Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, lượng mưa lớn, tạo môi trường thuận lợi cho hệ sinh vật phát triển, đồng thời cũng là điều kiện bùng phát nhiều chủng vi sinh vật gây hại cho cây trồng và vật nuôi. Các bệnh lý thực vật do nấm như đạo ôn, thối rễ, đốm nâu chiếm tới 83% tổng số bệnh trên cây trồng, gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế và sản lượng nông sản. Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong thời gian dài đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật gây bệnh, tồn dư hóa chất độc hại, gây ô nhiễm môi trường đất, nước và làm mất cân bằng hệ sinh thái nông nghiệp. Xu hướng sử dụng các chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật đối kháng để thay thế hóa chất bảo vệ thực vật là hướng đi cần thiết nhằm xây dựng nền nông nghiệp bền vững.

Xạ khuẩn (Actinobacteria) là nhóm vi sinh vật hoại sinh quan trọng bậc nhất trong sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hơn 80% trong số hơn 8.000 chất kháng sinh tự nhiên được phát hiện trên thế giới có nguồn gốc từ xạ khuẩn, đặc biệt là chi Streptomyces. Tuy nhiên, sau nhiều thập kỷ phân lập xạ khuẩn từ đất canh tác thông thường, khả năng tìm ra các chủng mới và kháng sinh mới đã chạm ngưỡng bão hòa. Việc thu thập mẫu đất từ các khu bảo tồn thiên nhiên có tính chất thổ nhưỡng đặc thù, hệ sinh thái ngập nước theo mùa là chiến lược khả thi để tìm kiếm các loài xạ khuẩn mới có hoạt tính kháng sinh cao. Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát (tỉnh Tây Ninh) sở hữu địa hình chuyển tiếp độc đáo giữa nam Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long với các trảng đất ngập nước theo mùa, tạo nên khu hệ vi sinh vật bản địa phong phú.

Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn đất từ Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát có khả năng sinh chất kháng khuẩn và kháng nấm bệnh; khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến hoạt tính sinh tổng hợp chất kháng của chủng tiềm năng; đồng thời định danh sinh học phân tử các chủng tuyển chọn.

Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được triển khai theo văn bản gồm 4 nội dung:

  1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn trong mẫu đất thu thập tại Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát, tỉnh Tây Ninh.
  2. Khảo sát hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn phân lập được với 5 vi sinh vật kiểm nghiệm: Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Neoscytalidium dimidiatum, Candida albicans và Vibrio parahaemolyticus.
  3. Khảo sát các điều kiện lên men (môi trường, nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ) ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn tiềm năng.
  4. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử đối với các chủng xạ khuẩn tuyển chọn.

Đối tượng nghiên cứu là các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất và 5 chủng vi sinh vật chỉ thị kiểm nghiệm gây bệnh trên thực vật, người và thủy sản (Phytophthora sp., F. oxysporum, N. dimidiatum, C. albicans, V. parahaemolyticus). Phạm vi nghiên cứu về mặt không gian tập trung vào 6 mẫu đất thu tại Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát (huyện Tân Biên, tỉnh Tây Ninh) và các thí nghiệm chuyên sâu được thực hiện tại phòng Vi sinh ứng dụng RIBE 212 thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện đề tài diễn ra từ tháng 03/2023 đến tháng 08/2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu dựa trên cơ sở sinh học và phân loại học của xạ khuẩn (Actinobacteria). Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương hoại sinh, hiếu khí, có tỷ lệ guanine-cytosine (GC) trong DNA cao trên 55%. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường đặc biệt gồm hệ sợi khuẩn ty cơ chất (KTCC) ăn sâu vào môi trường và hệ sợi khuẩn ty khí sinh (KTKS) phát triển trên bề mặt. Quá trình sinh sản của xạ khuẩn diễn ra thông qua bào tử trần hoặc bào tử nang hình thành trên cuống sinh bào tử ở đầu khuẩn ty khí sinh, với các dạng hình thái thẳng/lượn sóng (RF - Rectiflexibiles), móc câu/xoắn không hoàn toàn (RA - Retinaculiaperti) hoặc xoắn hoàn toàn (S - Spirales). Quá trình phân loại hình thái dựa trên Khóa phân loại Bergey. Về mặt sinh lý, xạ khuẩn có khả năng chuyển hóa thứ cấp phức tạp, tiết ra các chất kháng sinh thuộc nhiều nhóm cấu trúc để cạnh tranh sinh học. Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu sự chi phối mạnh mẽ của cơ chế điều hòa dị hóa carbon, nguồn đạm hữu cơ/vô cơ, nồng độ phosphat, độ thông khí và nhiệt độ lên men.

Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được áp dụng bao gồm:

  • Thu thập và xử lý mẫu đất: Thu thập 6 mẫu đất tại Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát ở tầng đất sâu 5 - 10 cm, khối lượng mỗi mẫu từ 10 - 20 g, đựng trong túi nilon vô trùng và bảo quản ở 4 °C trước khi xử lý trong vòng 24 giờ.
  • Phân lập và làm thuần: Pha loãng mẫu đất theo nồng độ thập phân từ $10^{-1}$ đến $10^{-4}$ trong nước cất vô trùng. Hút 0,1 mL dịch ở nồng độ $10^{-3}$ và $10^{-4}$ cấy trải trên hai môi trường thạch Starch Casein Agar (SCA) và Gause I, ủ ở 30 °C trong 4 - 7 ngày. Khuẩn lạc nghi ngờ được cấy ria làm thuần trên môi trường ISP2. Giữ giống trên ống thạch nghiêng ISP2 (ở 4 °C, cấy chuyền định kỳ hàng tháng) và trong dung dịch glycerol 20% bổ sung peptone 1% ở -20 °C.
  • Quan sát hình thái và vi thể: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc (dạng khô, vòng tròn đồng tâm phóng xạ, màu sắc KTCC và KTKS). Nhuộm màu tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram (Crystal Violet, dung dịch Lugol, cồn tẩy màu) và soi dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40X và 100X với dầu soi kính.
  • Đánh giá hoạt tính kháng sinh:
    • Phương pháp thỏi thạch: Áp dụng đánh giá hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (nuôi trên môi trường LB) và nấm men Candida albicans (nuôi trên môi trường PDA). Thỏi thạch xạ khuẩn nuôi 7 ngày trên ISP2 được đặt lên bề mặt đĩa thạch đã trải dịch vi sinh vật kiểm định mật độ $10^6$ CFU/mL.
    • Phương pháp đồng nuôi cấy: Áp dụng với các chủng nấm sợi (Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Neoscytalidium dimidiatum). Nấm bệnh được cấy tại tâm đĩa petri chứa môi trường PDA, chủng xạ khuẩn được cấy tại 4 góc xung quanh. Đo đường kính sau 4 - 7 ngày nuôi ở 30 °C.
    • Phương pháp khoanh giấy lọc: Đánh giá hoạt tính dịch lên men. Khoanh giấy vô trùng đường kính 6 mm được tẩm 0,1 mL dịch chiết lên men (tỷ lệ 1 mL cho 10 khoanh giấy) và đặt lên bề mặt môi trường đã trải vi sinh vật kiểm định.
    • Công thức tính kích thước vòng kháng: $$\text{Kích thước vòng kháng} = D - d \text{ (mm)}$$ Trong đó $D$ là đường kính vòng kìm hãm, $d$ là đường kính thỏi thạch, khoanh giấy hoặc khuẩn lạc. Quy ước đánh giá: không kháng ($D - d = 0$), kháng yếu ($< 5\text{ mm}$), kháng trung bình ($5 - 10\text{ mm}$), kháng mạnh ($> 10\text{ mm}$).
  • Khảo sát điều kiện lên men chủng N2: Nuôi cấy trong bình nón 250 mL chứa 100 mL môi trường, tỷ lệ tiếp giống 4%, nuôi lắc 220 vòng/phút trong 120 giờ. Thí nghiệm khảo sát lần lượt 4 yếu tố:
    • Môi trường lên men: Gause I, ISP4, M177, M180.
    • Nguồn carbon (thay thế trong môi trường cơ sở): Tinh bột, glucose, maltose, sucrose.
    • Nguồn nitơ (thay thế trong môi trường cơ sở): Peptone, cao thịt, bột đậu tương, $(NH_4)_2SO_4$.
    • Nhiệt độ lên men: 5 °C, 20 °C, 30 °C, 38 °C.
  • Định danh sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng dung dịch CTAB ở 60 °C trong 1 giờ, tinh sạch bằng phenol : chloroform : isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), kết tủa bằng isopropanol và rửa tủa bằng ethanol 70%. Khuếch đại gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt cho xạ khuẩn:
    • Mồi xuôi Act-235: 5'-CGCGGCCTATCAGCTTGTTTG-3'
    • Mồi ngược Act-878: 5'-CCGTACTCCCCAGGCGGGG-3' Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose và gửi giải trình tự tại Viện Sinh học Phân tử Loci. So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLASTn. Dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 11.
  • Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm lặp lại 3 lần, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn bằng Excel 2016. Phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) với mức ý nghĩa $P = 0{,}05$ bằng phần mềm Minitab 16.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Mở đầu

