Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm lecanicillium lecanii

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc tính chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii, ứng dụng trong sinh học và nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Hữu Quân
• Người hướng dẫn: PGS. Quyền Đình Thi
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Nấm Lecanicillium lecanii
• 1.2. Chitinase
• 1.3. Nguồn gốc của chitinase
• 2. MỞ ĐẦU
• 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.1.1. Mục tiêu chung
• 2.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Những đóng góp mới của luận án
• 2.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
• 2.4.1. Về khoa học
• 2.4.2. Về thực tiễn
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu và hóa chất
• 3.2. Dung dịch và đệm
• 3.3. Môi trường nuôi cấy
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phương pháp nuôi cấy
• 3.4.2. Phương pháp hóa sinh
• 3.4.3. Tinh sạch chitinase
• 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của chitinase tự nhiên và tái tổ hợp
• 3.4.5. Các phương pháp sinh học phân tử
• 3.4.6. Phương pháp thử nghiệm
• 3.4.7. Xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ nấm L.
• 4.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao
• 4.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA
• 4.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase
• 4.2. Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng nấm L.
• 4.2.1. Tinh sạch chitinase
• 4.2.2. Đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng nấm L.
• 4.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L.
• 4.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong nấm men P.
• 4.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men
• 4.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P.
• 4.4.3. Tinh sạch rChit
• 4.4.4. Đánh giá tính chất lý hóa của rChit từ nấm men P.
• 4.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và bào tử từ nấm L.
• 4.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng
• 4.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp
• 4.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm
• 4.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm
• 4.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L.
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Nghiên cứu chitinase từ nấm Lecanicillium lecanii

Nghiên cứu tập trung vào chitinase, một enzyme quan trọng được sản xuất bởi nấm Lecanicillium lecanii. Chitinase có khả năng thủy phân chitin, một thành phần chính trong vỏ côn trùng và vách tế bào nấm. Nghiên cứu này nhằm khám phá đặc tính tự nhiên và tái tổ hợp của chitinase, đồng thời tối ưu hóa quá trình sản xuất enzyme này. Lecanicillium lecanii được chọn làm đối tượng nghiên cứu do khả năng ký sinh côn trùng và sản xuất chitinase mạnh mẽ. Các phương pháp sinh học phân tử và công nghệ sinh học được áp dụng để phân tích và biểu hiện gen mã hóa chitinase.

1.1. Đặc tính tự nhiên của chitinase

Chitinase từ Lecanicillium lecanii được nghiên cứu về cấu trúc, cơ chế hoạt động và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Enzyme này thuộc nhóm glycosyl hydrolase, có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong chitin. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, và nồng độ cơ chất được khảo sát để tối ưu hóa hoạt tính của chitinase. Kết quả cho thấy chitinase từ Lecanicillium lecanii có hoạt tính cao trong điều kiện nhiệt độ 40-50°C và pH 5-6. Điều này mở ra tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y học.

1.2. Tái tổ hợp chitinase

Quá trình tái tổ hợp chitinase được thực hiện bằng cách biểu hiện gen mã hóa enzyme trong nấm men Pichia pastoris. Gen Chit từ Lecanicillium lecanii được nhân dòng và biểu hiện thành công, tạo ra protein tái tổ hợp có hoạt tính cao. Chitinase tái tổ hợp được tinh sạch và đánh giá về tính chất lý hóa, bao gồm độ bền nhiệt, pH và khả năng thủy phân chitin. Kết quả cho thấy chitinase tái tổ hợp có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng và nấm bệnh.

II. Ứng dụng của chitinase trong nông nghiệp và công nghiệp

Chitinase từ Lecanicillium lecanii có nhiều ứng dụng thực tiễn, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp và công nghiệp. Enzyme này được sử dụng để kiểm soát côn trùng gây hại và nấm bệnh trên cây trồng. Chitinase có khả năng phá hủy lớp vỏ chitin của côn trùng, làm suy yếu và tiêu diệt chúng. Ngoài ra, chitinase còn được ứng dụng trong xử lý chất thải chitin từ ngành thủy sản và sản xuất các sản phẩm sinh học.

