Nghiên cứu về Bacteriocin và Ứng dụng trong Bảo quản Thực phẩm An toàn

Chuyên khảo phân tích Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin as 48 của vi khuẩn enterococcus faecium trong tế bào, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Trường học: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu về Bacteriocin và Ứng dụng trong Bảo quản Thực phẩm An toàn
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về Bacteriocin
• 1.1.1. Giới thiệu chung
• 1.1.2. Ngộ độc thực phẩm
• 1.2. Bacteriocin
• 1.2.1. Khái niệm và lịch sử phát hiện
• 1.2.2. Phân loại bacteriocin
• 1.2.2.1. Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương
• 1.2.2.2. Phân lớp bacteriocin từ vi khuẩn gram dương
• 1.2.2.3. Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm

Tóm tắt

I. Tổng quan về Bacteriocin và Bảo quản Thực phẩm An toàn

Bacteriocin là các peptide kháng khuẩn được sản xuất bởi vi khuẩn, có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây hại. Chúng được coi là một giải pháp tiềm năng trong việc bảo quản thực phẩm an toàn. Việc sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm không chỉ giúp kéo dài thời gian bảo quản mà còn đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng. Theo nghiên cứu, bacteriocin có thể thay thế các chất bảo quản hóa học, mang lại lợi ích cho sức khỏe và môi trường.

1.1. Định nghĩa và Phân loại Bacteriocin

Bacteriocin được phân loại thành nhiều loại khác nhau dựa trên cấu trúc và nguồn gốc. Chúng có thể được chia thành hai nhóm chính: bacteriocin từ vi khuẩn gram dương và gram âm. Mỗi loại có những đặc điểm và ứng dụng riêng trong bảo quản thực phẩm.

1.2. Vai trò của Bacteriocin trong Bảo quản Thực phẩm

Bacteriocin đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm. Chúng giúp duy trì chất lượng và an toàn thực phẩm, đồng thời giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật.

II. Vấn đề và Thách thức trong Bảo quản Thực phẩm An toàn

Mặc dù bacteriocin có nhiều lợi ích, nhưng việc ứng dụng chúng trong bảo quản thực phẩm vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như tính ổn định của bacteriocin trong điều kiện bảo quản khác nhau, cũng như khả năng tương tác với các thành phần khác trong thực phẩm cần được nghiên cứu kỹ lưỡng. Ngoài ra, việc phát triển các phương pháp sản xuất bacteriocin hiệu quả và tiết kiệm chi phí cũng là một thách thức lớn.

2.1. Tính ổn định của Bacteriocin trong Thực phẩm

Tính ổn định của bacteriocin là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả bảo quản thực phẩm. Nghiên cứu cho thấy rằng các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần thực phẩm có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của bacteriocin.

2.2. Khả năng tương tác của Bacteriocin với Thành phần Thực phẩm

Bacteriocin có thể tương tác với các thành phần khác trong thực phẩm, ảnh hưởng đến hương vị và chất lượng sản phẩm. Việc hiểu rõ các tương tác này là cần thiết để tối ưu hóa ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm.

III. Phương pháp Nghiên cứu Bacteriocin trong Bảo quản Thực phẩm

Nghiên cứu về bacteriocin thường sử dụng các phương pháp sinh học và hóa học để xác định hoạt tính kháng khuẩn của chúng. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy vi khuẩn, phân lập và xác định cấu trúc của bacteriocin. Ngoài ra, các nghiên cứu lâm sàng cũng được thực hiện để đánh giá hiệu quả của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm.

3.1. Phương pháp Nuôi cấy và Phân lập Bacteriocin

Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn cho phép thu nhận bacteriocin với số lượng lớn. Sau đó, các bacteriocin này được phân lập và tinh chế để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Phân tích Hoạt tính Kháng khuẩn của Bacteriocin

Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin được đánh giá thông qua các thử nghiệm ức chế vi khuẩn. Các phương pháp như thử nghiệm khuếch tán và thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thường được sử dụng để xác định hiệu quả của bacteriocin.

IV. Ứng dụng Thực tiễn của Bacteriocin trong Bảo quản Thực phẩm

Bacteriocin đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong việc bảo quản các sản phẩm từ thịt, sữa và rau quả. Chúng không chỉ giúp kéo dài thời gian bảo quản mà còn cải thiện chất lượng sản phẩm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng bacteriocin có thể giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm.

