Luận văn: Nghiên cứu kháng nguyên virus hoại tử thần kinh ở cá mú sản xuất vắc xin

Tải luận văn nghiên cứu kháng nguyên virus hoại tử thần kinh ở cá mú, làm cơ sở khoa học sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh hiệu quả.

• Tác giả: Mẫn Hồng Phước
• Người hướng dẫn: Phạm Thị Tâm
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú Epinephelus sp. phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis - VNN) là một trong những bệnh nguy hiểm nhất gây hại cho ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là đối với các loài cá mú (Epinephelus sp.). Căn bệnh này được gây ra bởi virus Betanodavirus, thuộc họ Nodaviridae, và có khả năng gây tỷ lệ chết cao ở cá non. Bệnh VNN không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của cá mú mà còn gây thiệt hại kinh tế lớn cho các trang trại nuôi cá. Virus này tấn công hệ thần kinh của cá, gây hoại tử các tế bào thần kinh, dẫn đến liệt và chết. Hiện nay, phòng chống bệnh VNN bằng vắc xin tái tổ hợp đã trở thành giải pháp hữu hiệu nhất, thay thế cho các biện pháp điều trị truyền thống.

1.1. Đặc điểm của virus Betanodavirus

Virus Betanodavirus là một loại virus RNA dương có bộ gen được chia thành hai đoạn ribosomal (dsRNA segment). Cấu trúc không gian của virus có dạng icosahedron, với đường kính khoảng 25-30 nm. Virus này có khả năng sống sót trong điều kiện môi trường khác nhau, làm tăng nguy cơ lây lan trong các trang trại nuôi cá. Hệ gen của Betanodavirus chứa các gen mã hóa cho kháng nguyên bề mặt, là mục tiêu chính của các nghiên cứu vắc xin hiện nay.

1.2. Tình hình dịch bệnh VNN trên thế giới

Bệnh hoại tử thần kinh đã được ghi nhận ở hơn 20 quốc gia trên thế giới, gây thiệt hại hàng tỷ đô la cho ngành nuôi trồng thủy sản. Dịch bệnh VNN ở cá mú được báo cáo lần đầu tiên ở Nhật Bản vào những năm 1990 và sau đó lan rộng ra các nước châu Á. Tỷ lệ mắc bệnh có thể đạt 50-90% ở những đàn cá non, với tỷ lệ chết rất cao. Tại Việt Nam, bệnh VNN cũng đã xuất hiện và gây ảnh hưởng không nhỏ đến hoạt động nuôi cá mú.

II. Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp cho vắc xin

Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh là một bước tiến quan trọng trong công nghệ sinh học hiện đại. Quá trình này liên quan đến việc tách dòng gen T4 mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV, sau đó biểu hiện gen này trong hệ thống sinh học (như vi khuẩn E. coli) để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp. Phương pháp này cho phép sản xuất lượng lớn kháng nguyên an toàn, không cần sử dụng virus nguyên thể. Vắc xin tái tổ hợp từ kháng nguyên này có thể kích hoạt đáp ứng miễn dịch ở cá mú, giúp bảo vệ chúng khỏi bệnh VNN một cách hiệu quả.

2.1. Quy trình tách dòng gen T4

Quá trình tách dòng gen T4 bắt đầu từ tách chiết RNA tổng số từ các mẫu cá mú bị nhiễm NNV. Sử dụng công nghệ RT-PCR với các mồi khuếch đại đặc hiệu, gen T4 được khuếch đại từ RNA. Sản phẩm sau đó được chèn vào vector pGEM-T Easy, tạo ra plasmid tái tổ hợp pGEMT-T4. Các bacteria E. coli được biến nạp với plasmid này, và các dòng mang gen T4 được xác định thông qua PCR kiểm tra và phản ứng cắt enzyme giới hạn.