2.1. Ứng dụng trong nông nghiệp

Chitinase được sử dụng như một thành phần trong chế phẩm sinh học để kiểm soát côn trùng gây hại như rệp và bọ cánh cứng. Enzyme này phá hủy lớp vỏ chitin của côn trùng, làm chúng không thể phát triển và sinh sản. Ngoài ra, chitinase còn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh như Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, giúp bảo vệ cây trồng hiệu quả.

2.2. Ứng dụng trong công nghiệp

Trong công nghiệp, chitinase được sử dụng để xử lý chất thải chitin từ ngành thủy sản, giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Enzyme này còn được ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm sinh học như chất bảo quản thực phẩm và dược phẩm. Chitinase có tiềm năng lớn trong việc tạo ra các sản phẩm thân thiện với môi trường và an toàn cho sức khỏe con người.

III. Phân tích và đánh giá giá trị nghiên cứu

Nghiên cứu về chitinase từ Lecanicillium lecanii mang lại nhiều giá trị khoa học và thực tiễn. Về mặt khoa học, nghiên cứu cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc, cơ chế hoạt động và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của chitinase. Về mặt thực tiễn, nghiên cứu mở ra tiềm năng ứng dụng chitinase trong nông nghiệp và công nghiệp, góp phần phát triển các giải pháp sinh học bền vững.

3.1. Giá trị khoa học

Nghiên cứu cung cấp dữ liệu khoa học về chitinase từ Lecanicillium lecanii, bao gồm cấu trúc gen, cơ chế hoạt động và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Điều này góp phần làm phong phú thêm kiến thức về enzyme và sinh học phân tử, đồng thời mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

3.2. Giá trị thực tiễn

Nghiên cứu mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn, đặc biệt trong việc phát triển các chế phẩm sinh học để kiểm soát côn trùng và nấm bệnh. Chitinase từ Lecanicillium lecanii có tiềm năng lớn trong việc thay thế các hóa chất độc hại, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu về các giải pháp bảo vệ thực vật sinh học nhằm thay thế hóa chất bảo vệ thực vật độc hại đang là trọng tâm mang tính chiến lược trong nền nông nghiệp bền vững toàn cầu. Trong bối cảnh đó, nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium lecanii (trước đây là Verticillium lecanii) nổi lên như một tác nhân kiểm soát sinh học (biocontrol agent) tiềm năng đối với các loài côn trùng chích hút như rệp muội (Myzus persicae, Aphis gossypii), bọ trĩ và ruồi trắng. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất trong việc ứng dụng chế phẩm sinh học là hiệu lực tiêu diệt chậm và phụ thuộc lớn vào điều kiện ngoại cảnh. Cơ chế xâm nhiễm của nấm phụ thuộc mang tính quyết định vào hệ enzyme ngoại bào, đặc biệt là phức hệ chitinase có chức năng phân giải lớp vỏ cutin/chitin của côn trùng và vách tế bào nấm bệnh. Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Hóa sinh học (mã số 62 42 01 16) của nghiên cứu sinh Nguyễn Hữu Quân, thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Quyền Đình Thi và PGS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh tại Viện Công nghệ Sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Đại học Thái Nguyên (2015), mang tiêu đề: "Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii".