4.1. Ứng dụng Bacteriocin trong Thực phẩm từ Thịt

Trong ngành công nghiệp thực phẩm từ thịt, bacteriocin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh như Listeria monocytogenes. Việc này không chỉ giúp bảo quản thực phẩm mà còn đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

4.2. Ứng dụng Bacteriocin trong Sản phẩm Sữa

Bacteriocin cũng được ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm sữa như phô mai và sữa chua. Chúng giúp duy trì chất lượng và an toàn cho sản phẩm, đồng thời kéo dài thời gian bảo quản mà không cần sử dụng các chất bảo quản hóa học.

V. Kết luận và Tương lai của Nghiên cứu về Bacteriocin

Nghiên cứu về bacteriocin đang mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm an toàn. Với những lợi ích vượt trội, bacteriocin có thể trở thành một giải pháp hiệu quả cho các vấn đề liên quan đến an toàn thực phẩm. Tương lai của nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp sản xuất bacteriocin hiệu quả hơn và mở rộng ứng dụng của chúng trong ngành công nghiệp thực phẩm.

5.1. Triển vọng Nghiên cứu Bacteriocin trong Tương lai

Nghiên cứu về bacteriocin sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các sản phẩm bảo quản thực phẩm an toàn và hiệu quả hơn. Các nghiên cứu mới sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng bacteriocin trong các loại thực phẩm khác nhau.

5.2. Thách thức trong Nghiên cứu và Ứng dụng Bacteriocin

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc ứng dụng bacteriocin trong thực tế vẫn gặp phải một số thách thức. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để giải quyết các vấn đề liên quan đến tính ổn định và khả năng tương tác của bacteriocin trong thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng toàn cầu, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và tính mạng con người, đồng thời gây thiệt hại kinh tế và xã hội lớn cho mỗi quốc gia. Theo ước tính của Ủy ban Khoa học và Công nghệ Hoa Kỳ, mỗi năm có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây ra 5.000 ca tử vong. Tại Việt Nam, số ca ngộ độc thực phẩm hàng năm lên đến hàng nghìn, với hơn 100 vụ ngộ độc nghiêm trọng và gần 50 trường hợp tử vong chỉ trong một thời gian ngắn. Nguyên nhân chính của ngộ độc thực phẩm được xác định là do vi sinh vật gây bệnh và các yếu tố độc hại như độc tố nấm, thuốc trừ sâu tồn dư trong rau quả, kim loại nặng, và các vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, v.v.

Trong bối cảnh đó, việc bảo quản thực phẩm an toàn, đặc biệt là phòng tránh vi sinh vật gây bệnh, luôn được đặt lên hàng đầu trong chính sách kinh tế và y tế công cộng của các quốc gia. Các phương pháp bảo quản truyền thống như sử dụng hóa chất, nhiệt độ, áp suất, chiếu xạ tuy hiệu quả nhưng còn nhiều hạn chế về an toàn và ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm. Do vậy, xu hướng nghiên cứu và ứng dụng các chất bảo quản sinh học an toàn, thân thiện với môi trường ngày càng được quan tâm. Trong đó, bacteriocin – các peptide có hoạt tính kháng khuẩn do vi khuẩn tạo ra – nổi lên như một giải pháp tiềm năng trong bảo quản thực phẩm sinh học.

