Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Vi Sinh Vật Của Các Chủng Xạ Khuẩn Từ Vườn Quốc Gia Gò Lò Xa Mát

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học phân lập và sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn và nấm, điều tra thực trạng, phân tích số

• Tác giả: Diệp Quỳnh Như
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Phước Thọ
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Vi Sinh Vật Của Các Chủng Xạ Khuẩn Từ Vườn Quốc Gia Gò Lò Xa Mát
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mát
• 1.2. Vị trí địa lý
• 1.3. Địa hình và thủy văn
• 1.4. Đa dạng sinh học
• 1.5. Các kiểu thảm thực vật chính tại Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN
• 2.1. Giới thiệu chung và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên
• 2.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
• 2.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
• 2.2.2. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn
• 2.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn
• 2.3. Ứng dụng của xạ khuẩn trong thực tiễn
• 2.3.1. Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm
• 2.3.2. Trong lĩnh vực y học
• 2.4. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn
• 2.4.1. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
• 2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
• 2.4.2.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
• 2.4.2.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
• 2.4.3. Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Mẫu thí nghiệm
• 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
• 3.2.3. Phương pháp lấy mẫu
• 3.2.4. Phân lập các chủng xạ khuẩn
• 3.2.5. Phương pháp cấy chuyền giữ giống
• 3.2.6. Phương pháp quan sát khuẩn ty xạ khuẩn
• 3.2.7. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng sinh
• 3.2.8. Khảo sát các điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp chất kháng sinh
• 3.3. Định danh các chủng xạ khuẩn
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần
• 4.2. Mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hiển vi các chủng chọn lọc
• 4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật
• 4.4. Khảo sát các điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp chất kháng vi sinh vật của chủng N2
• 4.4.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
• 4.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp chất kháng vi sinh vật
• 4.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp chất kháng vi sinh vật
• 4.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tổng hợp chất kháng vi sinh vật
• 4.5. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật từ xạ khuẩn

Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn từ Vườn Quốc Gia Gò Lò Xa Mát là một nghiên cứu quan trọng nhằm tìm kiếm các nguồn kháng sinh tự nhiên. Xạ khuẩn, đặc biệt là thuộc chi Streptomyces, được biết đến với khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật. Nghiên cứu này không chỉ giúp phát hiện các chủng xạ khuẩn mới mà còn góp phần vào việc phát triển các biện pháp sinh học trong nông nghiệp.

1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn và vai trò của chúng

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn có khả năng sản xuất nhiều hợp chất sinh học, bao gồm cả kháng sinh. Chúng thường được tìm thấy trong đất và có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh. Nghiên cứu cho thấy, xạ khuẩn có thể tiết ra các chất ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác, từ đó giúp bảo vệ cây trồng.

1.2. Tầm quan trọng của Vườn Quốc Gia Gò Lò Xa Mát

Vườn Quốc Gia Gò Lò Xa Mát có hệ sinh thái đa dạng, là nơi lý tưởng để nghiên cứu các chủng xạ khuẩn. Địa hình và khí hậu tại đây tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của xạ khuẩn, từ đó mở ra cơ hội tìm kiếm các hợp chất kháng vi sinh vật mới.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu xạ khuẩn

Mặc dù xạ khuẩn có tiềm năng lớn trong việc sản xuất kháng sinh, nhưng việc phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật vẫn gặp nhiều thách thức. Sự đa dạng sinh học và điều kiện môi trường là những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất chất kháng sinh của xạ khuẩn.

2.1. Những khó khăn trong việc phân lập xạ khuẩn

Phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất không phải là một nhiệm vụ đơn giản. Các yếu tố như độ pH, độ ẩm và thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của xạ khuẩn. Do đó, việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy là rất cần thiết.

2.2. Thách thức trong việc xác định hoạt tính kháng vi sinh vật

Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn cũng gặp nhiều khó khăn. Các phương pháp khảo sát cần phải được lựa chọn cẩn thận để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả. Việc sử dụng các vi sinh vật thử nghiệm phù hợp là rất quan trọng.

III. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật từ xạ khuẩn

Nghiên cứu này sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn. Các phương pháp này bao gồm phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm hoạt tính kháng sinh. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và hạn chế riêng.

3.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn

Phân lập xạ khuẩn được thực hiện trên các môi trường SCA và Gause I bằng phương pháp cấy trải. Phương pháp này giúp thu được các chủng xạ khuẩn thuần khiết để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.

3.2. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật

Hoạt tính kháng vi sinh vật được khảo sát bằng phương pháp thỏi thạch và khoanh giấy lọc. Các chủng xạ khuẩn được thử nghiệm với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh khác nhau để đánh giá khả năng kháng của chúng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 30 chủng xạ khuẩn từ mẫu đất tại Vườn Quốc Gia Gò Lò Xa Mát. Trong số đó, 8 chủng cho thấy khả năng kháng mạnh đối với các vi sinh vật gây bệnh. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp.