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi được luận án xác định xuất phát từ thực trạng các công bố quốc tế và trong nước trước đây (như Kim et al., 2008; Zhu et al., 2008; Gan et al., 2007) chủ yếu dừng lại ở các khâu nghiên cứu đơn lẻ: tối ưu môi trường nuôi cấy hạn chế, tinh sạch chitinase tự nhiên với hoạt tính thấp, hoặc biểu hiện gen trong vi khuẩn Escherichia coli dẫn đến hiện tượng cuộn gập sai, tạo thể vùi (inclusion bodies), dimer hóa bất thường (88,4 kDa) làm giảm hoạt tính xúc tác (chỉ đạt 53,1 mU/ml). Luận án giải quyết 4 câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học chính:

1. RQ1 & H1: Chủng nấm Lecanicillium lecanii bản địa nào tại Việt Nam sở hữu tiềm năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất và mang đặc điểm phân loại phân tử chuẩn xác dựa trên chỉ thị 28S rRNA?
2. RQ2 & H2: Các thông số lý hóa tối ưu (nhiệt độ, pH, nguồn carbon/nitơ, ion kim loại) tác động như thế nào đến động học xúc tác và độ bền của chitinase tự nhiên tinh sạch qua sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex A-50?
3. RQ3 & H3: Cấu trúc đoạn gen mã hóa chitinase (Chit) phân lập từ chủng tuyển chọn có đặc điểm phân tử ra sao, thuộc họ glycosyl hydrolase nào và có thể được biểu hiện ngoại bào hòa tan với hoạt tính cao trong hệ thống nấm men Pichia pastoris X33 hay không?
4. RQ4 & H4: Chitinase tự nhiên và chitinase tái tổ hợp (rChit) có khả năng thủy phân cấu trúc vỏ rệp (Myzus persicae) và ức chế sự sinh trưởng của các chủng nấm bệnh thực vật nguy hiểm (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani) ở mức độ định lượng nào?

Khung lý thuyết của luận án tích hợp phân loại cấu trúc enzym học Glycosyl Hydrolase Family 18 (GH18) của Henrissat (1991), động học enzyme Michaelis-Menten, và mô hình xâm nhiễm bệnh học côn trùng (Entomopathogenic fungal infection model). Đóng góp mang tính đột phá của công trình là việc phân lập, nhân dòng thành công gen Chit (1272 bp mã hóa 423 amino acid) từ chủng L. lecanii 43H, đăng ký bản quyền trình tự trên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank với mã số JX665045, và thiết lập thành công hệ biểu hiện tái tổ hợp ngoại bào hiệu năng cao trong nấm men P. pastoris X33 (sử dụng vector pPICZαA tích hợp promoter AOX1 cảm ứng bởi methanol 1,0%), mở ra khả năng sản xuất quy mô lớn chế phẩm enzyme hỗ trợ diệt rệp và nấm hại cây trồng.

Literature Review và Positioning

Phức hệ chitinase xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn phân N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) cấu tạo nên polymer chitin – hợp chất hữu cơ phong phú thứ hai trong sinh giới sau cellulose (Flach et al., 1992; Gooday, 1990). Theo danh pháp quốc tế (NC-IUBMB), chitinase bao gồm endochitinase (EC 3.2.1.14), chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và β-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.52). Dựa trên độ tương đồng cấu trúc bậc một và cấu trúc không gian ba chiều, Henrissat và Bairoch (1993) phân chia chitinase vào 3 họ chính: GH18, GH19 và GH20. Họ GH18 có cấu trúc lõi nếp gấp (fold) dạng thùng tròn $(\beta/\alpha)_8$ (tim-barrel structure), hoạt động theo cơ chế giữ nguyên cấu hình anomer (retaining mechanism) thông qua chất trung gian ion oxazolinium (substrate-assisted catalysis), rất nhạy cảm với chất ức chế allosamidin (van Aalten et al., 2001; Songsiriritthigul et al., 2008).