Luận văn tập trung nghiên cứu tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa enterocin AS-48 của vi khuẩn Enterococcus faecium trong tế bào Escherichia coli ER2566 nhằm mục đích sản xuất enterocin AS-48 tại hệ thống tế bào nhân tạo, phục vụ ứng dụng làm chất bảo quản sinh học trong nông sản và thực phẩm. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong bối cảnh nhu cầu bảo quản thực phẩm tự nhiên và an toàn ngày càng tăng cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về bacteriocin, đặc biệt là enterocin AS-48, một bacteriocin dạng vòng (circular bacteriocin) được tổng hợp bởi vi khuẩn Enterococcus faecium. Bacteriocin là các peptide có hoạt tính kháng khuẩn cao, an toàn, không gây tác dụng phụ do bị phân hủy nhanh bởi protease trong đường tiêu hóa người. Enterocin AS-48 có cấu trúc vòng đặc biệt, bền nhiệt, hoạt động hiệu quả trong phạm vi pH rộng, thích hợp với nhiều loại thực phẩm.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Bacteriocin: Peptide kháng khuẩn do vi khuẩn gram dương hoặc gram âm sản xuất, có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.
• Enterocin: Bacteriocin được tạo ra từ chi Enterococcus, có tính đa dạng và phổ kháng khuẩn rộng.
• Gen mã hóa bacteriocin: Các gen nằm trên plasmid hoặc ADN nhiễm sắc, mã hóa cho peptide tiền thân và các protein liên quan đến tổng hợp, vận chuyển và bảo vệ bacteriocin.
• Biểu hiện gen tái tổ hợp: Kỹ thuật chuyển gen mã hóa bacteriocin vào hệ thống tế bào chủ (E. coli ER2566) để tổng hợp protein mục tiêu với hiệu suất cao.
• Phương pháp tinh sạch protein: Sử dụng hệ thống IMPACT-TWIN dựa trên intein để tinh sạch enterocin AS-48 với độ tinh khiết cao, giữ nguyên hoạt tính sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là gen mã hóa enterocin AS-48 được lấy từ cơ sở dữ liệu GenBank (mã DQ1988088). Gen này được tổng hợp và nhân bản trong vector pTWIN1, pTWIN2, sau đó chuyển vào chủng E. coli ER2566 để biểu hiện protein.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Kỹ thuật PCR: Tăng sinh gen as-48 với hai giai đoạn PCR tù mồi và PCR bình thường, sử dụng enzyme Taq polymerase.
• Kỹ thuật nhân dòng và biểu hiện gen: Sử dụng chủng E. coli ER2566 với hệ thống promoter T7 mạnh, cảm ứng bằng IPTG để biểu hiện enterocin AS-48.
• Tinh sạch protein: Áp dụng hệ thống IMPACT-TWIN dựa trên intein để tách protein mục tiêu khỏi các protein gắn kèm, sử dụng hạt chitin để hấp phụ và rửa giải.
• Phân tích cấu trúc và hoạt tính: SDS-PAGE, Western blot để xác định kích thước và độ tinh khiết; đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm.
• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian 1-2 năm, bao gồm các bước thiết kế gen, nhân bản, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính.

Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm nhiều chủng vi khuẩn Enterococcus faecium và E. coli ER2566 được sử dụng làm chủng biểu hiện. Phương pháp chọn mẫu dựa trên khả năng biểu hiện gen và hiệu suất tổng hợp protein.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tổng hợp thành công gen as-48 trong vector pTWIN1 và pTWIN2: Kết quả PCR và điện di agarose cho thấy sản phẩm gen as-48 có kích thước khoảng 315 bp, phù hợp với kích thước dự kiến. Hiệu suất nhân bản gen đạt khoảng 85% thành công trên các mẫu thử.

2. Biểu hiện enterocin AS-48 trong E. coli ER2566: SDS-PAGE và Western blot xác nhận protein mục tiêu có kích thước khoảng 7,1 kDa, tương ứng với enterocin AS-48. Mức biểu hiện protein đạt khoảng 20-30 mg/L môi trường nuôi cấy, cao hơn 15% so với các nghiên cứu trước.

3. Tinh sạch enterocin AS-48 bằng hệ thống IMPACT-TWIN: Protein thu được có độ tinh khiết trên 90%, giữ nguyên cấu trúc vòng đặc trưng và hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes, với vùng ức chế khuẩn lớn hơn 15 mm, tăng 20% so với enterocin tinh khiết thương mại.

4. Đặc tính ổn định của enterocin AS-48: Protein duy trì hoạt tính kháng khuẩn trong phạm vi pH 4,5-8,5 và nhiệt độ lên đến 100°C trong 30 phút, phù hợp với điều kiện bảo quản và chế biến thực phẩm.

Thảo luận kết quả

Việc tổng hợp và biểu hiện gen as-48 thành công trong E. coli ER2566 mở ra khả năng sản xuất enterocin AS-48 với hiệu suất cao và chi phí thấp hơn so với phương pháp truyền thống sử dụng chủng Enterococcus faecium. Kết quả SDS-PAGE và Western blot khẳng định protein thu được có kích thước và cấu trúc phù hợp với enterocin AS-48 đã được mô tả trong tài liệu.

Hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ của enterocin AS-48 đối với các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm như Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes cho thấy tiềm năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm sinh học. Đặc tính bền nhiệt và ổn định pH của enterocin AS-48 giúp nó thích hợp với nhiều loại thực phẩm và quy trình chế biến khác nhau.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, mức biểu hiện và hoạt tính của enterocin AS-48 trong nghiên cứu này có cải thiện đáng kể, nhờ vào việc sử dụng hệ thống biểu hiện gen mạnh mẽ và kỹ thuật tinh sạch protein tiên tiến. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ SDS-PAGE, Western blot và bảng so sánh hoạt tính kháng khuẩn giữa enterocin AS-48 thu được và các bacteriocin thương mại.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình sản xuất enterocin AS-48 quy mô công nghiệp: Tăng cường tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy E. coli ER2566 và quy trình tinh sạch protein nhằm nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất. Thời gian thực hiện dự kiến 1-2 năm, do các công ty công nghệ sinh học thực hiện.

2. Ứng dụng enterocin AS-48 trong bảo quản thực phẩm nông sản và chế biến: Thử nghiệm và đánh giá hiệu quả bảo quản trên các loại thực phẩm như thịt lợn, thủy sản, sữa và rau quả tại các cơ sở sản xuất thực phẩm trong vòng 6-12 tháng, phối hợp với các doanh nghiệp chế biến thực phẩm.

3. Nghiên cứu kết hợp enterocin AS-48 với các phương pháp bảo quản khác: Kết hợp bacteriocin với xử lý vật lý như áp suất cao, chiếu xạ hoặc các chất bảo quản tự nhiên khác để tăng hiệu quả bảo quản và kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm. Thời gian nghiên cứu 1 năm, do các viện nghiên cứu thực hiện.

4. Đánh giá an toàn và tác động môi trường của enterocin AS-48: Thực hiện các thử nghiệm độc tính, dị ứng và ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật tự nhiên nhằm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và môi trường. Thời gian thực hiện 1-2 năm, phối hợp với các cơ quan quản lý và phòng thí nghiệm độc học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu về biểu hiện gen, tinh sạch protein và ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm.

2. Doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm: Tìm hiểu về các giải pháp bảo quản sinh học an toàn, hiệu quả nhằm nâng cao chất lượng và giá trị sản phẩm.

3. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và y tế công cộng: Đánh giá tiềm năng ứng dụng bacteriocin trong chính sách kiểm soát ngộ độc thực phẩm và nâng cao sức khỏe cộng đồng.

4. Các viện nghiên cứu và trung tâm phát triển công nghệ sinh học: Phát triển các sản phẩm bảo quản thực phẩm mới dựa trên bacteriocin và các peptide sinh học khác.

Câu hỏi thường gặp

1. Enterocin AS-48 là gì và có đặc điểm gì nổi bật?
   Enterocin AS-48 là một bacteriocin dạng vòng, có cấu trúc bền vững, hoạt động kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn gram dương và gram âm, bền nhiệt và ổn định trong phạm vi pH rộng. Đây là một peptide an toàn, không gây tác dụng phụ khi sử dụng trong thực phẩm.

2. Tại sao chọn E. coli ER2566 làm chủng biểu hiện?
   E. coli ER2566 có hệ thống promoter T7 mạnh, khả năng biểu hiện protein cao, thiếu các protease phân giải protein ngoại lai, giúp tăng hiệu suất và độ tinh khiết của protein mục tiêu.

3. Hệ thống IMPACT-TWIN có ưu điểm gì trong tinh sạch protein?
   IMPACT-TWIN sử dụng intein để tự phân cắt protein, cho phép tinh sạch protein mục tiêu mà không cần sử dụng protease ngoại sinh, giảm chi phí và giữ nguyên hoạt tính sinh học của protein.

4. Enterocin AS-48 có thể ứng dụng trong những loại thực phẩm nào?
   Do tính ổn định về nhiệt độ và pH, enterocin AS-48 phù hợp với nhiều loại thực phẩm như thịt, thủy sản, sữa, rau quả và các sản phẩm lên men, giúp kéo dài thời gian bảo quản và ngăn ngừa vi khuẩn gây bệnh.

5. Có rủi ro nào khi sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm không?
   Bacteriocin như enterocin AS-48 được phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa, không gây độc tính hay dị ứng. Tuy nhiên, cần đánh giá kỹ lưỡng về an toàn và tác động môi trường trước khi ứng dụng rộng rãi.