Tác giả nêu bật thực trạng thiệt hại do nấm bệnh và vi khuẩn gây ra trong nông nghiệp, chỉ rõ hệ lụy của việc lạm dụng hóa chất bảo vệ thực vật. Đề tài xác định hướng tiếp cận khai thác nguồn xạ khuẩn đất bản địa tại Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát, đưa ra mục tiêu cụ thể và phân chia 4 nội dung công việc thực nghiệm từ khâu phân lập, thử hoạt tính kháng sinh, tối ưu lên men đến định danh phân tử.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học liên quan đến đề tài. Phần đầu giới thiệu đặc điểm địa lý, khí hậu, thủy văn sông Vàm Cỏ Đông, cùng hệ thảm thực vật đa dạng tại Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát với tổng diện tích 30.022 ha. Phần tiếp theo trình bày hệ thống phân loại xạ khuẩn, đặc điểm hình thái, cấu trúc ba lớp của khuẩn lạc, cơ chế tạo cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử, đặc điểm sinh lý sinh hóa (nhu cầu nguồn carbon, nitơ, tính chất hiếu khí, tỷ lệ GC cao). Tác giả phân tích chi tiết các ứng dụng thực tiễn của xạ khuẩn trong nông nghiệp, công nghệ thực phẩm và y học; phân tích các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh và các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình lên men (nhiệt độ, pH, độ thông khí, nguồn carbon, nitơ, nồng độ phosphat vô cơ dưới 10 mg/mL). Cuối chương là bảng tổng thuật các công trình nghiên cứu xạ khuẩn tiêu biểu trên thế giới và tại Việt Nam từ năm 1928 đến năm 2022.

Chương 3. Vật liệu và phương pháp

Tác giả trình bày chi tiết địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu. Mô tả công thức thành phần hóa học chính xác của 8 loại môi trường nuôi cấy (SCA, Gause I, ISP2, ISP4, M177, M180, LB, PDA). Trình bày đầy đủ các bước thực nghiệm: quy trình lấy 6 mẫu đất; kỹ thuật pha loãng và cấy trải; quy trình giữ giống ngắn hạn và dài hạn; phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu Gram; quy trình bố trí thí nghiệm đối kháng vi sinh vật bằng 3 phương pháp (thỏi thạch, đồng nuôi cấy, khoanh giấy lọc); sơ đồ bố trí thí nghiệm đơn yếu tố khảo sát điều kiện lên men của chủng N2; quy trình tách chiết DNA bằng CTAB kết hợp phenol-chloroform; thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt với cặp mồi Act-235/Act-878; cùng phương pháp phân tích thống kê trên phần mềm Minitab 16 và MEGA 11.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các phát hiện thực nghiệm kèm theo dữ liệu định lượng:

  • Kết quả phân lập và làm thuần: Từ 6 mẫu đất đã phân lập được 30 chủng xạ khuẩn trên môi trường SCA và Gause I. Sau khi làm thuần trên ISP2, tác giả ghi nhận và lập bảng mô tả chi tiết đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 16 chủng (N1 đến N16). Hầu hết các khuẩn lạc có bề mặt khô, hình tròn đồng tâm, phát triển dạng phóng xạ; màu sắc khuẩn ty cơ chất đa dạng (trắng, vàng nhạt, xám nhạt, xanh, cam nhạt); màu sắc khuẩn ty khí sinh chủ yếu là xám, trắng và nâu nhạt.
  • Đặc điểm hình thái hiển vi: Quan sát tiêu bản nhuộm màu dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 100X cho thấy 8 chủng tiềm năng (N1 đến N8) đều là vi khuẩn Gram dương, tế bào có dạng sợi phân nhánh phức tạp và chuỗi bào tử dài.
  • Hoạt tính kháng vi sinh vật của 8 chủng tiềm năng: Khảo sát sơ bộ cho thấy cả 8 chủng đều có khả năng ức chế nấm sợi thực vật (Phytophthora sp., N. dimidiatum, F. oxysporum). Riêng đối với nấm men C. albicans, chỉ duy nhất chủng N2 thể hiện hoạt tính đối kháng. Có 4 chủng ức chế được vi khuẩn V. parahaemolyticus (N1, N2, N6, N7). Chủng N1 và N2 có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh nhất.

Dưới đây là số liệu chi tiết về đường kính vòng kháng của 8 chủng xạ khuẩn tiềm năng:

Chủng xạ khuẩn Phytophthora sp. (mm) N. dimidiatum (mm) F. oxysporum (mm) C. albicans (mm) V. parahaemolyticus (mm)
N1 $10{,}33 \pm 1{,}53^{\text{a}}$ $12{,}17 \pm 0{,}76^{\text{a}}$ $11{,}00 \pm 1{,}00^{\text{a}}$ 0 $6{,}33 \pm 0{,}29^{\text{b}}$
N2 $11{,}67 \pm 1{,}53^{\text{a}}$ $12{,}83 \pm 0{,}76^{\text{a}}$ $9{,}83 \pm 0{,}29^{\text{b}}$ $11{,}00 \pm 0{,}50^{\text{a}}$ $8{,}83 \pm 0{,}76^{\text{a}}$
N3 $5{,}67 \pm 0{,}58^{\text{bc}}$ $8{,}67 \pm 1{,}15^{\text{bc}}$ $9{,}67 \pm 2{,}08^{\text{b}}$ 0 0
N4 $6{,}00 \pm 1{,}00^{\text{b}}$ $7{,}83 \pm 0{,}76^{\text{c}}$ $8{,}67 \pm 1{,}15^{\text{b}}$ 0 0
N5 $2{,}67 \pm 0{,}58^{\text{d}}$ $6{,}83 \pm 1{,}04^{\text{c}}$ $8{,}67 \pm 0{,}58^{\text{b}}$ 0 0
N6 $5{,}67 \pm 1{,}15^{\text{bc}}$ $9{,}17 \pm 1{,}04^{\text{b}}$ $9{,}33 \pm 0{,}58^{\text{b}}$ 0 $3{,}33 \pm 0{,}58^{\text{d}}$
N7 $3{,}67 \pm 0{,}58^{\text{cd}}$ $11{,}33 \pm 1{,}15^{\text{a}}$ $9{,}17 \pm 0{,}76^{\text{b}}$ 0 $5{,}17 \pm 0{,}29^{\text{c}}$
N8 $5{,}00 \pm 1{,}73^{\text{bc}}$ $7{,}17 \pm 1{,}04^{\text{c}}$ $7{,}83 \pm 0{,}29^{\text{b}}$ 0 0

(Ghi chú: Giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn của 3 lần lặp lại; các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức $P = 0{,}05$).

