng keo lai t i Việt Nam Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988) [27] Hiện nay keo lai đƣợc trồng rất nhiều quốc gia trên thế giới : Australia, Papua new Guinea va Indonexia , Malaixia, Philippin phù hợp với nhiều ñiều kiện sinh thái, cây phát triển nhanh, trồng dễ sống, trong một chu kỳ cho một sinh khối lớn hơn các loài keo khác và chất lƣợng gỗ cũng đẹp.

Sinh trƣởng và sản lƣợng: Qua các số liệu khảo nghiệm và trồng rừng thực tế thì sinh trƣởng c y keo lai sinh trƣởng rất nhanh và cho sinh khối lớn hơn rất nhiều so với các loài cây keo bố mẹ và các giống keo lai khác. Những giống đã qua chọn lọc và khảo nghiệm có thể đạt năng suất 18 - 25 m3/ha/năm ở các tỉnh miền Bắc, 30 - 40m3/ha/năm ở các tỉnh Đông Nam Bộ [27]. Keo lai có khả năng cố định đạm và khả năng cải tạo đất cao hơn eo tai tƣợng và Keo lá tràm, phù hợp với điều kiện đất trống đồi núi trọc ở nƣớc ta, gỗ keo lai có thể làm nguyên liệu giấy ván dăm sử dụng trong xây dựng đóng đồ mộc… tăng thu nhập đáng kể cho ngƣời trồng rừng. Vì thế eo lai đang là nhóm cây có diện tích trồng rừng lớn nhất ở nƣớc ta những năm gần đ y.

Năm 1996 diện tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết năm 2004 diện tích trồng c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính diện tích trồng Keo lai khoảng 200. Các bệnh do nấm h i gây ra trên cây keo lai 3 Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai gồm 4 loại bệnh tiêu biểu ệnh phấn trắng lá keo o nấm Oidium sp g y ra. Nấm bệnh mọc trên bề mặt lá non chồi non để hút dinh dƣỡng làm cho lá xoăn lại màu n u vàng khô chết nhƣng lá không rụng. Bệnh bắt đầu phát sinh vào tháng 11 nặng nhất là tháng 3 - 4.

Trong điều kiện th ch nghi và thời tiết m u bệnh rất dễ l y lan thành dịch. Sợi nấm có thể qua đông trên đốm vàng của lá già để năm sau x m nhiễm lá mới. ệnh thán thƣ (đốm than) o nấm Colletotrichum gloeosporioi g y ra. Bệnh phát sinh g y hại trên lá chủ yếu ở đầu ngọn lá và mép lá.

úc đầu lá mất màu rồi lan rộng dần vào phiến lá vết bệnh có thể làm khô đến nửa lá. Vết bệnh màu n u xám hoặc n u đen trên bề mặt vết bệnh có các đốm chấm đen nhỏ lúc trời ẩm có thể thấy nhiều bộ màu hồng. Trên cành non vết bệnh lõm xuống chung quanh có viền đen và giữa vết bệnh có các chấm đen nhỏ. Bệnh g y hại c y keo ở vƣờn ƣơm và rừng trồng làm c y sinh trƣởng chậm.

Bệnh phát triển mạnh vào tháng 3 - 5 tháng 6 giảm dần. ệnh đen thân o nấm Macrophomina phaseolina Tassi g y ra. Ban đầu gốc biến thành màu n u lá mất màu xanh bệnh phát triển dần lên ngọn làm lá khô héo rũ xuống phần vỏ th n co ngót tầng trong vỏ thối đen xốp hoặc dạng bột. Trong đó mọc nhiều hạch nấm màu đen.

Nấm bệnh có thể x m nhiễm vào phần gỗ phần tủy gỗ biến thành màu n u đen và lan dần đến phần rễ c y nhổ c y lên chỉ còn lại phần gỗ. Trong mùa nắng nóng nhiệt độ mặt đất lên cao phần gốc c y bị tổn thƣơng tạo điều kiện cho bệnh x m nhập g y hại. Ở những khu vực t ch tụ nhiều nƣớc tỷ lệ c y bệnh càng tăng lên rõ rệt. 4 Sau thời tiết mƣa phùn 10 - 15 ngày bệnh bắt đầu phát sinh.

Về sau tăng dần đến tháng 10. Nặng nhất là các tháng 6 7 8. ệnh nấm hồng o nấm Corticium salmonicolor Berk & Br g y ra ở những vùng có lƣợng mƣa cao. Bệnh thƣờng xuất hiện vào đầu mùa mƣa dấu hiệu đầu tiên bằng mắt thƣờng cũng dễ dàng nhận thấy có những đám màu trắng xuất hiện trên bề mặt vỏ th n c y hay cành c y ở ph a bị che bóng thƣờng ở vị tr từ 1/5 đến 1/4 chiều cao của c y t nh từ ngọn.

Đến cuối mùa mƣa lớp màu hồng da cam này nhạt dần màu trở nên màu trắng bẩn vỏ c y bị nứt ra để lộ một phần gỗ sợi nấm x m nhiễm vào th n cành c y cũng nhƣ toàn bộ lá của của c y từ chỗ bị nấm x m nhiễm lên đến ngọn bị héo chết có màu n u và không rụng ngay. Đỉnh ngọn c y bị chết đổ gẫy từ chỗ gốc c y mọc chồi mới. Trƣờng hợp nặng toàn bộ c y bị chết. Giới thiệu về xạ khuẩn 1.

Vị trí phân lo i và sự phân b x khu n trong tự nhiên Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc Tenericutes (gồm vi khuẩn gram dƣơng và xạ khuần, thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nh n sơ (prokaryota) [35]. Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ 110 chi và 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại đƣợc xếp vào nhóm XK hiếm [12,43]. Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzyme ngoại bào. Một phần rất lớn các chất kháng sinh đƣợc sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces, trong đó đƣợc biết đến nhất là streptomycin, erythromycin, tetracyclin [41].

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh 5 trƣởng hiếu khí và tạo khuẩn ty ph n nhánh tƣơng tự nhƣ nấm. Tên xạ khuẩn – actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và ban đầu xạ khuẩn đƣợc coi là vi nấm vì chúng sinh trƣởng giống với nấm. Mạng lƣới phân nhánh của thể sợi thƣờng phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất) [28]. Đ y là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn.

Xạ khuẩn là VK G(+) có tỷ lệ G+ cao (>55%) trong N .