Kết luận

• Thành công trong việc tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa enterocin AS-48 trong E. coli ER2566 với hiệu suất cao và độ tinh khiết trên 90%.
• Enterocin AS-48 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ, ổn định trong điều kiện nhiệt độ và pH rộng, phù hợp ứng dụng bảo quản thực phẩm sinh học.
• Hệ thống IMPACT-TWIN là phương pháp tinh sạch hiệu quả, giữ nguyên hoạt tính của enterocin AS-48.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển sản xuất bacteriocin quy mô công nghiệp, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.
• Đề xuất các bước tiếp theo bao gồm tối ưu hóa quy trình sản xuất, thử nghiệm ứng dụng thực tế và đánh giá an toàn toàn diện.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai ứng dụng enterocin AS-48 trong bảo quản thực phẩm, đồng thời tiếp tục nghiên cứu mở rộng về các bacteriocin khác nhằm đa dạng hóa giải pháp bảo quản sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Më ®Çu Hµng n¨m, trªn thÕ giíi vµ ViÖt Nam, c¸c vô ngé ®éc thùc phÈm kh«ng ngõng gia t¨ng. Nguyªn nh©n chÝnh g©y ra ngé ®éc thùc phÈm ®îc x¸c ®Þnh lµ do vi sinh vËt g©y bÖnh vµ c¸c yÕu tè ®éc (®éc tè nÊm hay thuèc trõ s©u cã trong rau qu¶. C¸c vi sinh vËt g©y bÖnh ®Òu cã kh¶ n¨ng sinh trëng, ph¸t triÓn tèt trong c¸c lo¹i thùc phÈm nh thÞt lîn, thÞt gia cÇm, trøng, h¶i s¶n vµ c¸c s¶n phÈm s÷a. Ngé ®éc thùc phÈm ¶nh hëng trùc tiÕp ®Õn søc kháe vµ tÝnh m¹ng con ngêi, ®ång thêi g©y t¸c ®éng kh«ng nhá ®Õn nÒn kinh tÕ, chÝnh trÞ cña mçi quèc gia.

ChÝnh v× thÕ, vÊn ®Ò b¶o qu¶n l¬ng thùc, thùc phÈm lu«n ®îc ®Æt lªn hµng ®Çu trong chÝnh s¸ch kinh tÕ, søc kháe céng ®ång cña mçi quèc gia, ®Æc biÖt lµ b¶o qu¶n tr¸nh khái c¸c vi sinh vËt g©y bÖnh. §Ó kh¾c phôc nh÷ng h¹n chÕ cña c¸c ph¬ng ph¸p b¶o qu¶n thùc phÈm truyÒn thèng (b¶o qu¶n theo ph¬ng ph¸p hãa häc, vËt lý), c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi ®· vµ ®ang nghiªn cøu, øng dông chÊt b¶o qu¶n sinh häc kh«ng ®éc h¹i gäi chung lµ bacteriocin. §©y lµ c¸c peptit cã ho¹t tÝnh kh¸ng khuÈn, ®Æc biÖt an toµn, kh«ng g©y t¸c dông phô khi sö dông do bÞ ph©n c¾t nhanh chãng bëi protease trong ®êng tiªu hãa ë ngêi. NhiÒu bacteriocin ®· ®îc nghiªn cøu nhng hiÖn nay míi cã nisin vµ pediocin PA-1/AcH ®îc th¬ng m¹i hãa, sö dông trong c«ng nghÖ thùc phÈm díi d¹ng bét.

Do ®ã, viÖc nghiªn cøu vµ t×m ra c¸c bacteriocin an toµn, øng dông trong b¶o qu¶n thùc phÈm lµ rÊt cÇn thiÕt. Enterocin lµ c¸c bacteriocin ®îc t¹o ra tõ chi vi khuÈn Enterococcus rÊt phong phó vµ ®a d¹ng, cã nh÷ng ®Æc tÝnh ®¸ng quan t©m trong chÕ biÕn, b¶o qu¶n thùc phÈm. §iÓn h×nh Page 1 of 116 1 Luận văn Thạc sĩ Sinh học lµ enterocin AS-48 - mét bacteriocin cÊu tróc d¹ng vßng, cã phæ øc chÕ réng c¶ vi khuÈn gram d¬ng vµ gram ©m. Nh÷ng ®Æc tr- ng kh¸c cña AS-48 nh tÝnh æn ®Þnh, bÒn nhiÖt vµ tÝnh tan tiªu biÓu trong ph¹m vi pH réng (thÝch hîp víi nhiÒu lo¹i thùc phÈm) høa hÑn lµ sù lùa chän thay thÕ cho c¸c chÊt b¶o qu¶n hãa häc trong t¬ng lai.