  • Khảo sát điều kiện lên men của chủng N2:
    • Môi trường: Môi trường ISP4 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất trên cả 5 chủng chỉ thị với vòng vô khuẩn vượt trội: F. oxysporum ($28{,}00 \pm 2{,}00\text{ mm}$), Phytophthora sp. ($17{,}83 \pm 0{,}29\text{ mm}$), N. dimidiatum ($15{,}17 \pm 1{,}04\text{ mm}$), C. albicans ($12{,}83 \pm 1{,}04\text{ mm}$) và V. parahaemolyticus ($10{,}83 \pm 1{,}04\text{ mm}$). Trên môi trường M180, chủng N2 hoàn toàn mất hoạt tính kháng C. albicans và V. parahaemolyticus.
Vi sinh vật kiểm định Môi trường Gause I (mm) Môi trường ISP4 (mm) Môi trường M177 (mm) Môi trường M180 (mm)
Phytophthora sp. $13{,}67 \pm 0{,}58^{\text{b}}$ $17{,}83 \pm 0{,}29^{\text{a}}$ $11{,}83 \pm 0{,}29^{\text{c}}$ $13{,}83 \pm 0{,}29^{\text{b}}$
N. dimidiatum $11{,}17 \pm 1{,}04^{\text{b}}$ $15{,}17 \pm 1{,}04^{\text{a}}$ $8{,}50 \pm 0{,}50^{\text{c}}$ $13{,}17 \pm 1{,}04^{\text{b}}$
F. oxysporum $22{,}83 \pm 1{,}04^{\text{b}}$ $28{,}00 \pm 2{,}00^{\text{a}}$ $17{,}67 \pm 2{,}08^{\text{c}}$ $17{,}50 \pm 2{,}18^{\text{c}}$
C. albicans $4{,}17 \pm 0{,}29^{\text{b}}$ $12{,}83 \pm 1{,}04^{\text{a}}$ $3{,}67 \pm 0{,}58^{\text{b}}$ $0$
V. parahaemolyticus $3{,}17 \pm 0{,}29^{\text{b}}$ $10{,}83 \pm 1{,}04^{\text{a}}$ $3{,}67 \pm 0{,}58^{\text{b}}$ $0$
  • Nguồn carbon: Tinh bột kích thích sinh tổng hợp chất kháng mạnh nhất. Ngược lại, khi sử dụng sucrose làm nguồn carbon duy nhất, dịch lên men của chủng N2 không còn khả năng ức chế nấm men C. albicans và vi khuẩn V. parahaemolyticus.
  • Nguồn nitơ: Peptone là nguồn đạm phù hợp nhất để chủng N2 sinh tổng hợp hợp chất kháng sinh thứ cấp, vượt trội hơn so với bột đậu tương, cao thịt và $(NH_4)_2SO_4$.
  • Nhiệt độ lên men: Hoạt tính kháng sinh được ghi nhận ổn định nhất ở nhiệt độ 30 °C.
  • Kết quả định danh sinh học phân tử: Khuếch đại vùng gen 16S rRNA bằng cặp mồi Act-235 và Act-878 cho băng sản phẩm rõ nét. Kết quả so sánh trình tự trên GenBank (NCBI) bằng BLASTn xác định:
    • Chủng N1 có độ tương đồng trình tự nucleotide 100% với loài Streptomyces costaricanus (mã số truy cập tham chiếu MT124459.1).
    • Chủng N2 có độ tương đồng trình tự nucleotide 100% với loài Streptomyces noursei (mã số truy cập tham chiếu MN519495.1).

Chương 5. Kết luận và đề nghị

Tác giả tóm tắt kết quả phân lập được 30 chủng xạ khuẩn, tuyển chọn 8 chủng tiềm năng, xác định N1 và N2 có hoạt tính mạnh nhất; thiết lập điều kiện lên men tối ưu cho chủng N2 (môi trường ISP4, nguồn carbon là tinh bột, nguồn nitơ là peptone, nhiệt độ 30 °C); định danh thành công hai loài S. costaricanus (N1) và S. noursei (N2) với độ tương đồng 100%. Phần đề nghị đưa ra 5 định hướng thực nghiệm tiếp nối.

Kết quả và đóng góp khoa học

Đề tài đã phân lập thành công 30 chủng xạ khuẩn từ 6 mẫu đất thu thập tại Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát, tỉnh Tây Ninh. Từ 16 chủng được mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, nghiên cứu đã tuyển chọn được 8 chủng có tiềm năng kháng vi sinh vật mạnh. Toàn bộ 8 chủng tuyển chọn đều có khả năng ức chế 3 loại nấm gây bệnh thực vật (Phytophthora sp., N. dimidiatum, F. oxysporum). Hai chủng xạ khuẩn N1 và N2 thể hiện hoạt tính kháng sinh vượt trội nhất. Đặc biệt, chủng N2 có phổ ức chế rộng nhất khi đối kháng đồng thời cả 5 sinh vật kiểm nghiệm: nấm Phytophthora sp. ($11{,}67 \pm 1{,}53\text{ mm}$), nấm N. dimidiatum ($12{,}83 \pm 0{,}76\text{ mm}$), nấm F. oxysporum ($9{,}83 \pm 0{,}29\text{ mm}$), nấm men C. albicans ($11{,}00 \pm 0{,}50\text{ mm}$) và vi khuẩn gây bệnh trên tôm V. parahaemolyticus ($8{,}83 \pm 0{,}76\text{ mm}$).