2.2. Biểu hiện gen trong hệ thống vi khuẩn

Gen T4 được chuyển vào vector pET32a+, một vector biểu hiện mạnh mẽ trong E. coli. Bacteria biến nạp được nuôi cấy và cảm ứng bằng IPTG để kích hoạt biểu hiện gen. Kháng nguyên tái tổ hợp được tích lũy trong các tế bào vi khuẩn, sau đó được tách chiết và tinh sạch. Phương pháp này cho phép sản xuất lượng lớn kháng nguyên bề mặt với chi phí thấp và an toàn cao.

III. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp

Việc đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp là bước quan trọng để xác định hiệu quả của vắc xin. Các nghiên cứu được tiến hành trên hai mô hình khác nhau: in vitro (trên hệ thống nuôi cấy tế bào hoặc trên động vật thí nghiệm như thỏ) và in vivo (trên cá mú). Trong cả hai mô hình, hiệu giá kháng thể trung hòa virus được xác định bằng các phương pháp sinh học phân tử và huyết thanh học. Các kết quả cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng kích hoạt đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, tạo ra kháng thể có khả năng trung hòa virus VNN.

3.1. Thử nghiệm trên động vật thí nghiệm

Kháng nguyên tái tổ hợp được tiêm vào thỏ để đánh giá khả năng sinh kháng thể trong hệ thống động vật có xương sống. Máu được thu lại từ các thỏ được tiêm vắc xin, huyết thanh được tách chiết. Hiệu giá kháng thể trung hòa được xác định thông qua các phương pháp như ELISA và các bài thử xác định tính trung hòa virus. Kết quả cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, sản sinh kháng thể có khả năng trung hòa đạt từ mức cao.

3.2. Thử nghiệm trên cá mú

Sau khi đánh giá khả năng tạo kháng thể trên động vật thí nghiệm, vắc xin tái tổ hợp được thử nghiệm trên cá mú (Epinephelus sp.). Cá mú được tiêm vắc xin và theo dõi đáp ứng miễn dịch qua các giai đoạn. Hiệu giá kháng thể được đo định kỳ, và khả năng bảo vệ được đánh giá bằng cách thách thức cá với virus gây bệnh hoại tử thần kinh. Kết quả cho thấy vắc xin tái tổ hợp có hiệu quả bảo vệ cao, giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh ở cá mú.

IV. Ứng dụng và triển vọng của vắc xin tái tổ hợp

Vắc xin tái tổ hợp từ kháng nguyên bề mặt của NNV mở ra những triển vọng lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản. So với vắc xin truyền thống, vắc xin này có nhiều ưu điểm: an toàn hơn (không chứa virus nguyên thể), dễ sản xuất hàng loạt, chi phí thấp hơn, và có hiệu quả bảo vệ cao. Vắc xin tái tổ hợp có thể được áp dụng phòng chống bệnh VNN cho cá mú tại các trang trại nuôi, giúp nâng cao sản lượng cá và giảm thiệt hại kinh tế. Ngoài ra, công nghệ này còn có tiềm năng ứng dụng cho vắc xin phòng bệnh cho các loài cá khác, đóng góp quan trọng vào bền vững phát triển ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam.

4.1. Ưu điểm của vắc xin tái tổ hợp

Vắc xin tái tổ hợp có nhiều ưu điểm vượt trội so với các loại vắc xin truyền thống. Thứ nhất, nó an toàn tuyệt đối vì không chứa virus sống hay bị vô hiệu hóa, giảm nguy cơ gây bệnh phản ứng. Thứ hai, sản xuất vắc xin tái tổ hợp có thể tiến hành quy mô công nghiệp, đáp ứng nhu cầu thị trường lớn. Thứ ba, chi phí sản xuất thấp hơn đáng kể, làm cho vắc xin trở nên giá cả hợp lý cho các nông dân nuôi cá.