Tõ tÝnh u viÖt cña enterocin, ®Æc biÖt lµ enterocin AS-48 trong b¶o qu¶n nhiÒu lo¹i thùc phÈm, c¸c nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu nh»m thu lîng lín peptit nµy víi mong muèn sö dông thµnh th- ¬ng phÈm. VÊn ®Ò gÆp ph¶i lµ c¸c chñng vi khuÈn Enterococcus cã kh¶ n¨ng sinh enterocin thêng tiÕt ra ®éc tè. ViÖc lªn men vµ thu håi s¶n phÈm theo tiªu chuÈn s¹ch ®Ó cã thÓ sö dông trong thùc phÈm gÆp nhiÒu khã kh¨n vµ ®¹t hiÖu suÊt thÊp. Do ®ã, viÖc tËp trung nghiªn cøu t¹o enterocin t¸i tæ hîp kh«ng nh÷ng kh¾c phôc h¹n chÕ trªn mµ cßn chñ ®éng ®îc nguån enterocin.

Enterocin AS-48 hoµn toµn cã thÓ ®îc tæng hîp b»ng con ®êng t¸i tæ hîp khi biÕt tr×nh tù ADN cña gen m· hãa cho AS-48 mµ kh«ng cÇn ph¶i ph©n lËp tõ c¸c chñng tù nhiªn. Nh vËy, enterocin AS-48 cã thÓ ®îc tæng hîp víi hiÖu suÊt cao b»ng con ®êng t¸i tæ hîp nhê vi khuÈn E. Tõ thùc tr¹ng trªn, chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®Ò tµi: “Tổng hợp và biểu hiện gen m· hãa cho enterocin AS-48 của vi khuẩn Enterococcus faecium trong tế bào Escherichia coli ER2566” nh»m môc ®Ých tæng hîp enterocin AS-48 t¸i tæ hîp ®Ó øng dông lµm chÊt b¶o qu¶n n«ng s¶n, thùc phÈm sinh häc. C«ng tr×nh nµy ®îc thùc hiÖn t¹i phßng Kü thuËt Di truyÒn, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam.

Page 2 of 116 2 Luận văn Thạc sĩ Sinh học ch¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1. tæng quan vÒ Bacteriocin 1. Giíi thiÖu chung 1.

Ngé ®éc thùc phÈm MÆc dï con ngêi ®· sö dông nh÷ng c«ng nghÖ b¶o qu¶n thùc phÈm míi vµ an toµn (vÝ dô: HACCP - hÖ thèng kiÓm so¸t rñi ro vÒ vÖ sinh an toµn thùc phÈm mang tÝnh phßng ngõa) trong chÕ biÕn vµ b¶o qu¶n nhng c¸c ca ngé ®éc thùc phÈm vÉn kh«ng ngõng gia t¨ng Error: Reference source not found. C¸c hãa chÊt, kim lo¹i nÆng, ký sinh trïng, nÊm, virus vµ vi khuÈn ®Òu cã thÓ g©y ngé ®éc thùc phÈm. Trong ®ã, vi khuÈn lµ nguyªn nh©n phæ biÕn nhÊt víi h¬n 90% c¸c ca ngé ®éc thùc phÈm hµng n¨m, chñ yÕu do Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Page 3 of 116 3 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Toxoplasma gondii vµ Escherichia coli O157:H7 6., Error: Reference source not found. Trêng hîp nhÑ lµ nh÷ng hËu qu¶ vÒ rèi lo¹n tiªu hãa, mÊt c©n b»ng ®iÖn gi¶i, kiÖt søc, trêng hîp nÆng cã thÓ dÉn ®Õn tö vong nÕu kh«ng ch÷a trÞ kÞp thêi, ®óng c¸ch.

Do ®ã, an toµn thùc phÈm lu«n lµ vÊn ®Ò quan t©m hµng ®Çu cña mçi quèc gia mµ träng t©m lµ b¶o qu¶n thùc phÈm phßng tr¸nh c¸c vi sinh vËt g©y bÖnh 6. Theo uû ban Khoa häc vµ C«ng nghÖ Hoa Kú, íc tÝnh hµng n¨m níc nµy cã kho¶ng 76 triÖu ca ngé ®éc thùc phÈm, g©y ra 5000 ca tö vong. Thùc phÈm chÝnh lµ thÞt lîn, thÞt gia cÇm, trøng, h¶i s¶n vµ c¸c s¶n phÈm s÷a, tiªu tèn tõ 6,5-34,9 tû ®« la Error: Reference source not found. C¸c mÇm bÖnh thùc phÈm nh Listeria spp.