Trong y văn học thuật, tồn tại những luồng quan điểm và tranh luận đa chiều về hiệu năng và bản chất của hệ biểu hiện chitinase tái tổ hợp. Trường phái nghiên cứu do Barboza-Corona et al. (2003) và Songjang et al. (2006) đại diện tập trung vào hệ biểu hiện nhân sơ Escherichia coli nhờ ưu thế sinh trưởng nhanh và thao tác di truyền đơn giản. Tuy nhiên, các nghiên cứu đối nghịch từ Zhu et al. (2008) khi biểu hiện chitinase của L. lecanii trong E. coli bằng vector pMAL-c2X đã chứng minh hạn chế nghiêm trọng: enzyme tái tổ hợp bị dimer hóa tạo khối lượng 88,4 kDa, hình thành cấu trúc bất hoạt hoặc hoạt tính rất thấp (53,1 mU/ml) do tế bào nhân sơ thiếu bộ máy sửa đổi sau dịch mã (post-translational modification) như hình thành cầu nối disulfide chính xác và glycosyl hóa. Ngược lại, trường phái nghiên cứu sử dụng nấm men Pichia pastoris (tiêu biểu như Gan et al., 2007 trên Lecanicillium psalliotae; Al-Rashed et al., 2010 trên Trichoderma virens UKM1; Prasad & Palanivelu, 2012 trên Thermomucor lanuginosus) khẳng định P. pastoris là hệ thống tối ưu cho các protein ngoại bào của Eukaryote nhờ tín hiệu tiết α-factor từ Saccharomyces cerevisiae, cho phép enzyme cuộn gập tự nhiên, bài tiết trực tiếp ra môi trường nuôi cấy và đạt hoạt tính riêng vượt trội.

Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế điển hình:

• Nghiên cứu của Gan et al. (2007) trên L. psalliotae phân lập gen mã hóa chitinase 423 amino acid, biểu hiện trong P. pastoris GS115 bằng vector pPIC9K cho enzyme có trọng lượng 45 kDa, pH tối ưu 7,0 và nhiệt độ tối ưu 37,6°C.
• Nghiên cứu của Zhu et al. (2008) trên L. lecanii CHI1 (370 amino acid, 40,93 kDa) và CHI2 (423 amino acid, 45,95 kDa) biểu hiện trong E. coli nhưng không khảo sát toàn diện khả năng phân giải vỏ côn trùng trong tương tác phối hợp với bào tử.
• Nghiên cứu của Al-Rashed et al. (2010) biểu hiện endochitinase từ T. virens trong P. pastoris X33 đạt hoạt tính riêng 1,34 U/mg protein với phân tử lượng 35 kDa.

Luận án của Nguyễn Hữu Quân đã định vị chính xác vị thế khoa học bằng cách lấp đầy mắt xích thiếu hụt: nghiên cứu tích hợp đa tầng từ sàng lọc vi sinh vật bản địa, giải mã cơ chế hóa sinh của chitinase tự nhiên, tách dòng và biểu hiện chuẩn hóa gen Chit (JX665045) trong P. pastoris X33, đến đánh giá thực nghiệm cơ chế phân hủy trực tiếp lớp vỏ chitin của rệp muội (Myzus persicae) và ức chế nấm gây bệnh mùa màng (F. oxysporum, R. solani).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm lý thuyết phân loại enzyme Glycosyl Hydrolase Family 18 (GH18) của Henrissat và lý thuyết động học xúc tác phân tử (substrate-assisted catalysis mechanism) của van Aalten et al. (2001). Cụ thể, trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của gen Chit từ chủng L. lecanii 43H đã khẳng định sự hiện diện bảo tồn tuyệt đối của motif trung tâm hoạt động: $$\text{Phe-Asp-Gly-Ile-Asp-Trp-Glu (FDGIDWE)}$$ chứa bộ ba amino acid then chốt Asp140 - Asp142 - Glu144 trực tiếp tham gia tương tác proton hóa nhóm N-acetamido và ổn định ion trung gian oxazolinium. Đồng thời, vùng liên kết cơ chất (substrate binding site) nằm ngoài trung tâm hoạt động được xác định gồm 7 amino acid bảo tồn: $$\text{Val-Met-Leu-Ser-Ile-Gly-Gly (VMLSIGG)}$$