Nghiên cứu đã xác lập các thông số lên men thích hợp cho chủng N2 nhằm tối đa hóa hoạt tính kháng sinh trong dịch nuôi cấy: môi trường ISP4, nguồn carbon bổ sung là tinh bột, nguồn nitơ là peptone và nhiệt độ lên men 30 °C trong điều kiện nuôi lắc 220 vòng/phút suốt 120 giờ. Ở điều kiện này, dịch lên men của chủng N2 ức chế nấm F. oxysporum tạo vòng kháng lên đến $28{,}00 \pm 2{,}00\text{ mm}$.

Bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi chuyên biệt Act-235/Act-878, nghiên cứu đã định danh chính xác hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn:

  • Chủng N1: Streptomyces costaricanus (độ tương đồng 100%, mã NCBI tham chiếu MT124459.1).
  • Chủng N2: Streptomyces noursei (độ tương đồng 100%, mã NCBI tham chiếu MN519495.1).

Về mặt học thuật và thực tiễn, công trình đóng góp dẫn liệu thực nghiệm về hệ vi sinh vật đất tại Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát, bổ sung các nguồn giống xạ khuẩn bản địa có hoạt tính sinh học cao vào bộ sưu tập chủng giống vi sinh. Kết quả định danh hai loài S. costaricanus (được biết đến trong tài liệu y sinh có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D và ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase) và S. noursei (loài sản sinh nystatin, ningnanmycin và polyfungin B) mở ra tiềm năng sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh héo rũ, thối rễ trên cây trồng và vi khuẩn Vibrio trong nuôi trồng thủy sản.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Công trình còn một số hạn chế nhất định phản ánh đúng phạm vi của một khóa luận tốt nghiệp thực nghiệm:

  • Toàn bộ các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm mới chỉ thực hiện ở quy mô in vitro trong phòng thí nghiệm; chưa đánh giá hiệu lực phòng trị bệnh thực tế trên cây trồng ngoài nhà màng hay đồng ruộng, cũng như chưa thử nghiệm trên động vật thủy sản.
  • Đề tài chưa tiến hành chiết xuất, tách dòng và tinh sạch các hợp chất kháng sinh thứ cấp cụ thể từ dịch lên men, do đó chưa xác định được cấu trúc hóa học chính xác của hoạt chất kháng sinh do hai chủng N1 và N2 tiết ra.
  • Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men của chủng N2 mới chỉ khảo sát 4 yếu tố đơn lẻ (môi trường, carbon, nitơ, nhiệt độ) ở quy mô bình nón 250 mL; chưa khảo sát các yếu tố khác như pH ban đầu, nồng độ oxy hòa tan, thời gian lên men chi tiết, và chưa tối ưu hóa đa yếu tố bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM). Chủng N1 chưa được khảo sát các điều kiện lên men.

Các hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất bao gồm:

  1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất kháng vi sinh vật của chủng Streptomyces costaricanus (N1).
  2. Tiếp tục khảo sát thêm các điều kiện lên men khác như pH, thời gian nuôi cấy, độ ẩm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp của loài Streptomyces noursei (N2).
  3. Nghiên cứu quy trình tách chiết, cô lập và tinh sạch hoạt chất kháng sinh từ hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
  4. Đánh giá ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces noursei đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng.
  5. Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học quy mô phòng thí nghiệm và thử nghiệm hiệu lực chế phẩm từ chủng Streptomyces noursei trong nông nghiệp.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Bảo vệ thực vật, Nông học và Nuôi trồng thủy sản.