cã kh¶ n¨ng chÞu nhiÖt ®é thÊp vµ nång ®é muèi cao, g©y ra h¬n 2500 vô ngé ®éc thùc phÈm víi 500 ca tö vong chØ riªng ë Hoa Kú 12. ë ViÖt Nam, hµng n¨m còng cã hµng ngh×n ca ngé ®éc thùc phÈm, g©y tæn thÊt vÒ søc kháe vµ kinh tÕ. Trong n¨m 2008, tÝnh ®Õn th¸ng 7, ®· cã 106 vô ngé ®éc thùc phÈm, gÇn 5000 ngêi m¾c vµ 43 ngêi ®· bÞ tö vong. Bëi vËy, nh÷ng chÊt b¶o qu¶n thùc phÈm an toµn lµ v« cïng quan träng 1.

Cïng víi sù gia t¨ng nhu cÇu vÒ nh÷ng thùc phÈm tù nhiªn vµ an toµn h¬n, con ngêi cÇn nh÷ng c«ng nghÖ b¶o qu¶n míi ®Ó ng¨n ngõa sù h háng vµ nhiÔm ®éc thùc phÈm. C¸c c¸ch truyÒn thèng ®· ®îc thay thÕ bëi nh÷ng c«ng nghÖ míi, c¶i tiÕn nh khö trïng nhÑ b»ng nhiÖt, gi¶m kh«ng khÝ, ®ãng gãi ch©n kh«ng, ¸p suÊt thuû tÜnh cao, chiÕu tia tö ngo¹i vµ sö dông chÊt kh¸ng khuÈn tù nhiªn - c¸c bacteriocin 6., Error: Reference source not found. ViÖc sö dông bacteriocin mét m×nh hoÆc kÕt hîp víi xö lý ho¸ lý vµ chÊt b¶o qu¶n ho¸ häc cã thÓ lµ biÖn ph¸p hiÖu qu¶ ®Ó Page 4 of 116 4 Luận văn Thạc sĩ Sinh học ®¶m b¶o hµm lîng dinh dìng cña nguyªn liÖu th« vµ thùc phÈm, kÐo dµi thêi gian b¶o qu¶n, k×m h·m vi khuÈn lµm háng, g©y bÖnh 2. Bacteriocin Bacteriocin ®îc Gratia ph¸t hiÖn lÇn ®Çu tiªn n¨m 1925 víi tªn lµ principe V b¾t nguån tõ mét chñng E.

coli cã kh¶ n¨ng chèng l¹i c¸c chñng E. coli kh¸c trong cïng m«i trêng nu«i cÊy. ThuËt ng÷ “colicin” do Gratia vµ Fredericq ®Æt ra n¨m 1946. Ngµy nay, colicin ®îc dïng cho protein kh¸ng khuÈn tõ c¸c loµi E.

coli vµ cã quan hÖ gÇn víi Enterobacteriaceae Error: Reference source not found. ®· ®Æt tªn cho c¸c protein cã ho¹t tÝnh kh¸ng khuÈn ®Æc hiÖu cao lµ bacteriocin. ThuËt ng÷ bacteriocin ®îc gi¶i thÝch ®¬n gi¶n. T¬ng tù “ase” sö dông trong enzyme, tiÕp tè “cin” dïng ®Ó biÓu thÞ ho¹t tÝnh t¹o bacteriocin.

TiÕp tè “cin” ®îc viÕt thªm vµo tªn chi (hay ®óng h¬n lµ tªn loµi). Colicin ®îc ph©n lËp ®Çu tiªn tõ E. monocytogenes, subtilin ®îc t¹o ra bëi Bacillus subtilis, staphylocin tõ S. aureus vµ nhiÒu lo¹i kh¸c.

C¸c ch÷ c¸i theo thø tù t×m ra ®îc viÕt sau tªn bacteriocin ®Ó ph©n biÖt víi bacteriocin duy nhÊt tõ chñng kh¸c cïng loµi. VÝ dô, lactacin F lµ bacteriocin thø 6 ®îc t×m ra tõ loµi Lactobacilli 34. Trong tù nhiªn, vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng t¹o ra c¸c hîp chÊt kh¸c nhau nh»m h¹n chÕ hoÆc chèng l¹i c¸c vi sinh vËt kh¸c 44. C¸c hîp chÊt nµy ®îc biÕt ®Õn nh kh¸ng sinh, s¶n phÈm trao ®æi chÊt thø cÊp nh axit lactic, c¸c yÕu tè ph©n gi¶i nh lysozym, c¸c d¹ng exotoxin protein vµ bacteriocin.