4.2. Triển vọng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, kháng nguyên tái tổ hợp có thể được cải tiến thêm bằng kỹ thuật gen tiên tiến như protein công thức tổng hợp hoặc vắc xin DNA. Vắc xin tái tổ hợp có thể kết hợp với các kháng nguyên khác để tạo vắc xin đa hóa chất chống nhiều bệnh. Ngoài cá mú, công nghệ này có thể mở rộng cho các loài cá kinh tế khác, tạo thành nền tảng cho hệ thống vắc xin hiện đại trong thủy sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất trên thế giới. Ở Việt Nam, nghề nuôi trồng thủy sản đã không ngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh tế đất nƣớc nói chung. Với kim ngạch xuất khẩu năm 2010 đạt 4,94 tỷ USD thì đây là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam.

Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) cho biết, giai đoạn 2011 – 2015 ngành Thủy sản hƣớng đến sự phát triển bền vững, là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn, có khả năng cạnh tranh cao và hội nhập vững chắc với thế giới. Mục tiêu quan trọng hàng đầu là đẩy mạnh xuất khẩu đạt kim ngạch 6,5 tỷ USD vào năm 2015 và chiếm khoảng 37% trong khối nông lâm ngƣ nghiệp. Vì vậy việc quản lý dịch bệnh trên các đối tƣợng chủ lực là yếu tố quan trọng để đạt đƣợc mục tiêu trên. Tuy nhiên hiện tại nghề NTTS tại Việt Nam đang gặp phải những trở ngại lớn nhƣ dịch bệnh xuất huyết trên cá rô phi, bệnh đốm đỏ trên cá trắm cỏ, bệnh đốm trắng trên tôm sú, bệnh virus trên cá biển (cá mú, cá chẽm, cá bơn)…[3].

Để quản lý các dịch bệnh trên các đối tƣợng quan trọng, nhiều giải pháp đã đƣợc đặt ra nhƣ: lựa chọn các con giống sạch bệnh, quản lý tốt môi trƣờng, dinh dƣỡng, sử dụng thuốc và hóa chất, tuy nhiên chƣa mang lại hiệu quả cao. Vì vậy việc phát triển và ứng dụng các chế phẩm sinh học, đặc biệt là vắc xin trong NTTS có ý nghĩa cấp thiết trong việc quản lý dịch bệnh đạt hiệu quả cao hơn. Bên cạnh sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi cá nƣớc ngọt thì nghề nuôi cá ven biển và cá biển vẫn khẳng định đƣợc vai trò của mình. Trong đó, đối tƣợng cá mú với những ƣu điểm nhƣ cá có giá trị kinh tế cao, thịt thơm, ngon đang đƣợc quan tâm phát triển.

Tuy nhiên, khi phát triển nuôi cá mú với mật độ cao và nuôi thâm canh thì cũng phát hiện một số bệnh ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng cá. Qua nghiên cứu, ngƣời ta đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá mú thƣờng là virus, nấm, vi khuẩn mà trong đó nguy hiểm nhất là bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và võng mạc (VER-Viral 1 Encephalopathy) do Betanodavirus còn gọi là Piscine nodavirus gây ra. Chúng gây bệnh trên cá mú ở tất cả các độ tuổi, song thƣờng gặp nhiều nhất ở giai đoạn ấu trùng (từ 10-25 ngày tuổi) và cá giống. Biểu hiện lâm sàng là cá bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nƣớc, bơi không định hƣớng.

Não xung huyết, cá nhiễm bệnh có biểu hiện rối loạn về thần kinh nhƣ: bơi không bình thƣờng, lòng vòng không định hƣớng, mất thăng bằng, đầu chúc xuống dƣới. Cá bệnh ít hoạt động, đầu treo trên mặt nƣớc hoặc nằm dƣới đáy bể, đáy lồng. Cá chết sau 3-5 ngày có dấu hiệu bệnh với tỷ lệ cao, có thể từ 80-100%. Ở nƣớc ta, bệnh xuất hiện ở hầu hết các vùng nuôi cá mú trên cả nƣớc từ tháng 5-10, đặc biệt khi mƣa nhiều, khi nhiệt độ khoảng 25-30ºC.