Mô hình khái niệm (conceptual model) của nghiên cứu xác lập mối quan hệ tuyến tính và tương tác đa biến giữa cấu trúc phân tử của enzyme (khối lượng phân tử 45-46 kDa, điểm đẳng điện lý thuyết $\text{pI} \approx 5,55$) với độ ổn định xúc tác dưới các điều kiện vi môi trường. Luận án đã kiểm chứng bằng thực nghiệm các giả thuyết động học xúc tác, chứng minh chitinase tái tổ hợp tuân thủ mô hình Michaelis-Menten thông qua đồ thị chuyển hóa tương hỗ kép Lineweaver-Burk: $$\frac{1}{V} = \frac{K_m}{V_{\max}} \cdot \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}}$$ xác định được ái lực cơ chất cao với chitin huyền phù và chitin keo.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án kết hợp liên ngành giữa 3 nền tảng lý thuyết:

1. Lý thuyết cấu trúc - chức năng enzyme học (Protein Structure-Function Relationship).
2. Công nghệ DNA tái tổ hợp và tối ưu hóa biểu hiện dị lượng trong Eukaryote (Heterologous Eukaryotic Expression Theory).
3. Bệnh học côn trùng và cơ chế đối kháng sinh học (Insect Pathology & Biological Antagonism Paradigm).

Phương pháp phân tích tiếp cận theo chuỗi logic khép kín: Gene $\rightarrow$ Protein $\rightarrow$ Catalytic Function $\rightarrow$ Target Degradation $\rightarrow$ Bio-efficacy. Điều kiện biên (boundary conditions) được xác định rõ ràng: các đặc tính động học xúc tác và độ bền của chitinase bị giới hạn ở dải nhiệt độ $20-50^\circ\text{C}$ (bị biến tính ở $>60^\circ\text{C}$) và dải pH $5,0-8,0$; hoạt tính bị ức chế nghiêm trọng bởi các cation kim loại nặng ($\text{Hg}^{2+}$, $\text{Cu}^{2+}$) nhưng được kích thích và ổn định bởi ion $\text{Co}^{2+}$, $\text{Mn}^{2+}$ và các chất hoạt động bề mặt không ion hóa (Tween 20, Triton X-100).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo triết học thực chứng (positivism) với phương pháp tiếp cận thực nghiệm định lượng nghiêm ngặt (quantitative experimental methodology). Thiết kế nghiên cứu đa tầng (multi-level design) bao gồm 5 cấp độ gắn kết logic:

• Cấp độ 1 (Microbial Level): Tuyển chọn trong 8 chủng nấm L. lecanii bảo tồn tại Viện Công nghệ Sinh học; định danh phân tử chủng ưu tú 43H bằng giải trình tự gen 28S rRNA qua cặp mồi chuyên biệt NL1/NL4.
• Cấp độ 2 (Fermentation Level): Quy hoạch thực nghiệm đơn yếu tố khảo sát động thái sinh tổng hợp enzyme (thời gian nuôi cấy 24-240 giờ, nhiệt độ 28, 30, $37^\circ\text{C}$, nồng độ chitin huyền phù 0,1-3,0%, 9 nguồn nitơ hữu cơ/vô cơ, 11 nguồn carbon, pH 4,0-9,0).
• Cấp độ 3 (Biochemical Level): Tinh sạch enzyme tự nhiên qua kết tủa phân đoạn muối $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$, thẩm tích và sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex A-50; điện di biến tính SDS-PAGE xác định độ tinh sạch và phân tử lượng.
• Cấp độ 4 (Molecular & Recombinant Level): Tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA bằng RT-PCR; nhân dòng gen Chit vào vector trung gian pJET1.2/blunt, biến nạp E. coli DH5α; chuyển gen vào vector biểu hiện pPICZαA cắt mở bằng enzyme giới hạn XhoI và XbaI, tạo cấu trúc tái tổ hợp pPChit; tuyến tính hóa bằng enzyme PmeI hoặc SacI và biến nạp vào tế bào khả biến nấm men P. pastoris X33 bằng xung điện (electroporation); sàng lọc thể biến nạp kháng Zeocin ($100,\mu\text{g/ml}$).
• Cấp độ 5 (Bioassay Level): Khảo sát đối kháng in vitro với nấm bệnh Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani; thử nghiệm phân hủy vỏ rệp và đánh giá độc lực diệt rệp cải (Myzus persicae) trong điều kiện phòng thí nghiệm được chuẩn hóa nhiệt độ $25-30^\circ\text{C}$, độ ẩm $80-85%$, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ sáng / 8 giờ tối.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Phương pháp đo hoạt tính chitinase được chuẩn hóa tuyệt đối theo nguyên tắc định lượng đường khử giải phóng (N-acetyl glucosamine) bằng thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) ở bước sóng $\lambda = 540,\text{nm}$ trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-2500 (Miller, 1959). Một đơn vị hoạt tính (U) được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác giải phóng $1,\mu\text{mol}$ N-acetyl glucosamine trong thời gian 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn ($37^\circ\text{C}$, pH 7,0). Định lượng protein hòa tan được thực hiện theo phương pháp Bradford (1976) sử dụng Bovine Serum Albumin (BSA) làm đường chuẩn nồng độ.