4.1. Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật

Trong số 30 chủng xạ khuẩn, 8 chủng đã được xác định có khả năng kháng mạnh đối với Phytophthora sp. oxysporum và V. parahaemolyticus. Đây là những vi sinh vật gây bệnh phổ biến trong nông nghiệp, việc phát hiện các chủng kháng này có ý nghĩa lớn trong việc phát triển các biện pháp sinh học.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh

Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu việc sử dụng hóa chất trong nông nghiệp mà còn bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn từ Vườn Quốc Gia Gò Lò Xa Mát đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các sản phẩm sinh học. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để khai thác tiềm năng của xạ khuẩn trong sản xuất kháng sinh.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các điều kiện tối ưu cho sự phát triển và sản xuất kháng sinh của xạ khuẩn. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng trong thực tiễn.

5.2. Hướng đi mới trong phát triển sản phẩm sinh học

Việc phát triển các sản phẩm sinh học từ xạ khuẩn không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp. Cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp để đưa các sản phẩm này vào ứng dụng thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ầm, mưa nhiều rất thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển, trong đó có các vi sinh vật gây hại trên cây trồng và động vật. Hàng năm, trên thế gidi Các VI nam gay bệnh thực vật như đạo ôn, thối rễ, đốm nâu, đã gây ton thất nặng nề cho mùa mang, chúng chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng. Việc sử dụng thuốc hóa học phòng trừ các vi sinh vật gây hại từ lâu đã phd biến ở Việt Nam với các chủng loại rất đa dạng. Điều này sẽ dẫn đến việc nhờn thuốc ở các vi sinh vật gây bệnh, mặt khác sẽ gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người, động vật khác và làm mắt cân bằng hệ sinh thái.

Hiện nay, biện pháp sử dụng các tác nhân sinh học thay thế tác nhân hóa học được xem là chiến lược. Việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh là một trong những giải pháp đó. Xạ khuẩn được biết đến là một trong những đối tượng quan trọng nhất trong sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học. Chúng có khả năng tiết ra các chất chuyền hóa thứ cấp ức chế sinh trưởng (như kháng sinh, độc tố, chất hoạt động bề mặt, chat dé bay hơi) có thé ngăn chặn hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác.

Trong khoảng hơn 8000 chất kháng sinh được biết đến trên thế giới hiện nay thì có hơn 80% trong số đó có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces được xem là nguồn cơ chất sản xuất chất kháng sinh nhiều nhất. Thành phần xạ khuẩn trong đất vô cùng phong phú, tuy nhiên khoảng 50 năm qua, sự bùng nỗ của các nghiên cứu sang lọc xạ khuẩn từ đất khiến các chủng loài mới, cũng như kháng sinh mới từ nguồn cơ chất này chạm ngưỡng bão hòa. Thu thập đất từ những vị trí địa lý, thé nhưỡng có tính chat đặc biệt hơn là một trong những chiến lược tìm kiếm loài mới, kháng sinh mới từ xạ khuẩn.

Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mat tỉnh Tây Ninh có địa hình đôi thấp, trang đất ngập nước theo mùa của các sông, suối tự nhiên góp phan tạo thành một hệ sinh thái vô cùng phong phú và độc đáo. Đó là lý do em thực hiện đề tài: “Phân lập và sàng lọc chủng xạ khuẩn có kha năng kháng vi khuẩn và nam bệnh từ Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mát ở tỉnh Tây Ninh” với mong muốn tìm ra chủng xạ khuẩn có khả năng kháng các bệnh trong nông nghiệp, góp phan xây dựng và phát triển ngành nông nghiệp an toan và bên vững. Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn, khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của xạ khuẩn, đồng thời khảo sát các điều kiện lên men khác nhau ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nam. Nội dung thực hiện Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn trong mẫu đất từ Vườn quốc gia Lò Gò Xa Mat tỉnh Tay Ninh.

Khao sát hoạt tính đối kháng của xa khuan phân lập với sinh vật thử nghiệm: Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Neoscytalidium dimidiatum, Candida albicans, Vibrio parahaemolyticus. Khảo sát các điều kiện lên men ảnh hưởng đến kha năng tổng hợp chat kháng vi sinh vật. Định danh bang sinh học phân tử các chủng xạ khuẩn tuyển chọn. TONG QUAN TÀI LIEU 2.

Giới thiệu Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mat 2. Vị trí địa lý Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát nằm trên địa phận 6 xã: Tân Bình, Tân Lập, Hòa Hiệp, Thạnh Tây, Thạnh Bình và Thạnh Bắc thuộc huyện Tân Biên, tỉnh Tây Ninh, cách thành phố Tây Ninh khoảng 50 km về phía bắc tây bắc, theo đường 781, là khu vực có rừng che phủ lớn nhất tại tỉnh Tây Ninh với tổng điện tích 30022 ha trong vùng sinh thái nông nghiệp Đông Nam Bộ. Địa hình và thủy văn Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát rải rác có những gò cao với độ cao không vượt quá 25 m so với mực nước biển. Cả vùng có độ đốc trung bình 1° - 5° do vật Vườn quốc gia có địa hình gần như bằng phẳng.