Tỷ lệ chết do bệnh gây ra dao động từ 50- 100% tùy thuộc vào loài và giai đoạn xuất hiện bệnh [4]. Từ tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng đòi hỏi các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó vắc xin phòng bệnh cho cá là giải pháp hữu hiệu. Ở nƣớc ta hiện tại vắc xin sử dụng để phòng bệnh cho cá mú là vắc xin bất hoạt, tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt khoảng 60-65%.

Vì vậy, cần có một vắc xin có hiệu lực cao hơn, đem lại khả năng phòng bệnh tốt hơn, giúp giảm thiểu sự thất thoát do bệnh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hƣớng đến việc tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV làm tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh cho cá mú, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú Epinephelus sp. phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp”. Mục tiêu nghiên cứu 2.

Mục tiêu chung Nghiên cứu gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp T4 của virus phục vụ công tác chẩn đoán và nghiên cứu nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú. Mục tiêu cụ thể - Nghiên cứu đƣợc gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp T4 của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú. - Xác định đƣợc khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp T4 trên động vật thí nghiệm làm cơ sở nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh cho cá. Nội dung nghiên cứu (1) Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T4 của virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) ở cá mú.

(2) Biểu hiện gen thành công kháng nguyên bề mặt của NNV trong tế bào vi khuẩn E. (3) Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp: - Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ. - Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú. 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

SƠ LƢỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ 1. Cá mú Cá mú hay cá song là giống cá có tên khoa học là Epinephelus (tên tiếng Anh: groupers) thuộc họ (Serranidase), bộ cá vƣợc (Perciformes), lớp cá vây tia (Actinopterygii), ngành Chordata [65]. Cá mú hoa nâu Epinephelus malabaricus Epinephel atu Cá mú chấm đỏ (Epinephelus Cá mú dẹt (Cromileptes altivelis) Cá mú bleekeri (Epinephelus Cá mú chấm tổ ong (E. bleekeri) merra) Hình 1.

Một số loài cá mú nuôi chủ yếu Cá mú là loại cá nƣớc mặn, sống tại những vùng nƣớc ấm, phân bố chủ yếu ở vùng biển nhiệt đới và á nhiệt đới, tập trung nhiều loài ở vùng biển Thái Bình Dƣơng. Theo Viện Hải dƣơng học Nha Trang, nƣớc ta có khoảng trên 30 loài cá mú, trong đó có nhiều loài có giá trị kinh tế cao, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu nhƣ: cá 4 mú vạch (E. brunneus), cá mú chấm tổ ong (E. akaara), cá mú hoa nâu (E.

Vùng biển Bắc Bộ có cá mú mỡ, cá mú đen, cá mú cáo. Vùng biển miền Trung có cá mú đỏ. Vùng biển Đông và Tây Nam Bộ có cá mú đỏ, cá mú mỡ. Ngoài ra, cũng còn nhiều loài có giá trị cao nhƣng chƣa đƣợc đƣa vào nuôi phổbiến, chủ yếu có đƣợc là do đánh bắt nhƣ cá mú nghệ (E.

Nhiệt độ thích hợp cho cá mú là từ 22 - 28 oC, thích hợp nhất là từ 25 - 28 oC. Chúng thƣờng sống ở các hốc đá, các áng, vùng ven bờ quanh các đảo có rạn đá san hô, nơi có độ sâu từ 10 - 30 m, chịu đựng đƣợc độ mặn rộng từ 11 - 41‰. Cá mú thuộc loài cá dữ, có tính ăn thịt và bắt mồi theo phƣơng thức rình mồi, thƣờng săn mồi ở nơi yên tĩnh. Cá con mới nở ăn động vật phù du, cá lớn cỡ từ 8 - 12 cm ăn động vật sống (cá con, tôm, tép.), cá mú rất ít khi ăn mồi đã chết và mồi chìm ở đáy.