Sự suy thoái của polymer chitin và sản phẩm oligomer sau thủy phân được phân tích định tính và định lượng qua phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) với hệ dung môi n-butanol : methanol : amoniac 25% : nước cất ($5:4:2:1\text{ v/v}$) và hiện màu bằng dung dịch aniline-diphenylamine. Hoạt tính định tính được xác định thông qua đường kính vòng phân giải (halo zone) trên đĩa thạch bổ sung 0,5% chitin huyền phù nhuộm dung dịch Lugol 1%.

Data và phân tích

Dữ liệu thực nghiệm được thu thập độc lập với 3 lần lặp lại ($n=3$), xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng (Excel, SPSS, Statgraphics), biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SD}$). Cây phân loại chủng giống và cây phân loại phát sinh chủng loại của chuỗi amino acid gen Chit được xây dựng bằng phần mềm MEGA/ClustalW sử dụng thuật toán Neighbor-Joining với hệ số bootstrap 1000 lần lặp lại, đối chiếu dữ liệu tương đồng thông qua công cụ BLAST (NCBI). Các thông số động học enzyme ($K_m, V_{\max}$) được tính toán từ phương trình hồi quy tuyến tính của đồ thị Lineweaver-Burk với hệ số tương quan $R^2 > 0,98$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Tuyển chọn và định danh thành công chủng nấm ưu tú L. lecanii 43H: Trong số 8 chủng khảo sát, chủng 43H thể hiện hoạt tính chitinase ngoại bào cao nhất với bán kính vòng thủy phân $R_{\text{halo}} = 12,5,\text{mm}$. Phân tích trình tự đoạn gen 28S rRNA (dài ~600 bp) khẳng định chủng 43H đạt độ tương đồng 99-100% với các chủng Lecanicillium lecanii chuẩn trên GenBank.
2. Xác lập điều kiện sinh tổng hợp tối ưu cho chủng 43H: Môi trường nuôi cấy MT cải tiến đạt đỉnh hoạt tính chitinase ở thời gian nuôi 144 giờ tại $28^\circ\text{C}$, pH 5,0, cơ chất chitin huyền phù 0,75%, nguồn nitơ tối ưu là pepton 0,5% và nguồn carbon tối ưu là cao nấm men kết hợp glucose.
3. Giải mã hoàn chỉnh gen mã hóa endochitinase (Chit): Đoạn gen Chit có kích thước 1272 bp mã hóa chuỗi polypeptide gồm 423 amino acid, khối lượng phân tử tính toán ~46 kDa. Trình tự được đăng ký chính thức trên GenBank với mã số quốc tế JX665045.
4. Biểu hiện dị lượng ngoại bào vượt trội trong Pichia pastoris X33: Chủng tái tổ hợp P. pastoris X33/pPChit khi được nuôi cấy trong môi trường YP lỏng cảm ứng bằng methanol 1,0% bổ sung định kỳ 24 giờ một lần ở $28^\circ\text{C}$ đã tiết trực tiếp rChit ra môi trường với hoạt tính cao gấp nhiều lần so với hệ thống biểu hiện trong E. coli trước đây của Zhu et al. (2008).
5. Đặc tính hóa sinh và khả năng ứng dụng đối kháng sinh học:
   • Chitinase tự nhiên tinh sạch qua cột DEAE-Sephadex A-50 cho một băng điện di đồng nhất trên SDS-PAGE ở kích thước ~45 kDa; pH tối ưu 6,0-7,0; nhiệt độ tối ưu $45-50^\circ\text{C}$; bền vững trong dải pH 5,0-8,0 và nhiệt độ dưới $50^\circ\text{C}$.
   • Chitinase tái tổ hợp (rChit) thể hiện hoạt tính tối ưu ở pH 6,0, nhiệt độ $40-45^\circ\text{C}$, được hoạt hóa mạnh bởi $\text{Mn}^{2+}$ và $\text{Co}^{2+}$, chịu được các chất tẩy rửa nồng độ thấp (Tween 20, Tween 80, SDS 0,1 mM).
   • Bằng chứng thực nghiệm: Nguồn trích dẫn trực tiếp từ văn bản khẳng định: "Luận án đã tinh sạch, đánh giá một số tính chất lý hóa và chứng minh được khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani của exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H"; "Chứng minh được rChit có khả năng làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp" và "Gen Chit từ chủng nấm L. lecanii 43H được phân lập, tách dòng thành công và xác định được trình tự; đoạn gen Chit được đăng kí trong GenBank với mã số JX665045". Khi kết hợp enzyme chitinase với bào tử nấm L. lecanii mật độ $2 \times 10^8,\text{CFU/ml}$, tỷ lệ diệt rệp Myzus persicae đạt trên 90% sau 5-7 ngày thử nghiệm.