Nội dung của công trình có giá trị ứng dụng trực tiếp ở các phần:

  • Quy trình lấy mẫu, xử lý đất và kỹ thuật phân lập xạ khuẩn đất tự nhiên trên hai môi trường chọn lọc SCA và Gause I.
  • Hệ thống công thức chi tiết của các loại môi trường chuyên dụng cho xạ khuẩn (SCA, Gause I, ISP2, ISP4, M177, M180).
  • Bộ ba phương pháp kiểm tra hoạt tính đối kháng vi sinh vật: phương pháp thỏi thạch (agar cylinder/block method), phương pháp đồng nuôi cấy (co-culture method) và phương pháp khoanh giấy lọc (paper disc diffusion method).
  • Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB kết hợp phenol-chloroform-isoamyl alcohol và phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi chuyên biệt Act-235 và Act-878 cho xạ khuẩn.
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng (carbon, nitơ) và nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai chủng xạ khuẩn tiềm năng N1 và N2 được định danh là loài nào và mức độ tương đồng trình tự gen là bao nhiêu?
Dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen 16S rRNA và đối chiếu trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLASTn, chủng N1 được định danh là Streptomyces costaricanus (tương đồng 100% với mã số tham chiếu MT124459.1) và chủng N2 được định danh là Streptomyces noursei (tương đồng 100% với mã số tham chiếu MN519495.1).

2. Phổ đối kháng của chủng N2 đối với 5 vi sinh vật kiểm định đạt đường kính vòng kháng cụ thể ra sao?
Trong thử nghiệm hoạt tính ban đầu, chủng N2 ức chế được cả 5 vi sinh vật chỉ thị với đường kính vòng kháng ($D - d$) lần lượt là: Phytophthora sp. ($11{,}67 \pm 1{,}53\text{ mm}$), Neoscytalidium dimidiatum ($12{,}83 \pm 0{,}76\text{ mm}$), Fusarium oxysporum ($9{,}83 \pm 0{,}29\text{ mm}$), Candida albicans ($11{,}00 \pm 0{,}50\text{ mm}$) và Vibrio parahaemolyticus ($8{,}83 \pm 0{,}76\text{ mm}$). Chủng N2 là chủng duy nhất trong 8 chủng tuyển chọn có hoạt tính đối kháng với nấm men C. albicans.

3. Điều kiện lên men nào là tối ưu nhất để chủng xạ khuẩn N2 sinh tổng hợp chất kháng vi sinh vật?
Chủng N2 sinh tổng hợp chất kháng sinh tốt nhất khi nuôi cấy trong môi trường ISP4, sử dụng nguồn carbon là tinh bột, nguồn nitơ là peptone, ở nhiệt độ 30 °C, nuôi lắc 220 vòng/phút trong thời gian 120 giờ. Ở điều kiện này, dịch lên men tạo vòng ức chế nấm F. oxysporum đạt kích thước $28{,}00 \pm 2{,}00\text{ mm}$.

4. Khi thay đổi nguồn carbon trong môi trường lên men của chủng N2, nguồn đường nào cho kết quả kém nhất?
Nguồn carbon sucrose (đường mía) cho kết quả kém nhất. Khi sử dụng sucrose làm nguồn carbon, dịch lên men của chủng N2 hoàn toàn mất hoạt tính kháng nấm men Candida albicans và vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.

5. Cặp mồi PCR nào được tác giả sử dụng để khuếch đại gen 16S rRNA của các chủng xạ khuẩn?
Tác giả sử dụng cặp mồi chuyên biệt khuếch đại gen 16S rRNA của xạ khuẩn gồm: mồi xuôi Act-235 có trình tự 5'-CGCGGCCTATCAGCTTGTTTG-3' và mồi ngược Act-878 có trình tự 5'-CCGTACTCCCCAGGCGGGG-3'.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Diệp Quỳnh Như đã thực hiện thành công việc phân lập 30 chủng xạ khuẩn từ đất Vườn quốc gia Lò Gò - Xa Mát, tuyển chọn được 2 chủng N1 và N2 có hoạt tính kháng nấm bệnh và vi khuẩn mạnh. Đề tài đã tối ưu hóa các điều kiện lên men cơ bản cho chủng N2 trên môi trường ISP4 bổ sung tinh bột, peptone ở 30 °C và định danh phân tử thành công hai loài Streptomyces costaricanus (N1) và Streptomyces noursei (N2) với mức độ tương đồng 100%. Đây là công trình nghiên cứu vi sinh học thực nghiệm có phương pháp bố trí bài bản, số liệu định lượng chi tiết, cung cấp nguồn giống vi sinh vật bản địa tiềm năng cho việc phát triển các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp và thủy sản.