Ở cá mú có sự chuyển đổi giới tính đực cái. Thông thƣờng lúc còn nhỏ chúng là cá cái, nhƣng khi đạt đến kích cỡ và tuổi nhất định thì chuyển thành cá đực. Tuy nhiên, vẫn có một số ít không có sự chuyển đổi giới tính. Cá mú có thể đẻ quanh năm nhƣng tập trung vào những tháng lạnh, nhiệt độ thấp, vì thế ở từng vùng khác nhau, mùa vụ xuất hiện cá giống cũng khác nhau.

Sức sinh sản của cá khá cao, mỗi con cái có thể đẻ từ vài trăm ngàn đến vài triệu trứng. Tại Việt Nam, nguồn cá giống chủ yếu đƣợc đánh bắt ngoài tự nhiên vào tháng 5 đến tháng 7 ở miền Bắc và tháng 1 đến tháng 3 ở miền Trung, ngoài ra có thể nhập khẩu từ Đài Loan, Philippines, Trung Quốc… Năm 2005, Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản TW2 chính thức thông báo ƣơng giống thành công loài cá mú đen chấm đỏ. Hiện tại, một số trung tâm giống cũng tự sản xuất đƣợc một lƣợng giống nhất định nhƣng còn rất ít so với nhu cầu giống của thị trƣờng nội địa [64]. Cá mú có giá trị kinh tế rất cao, giá thị trƣờng hiện nay đối với loài cá mú đen và cá mú hoa nâu là 200.

Với cá mú chấm đỏ loại này có giá 400. Vì vậy, hiện nay 5 ngoài việc đánh bắt tự nhiên, phong trào nuôi cá mú lồng bè cũng rất phát triển. Cá mú có thể đƣợc nuôi trong các lồng tre, bè gỗ có phủ lƣới, đƣợc đặt cố định hay thả nổi ở các vùng biển ít gió bão, sóng nhẹ nhƣ các vịnh, đầm phá. Tuy nhiên, cá mú thƣờng gặp một số bệnh do vi sinh vật gây ra nhƣ: bệnh đốm đỏ, bệnh hoại sơ, bệnh đƣờng ruột, bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết…[3].

Một trong những bệnh nguy hiểm nhất do vius gây ra là bệnh hoại tử thần kinh, thƣờng xảy ra ở giai đoạn ấu trùng và cá giống. Cá bị bệnh thƣờng có tỉ lệ chết cao và nhanh. Hiện nay chƣa có thuốc đặc trị đối với bệnh này, biện pháp chủ yếu vẫn là phòng ngừa bằng cách đảm bảo vệ sinh và cách ly với các nguồn virus tiềm tàng. Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN) Bệnh hoại tử thần kinh hay gọi là bệnh não và võng mạc do Betanodavirus còn gọi là Piscine nodavirus gây ra [66].

Virus này ký sinh trong tế bào chất của tế bào thần kinh trong não và trong võng mạc mắt. Bệnh xuất hiện ở nhiều loài cá biển và phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau [22]. Những chi tiết đầu tiên mô tả về bệnh vào những năm 1989 - 1991, bệnh đƣợc phát hiện gần nhƣ đồng thời tại Úc, Na Uy, Pháp và Nhật Bản [14],[15],[28],[41]. Bệnh VNN sau đó đã đƣợc phát hiện trên 30 loài cá biển thuộc 14 họ trên vùng biển Thái Bình Dƣơng, khu vực Địa Trung Hải, Scandinavia và Bắc Mỹ [24].

Bệnh thƣờng gặp ở cá nuôi lồng nhƣ cá mú điểm đai (Epinephelus malabaricus) - Thái Lan, cá mú mỡ (E. tauvina) - Singapore, cá mú vân mây (E. akaara) - Nhật Bản, cá mú bảy sọc (E.