Implications đa chiều

• Về mặt học thuật và lý thuyết: Cung cấp dữ liệu phân tử chuẩn mực về enzyme endochitinase họ GH18 từ nấm ký sinh côn trùng L. lecanii, làm sáng tỏ cơ chế thủy phân phối hợp giữa endo- và exo-chitinase trong việc phá vỡ cấu trúc tinh thể chitin dạng $\alpha$ và $\beta$.
• Về mặt phương pháp luận: Xây dựng quy trình chuẩn hóa từ tạo dòng cDNA, thiết kế vector tích hợp pPChit đến tinh sạch một bước chitinase ngoại bào từ dịch nuôi cấy nấm men, có thể chuyển giao áp dụng cho các enzyme công nghiệp khác.
• Về ứng dụng thực tiễn: Mở ra triển vọng sản xuất chế phẩm sinh học thế hệ mới (Bio-formulation) phối trộn giữa bào tử nấm sống và enzyme chitinase tái tổ hợp, giúp rút ngắn thời gian gây chết rệp từ 14 ngày xuống 4-5 ngày, giảm thiểu phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ và cúc tổng hợp.
• Về chính sách và môi trường: Đóng góp cơ sở khoa học trực tiếp cho Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp Quốc gia của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn nhằm phát triển nông nghiệp hữu cơ và an toàn sinh học.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn chỉ ra các hạn chế kỹ thuật:

1. Đặc tính dung sai nhiệt: Cả chitinase tự nhiên và rChit đều mất hoạt tính nhanh chóng khi xử lý ở nhiệt độ trên $60^\circ\text{C}$, đặt ra thách thức về độ bền bảo quản trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm.
2. Quy mô thực nghiệm: Các thử nghiệm diệt rệp và ức chế nấm bệnh mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro) và mô hình chậu cát/nhà lưới quy mô nhỏ, chưa tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng đa tiểu vùng sinh thái.
3. Cấu trúc tinh thể 3D: Nghiên cứu dừng lại ở mức mô hình hóa phân tử suy diễn và so sánh chuỗi (homology modeling), chưa thực hiện tinh thể hóa protein (X-ray crystallography) hoặc phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để giải mã tọa độ không gian chính xác của phức hợp enzyme - cơ chất.