Vườn gồm có đất phù sa cổ, đất phù sa sông suối, đất phù sa có tầng laterit và đất xám đọng mùn tầng mặt. Con sông lớn nhất trong khu vực là sông Vàm Cỏ Đông. Con sông này bắt nguồn từ Campuchia, đồng thời cũng là một đoạn của biên giới dài 16 km giữa Việt Nam và Campuchia. Trong Vườn quốc gia có một số sông suối nhỏ chảy vào sông Vàm Cỏ như sông Da Hà ở phía đông bắc và các sông Mec Mu, Xa Nghé, Tà Dot, Bà Diệc.

Da dang sinh học Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát nằm ở vị trí chuyển tiếp giữa nam Tây Nguyên, miền Đông Nam Bộ xuống vùng Đồng bằng sông Cửu Long, có các dạng địa hình đồi thấp, bàu, trảng đất ngập nước theo mùa, các sông, suối tự nhiên. Những đặc trưng chỉ có ở Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mat mà các Vườn quốc gia khác không có, chi phối và liên quan đến sự phân bố của thảm thực vật rừng, đa dạng sinh học của Vườn. Gồm nhiều hệ động, thực vật rừng và các loài nguy cấp, quý hiểm. Các kiểu thảm thực vật chính tại Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát: kiểu rừng nguyên sinh và thứ sinh thường xanh cây lá rộng theo mùa, kiểu rừng sao dau thứ sinh trên đất ngập nước theo mùa trên đất ferralit nông hoặc cạn, kiểu rừng khô thưa thứ sinh ngập nước theo mùa trên dat ngập nước ưu thế họ Sao Dầu và Tràm và trảng ngập nước theo mùa thứ sinh ưu thế Tràm và Randia, trang cỏ ngập nước theo mùa, rừng thứ sinh cây bụi trang có ngập nước ven sông, lòng suôi.

Tổng quan về xạ khuẩn 2. Giới thiệu chung và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên Xa khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn thuộc nganh Actinobacteria, lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, gom 10 bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đó có 478 loại xa khuẩn đã được công bồ thuộc chi Streptomyces, hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được sắp xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006). Sự phân bồ của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật.

Theo Waksman thì trong 1 gam đất có khoảng 29000 - 2400000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vật. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xa khuẩn có rat ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong dat cũng thay đối theo thời gian trong năm. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn thường 25 - 30 °C.

Tuy nhiên xạ khuẩn cũng phát triển ở nhiệt độ cao 50 - 60 °C và xạ khuẩn phát triển ở nhiệt độ thấp. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Giống như các loại vi sinh vật khác, khi nuôi cấy trên môi trường thạch, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tuy nhiên, tùy theo loài và môi trường nuôi cấy khác nhau mà kích thước, màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như: đỏ, da cam, vàng, nâu, tím, trắng, xám,.

Khuan lạc của xạ khuẩn rat đặc biệt, không trơn ướt như vi khuẩn hay nắm men, khuẩn lạc thường khô, chắc, xù xì, có dang da, dang nhung tơ, hay dạng màng đẻo có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ và thường có cấu trúc ba lớp: lớp ngoài có cấu trúc các sợi bền chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong và lớp trong có cau trúc tương đối xốp (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2006). Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn sinh trưởng trong môi trường sẽ tạo ra hệ sợi cơ chất và ngoài mặt môi trường tạo ra hệ sợi khí sinh. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng, đen, nâu,. Hệ sợi cơ chất có thé sinh ra các sắc tố tan trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ.

Hệ sợi khí sinh ở tận cùng thường là các chuỗi bào tử có dang xoắn, lượn sóng, thang, vòng. Xa khuẩn có thé mọc thành dang mang hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy khi nuôi cấy trong môi trường dịch thé, trên bề mặt môi trường hay thành dang bọt hoặc 4 kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy dao thì xạ khuẩn phát triển thành dang sợi bông hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả 1a xạ khuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa day môi trường, kích thước từ 0,1 mm đến 2 - 3 mm.

Bào tử trấn Khuẩn ti khí sinh Sợi bào tử — Cơ chất đặc Khuẩn ti cơ chất Hình 2. Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống bao tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn.

Hình thái, cuống sinh bào tử và bảo tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bao tử của xạ khuẩn. Tùy theo từng loại mà cuống sinh bào tử có thé thang hay uốn cong hay xoắn ốc; chúng có thé mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh bào tử có thể từ 5 - 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thé thay đổi 5 - 7 nm. Bao tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dai của cuống bảo tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẫn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dai thành dạng lông.

Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra nhiều đạng: bảo tử màng mỏng gọi là bào tử trần, bao tử nam trong bao nang (sporangium) gọi là nang bào tử hay bào tử kin (sporangiospores), bào tử sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành vách ngăn (septa).