Bacteriocin ®îc tæng hîp khi vi khuÈn gÆp c¸c ®iÒu kiÖn øc chÕ - t¸c ®éng cña m«i trêng Page 5 of 116 5 Luận văn Thạc sĩ Sinh học sèng, c¹nh tranh vÒ nguån dinh dìng, kh«ng gian. C¸c bacteriocin cã ho¹t tÝnh kh¸ng khuÈn cao thËm chÝ ë nång ®é rÊt thÊp 69. Hä bacteriocin gåm c¸c protein ®a d¹ng vÒ mÆt kÝch thíc, vi khuÈn ®Ých, d¹ng ho¹t ®éng vµ c¬ chÕ miÔn dÞch. HiÖn nay, cã hµng tr¨m lo¹i bacteriocin.

Nh÷ng bacteriocin nµy ®îc t×m thÊy trong hÇu hÕt c¸c vi khuÈn, gÇn ®©y cßn t×m thÊy trong vi khuÈn cæ - Archaea (gäi lµ c¸c Archaeocin) 60. NhiÒu nghiªn cøu ®îc tiÕn hµnh víi bacteriocin trªn c¸c loµi vi khuÈn kh¸c nhau cho thÊy chóng ®îc m· hãa bëi c¸c gen trªn plasmid (vÝ dô, Col plasmid trong E. Mét sè ®îc m· hãa bëi c¸c gen n»m trªn ADN hÖ gen, nh plantaracin A vµ sakacina 674, trong khi cã trêng hîp ®îc x¸c ®Þnh trªn c¸c transposon nh nisin 69. V× còng cã ho¹t tÝnh kh¸ng khuÈn nªn tríc ®©y, bacteriocin bÞ nhÇm lÉn nh lµ “c¸c chÊt kh¸ng sinh”.

®· t×m ra sù kh¸c biÖt cña bacteriocin víi c¸c chÊt kh¸ng sinh bëi ®Æc ®iÓm ®Æc trng: Bacteriocin cã b¶n chÊt lµ protein. ChÝnh sù kh¸c biÖt nµy ®· t¹o nªn ®Æc tÝnh u viÖt cña bacteriocin trong øng dông b¶o qu¶n thùc phÈm 34. Sù tranh luËn nªn ®îc ®Æt vµo bèi c¶nh kh¸m ph¸ ra nisin n¨m 1924, tríc c¶ penicillin vµ colicin. Khi ®ã nh÷ng chÊt kh¸ng khuÈn protein bÞ xem lµ c¸c chÊt kh¸ng sinh.

ChÊt kh¸ng sinh ®îc t¹o ra bëi mét nhãm h¹n chÕ vi sinh vËt, lµ s¶n phÈm trao ®æi chÊt bËc hai. C¸c chÊt nµy kh«ng cã chøc n¨ng râ rµng trong sinh trëng vµ sinh s¶n cña b¶n th©n vi khuÈn, ®îc tiÕt dÔ dµng ra khái tÕ bµo 60. Khi kh¸m ph¸ ra trong cÊu tróc nisin cã chøa mét sè axit amin hiÕm nh de-hydroalanin, dehydrobuterin vµ cÇu lanthion sulfur ®¬n, nisin kh«ng ®îc xem lµ mét protein bëi riboxom kh«ng Page 6 of 116 6 Luận văn Thạc sĩ Sinh học t¹o nh÷ng axit amin nµy (kÓ c¶ nh÷ng chÊt t¬ng ®ång víi nisin nh subtilin vµ epidermin). ChØ ®Õn khi Hansen vµ CS.

(1990) ph¸t hiÖn ra r»ng, nisin thùc tÕ ®îc t¹o ra bëi riboxom qua qu¸ tr×nh khö níc c¸c axit amin vµ sù h×nh thµnh cÇu lanthion diÔn ra sau dÞch m·, nisin míi ®îc c«ng nhËn lµ mét bacteriocin. Sù cã mÆt cña c¸c gen riªng rÏ trong tæng hîp bacteriocin x¸c nhËn r»ng chóng lµ protein peptit thùc sù.