Chương trình nghiên cứu tiếp theo (Future Research Agenda):

• Ứng dụng kỹ thuật tiến hóa định hướng (directed evolution) hoặc đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) tại các vị trí cầu nối disulfide để nâng cao độ bền nhiệt và tính chịu kiềm của enzyme rChit.
• Tối ưu hóa quá trình lên men chìm (submerged fermentation) thể tích lớn trong bioreactor 10L - 100L kiểm soát tự động nồng độ oxy hòa tan (DO), pH và tốc độ cấp nạp methanol (fed-batch strategy).
• Nghiên cứu công nghệ tạo màng bao vi nang (microencapsulation) bảo vệ bào tử và enzyme trước tác động của tia tử ngoại (UV) và nhiệt độ ngoài đồng ruộng.
• Đánh giá phổ tác dụng trên các đối tượng côn trùng gây hại vỏ cứng khác như bọ cánh cứng, bọ vòi voi và tuyến trùng ký sinh thực vật (Meloidogyne spp.).

Tác động và ảnh hưởng

Luận án đóng góp trực tiếp vào chuỗi giá trị khoa học và công nghệ sinh học nông nghiệp:

• Tác động học thuật: Công bố dữ liệu trình tự gen JX665045 trên GenBank tạo nguồn tài nguyên tham chiếu quốc tế; các bài báo khoa học xuất bản trên các tạp chí chuyên ngành uy tín của Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và hệ sinh thái tạp chí Đại học Thái Nguyên tạo tiền đề cho các trích dẫn trong lĩnh vực enzymology và biocontrol.
• Chuyển đổi ngành công nghiệp chế phẩm sinh học: Tạo ra nguồn nguyên liệu enzyme tinh khiết tái tổ hợp hoạt tính cao, hỗ trợ các doanh nghiệp công nghệ sinh học nông nghiệp phát triển các dòng sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học có hoạt lực nhanh, khắc phục triệt để nhược điểm "tác động chậm" của chế phẩm truyền thống.
• Lợi ích xã hội và môi trường: Giảm thiểu dư lượng hóa chất độc hại trong nông sản xuất khẩu (như chè, rau họ cải, cây ăn quả), bảo vệ nguồn nước ngầm, duy trì cân bằng hệ sinh thái thiên địch và bảo vệ sức khỏe người nông dân.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học: Tiếp cận quy trình thực nghiệm mẫu mực từ thiết kế mồi PCR, tạo dòng gen dị lượng, tối ưu hóa biểu hiện trong P. pastoris đến tinh sạch và phân tích động học enzyme.
• Các nhà nghiên cứu enzyme học và bệnh học côn trùng: Sử dụng dữ liệu động học, trình tự amino acid và đặc tính ức chế ion kim loại để mở rộng nghiên cứu cơ chế phân tử của phức hệ enzymic họ GH18.
• Các trung tâm R&D và doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Ứng dụng chủng giống nấm men tái tổ hợp và quy trình công nghệ lên men tiết enzyme ngoại bào để thương mại hóa các chế phẩm trừ sâu sinh học nồng độ cao.
• Cơ quan quản lý nhà nước và khuyến nông: Có thêm cơ sở thực chứng để xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) và chiến lược chuyển đổi xanh trong sản xuất nông nghiệp.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Trả lời: Luận án đã làm sáng tỏ cấu trúc phân tử và cơ chế xúc tác của endochitinase họ Glycosyl Hydrolase 18 từ chủng L. lecanii 43H, xác nhận sự bảo tồn của motif xúc tác $\text{FDGIDWE}$ và motif gắn cơ chất $\text{VMLSIGG}$. Đồng thời, nghiên cứu chứng minh hệ thống nấm men Pichia pastoris X33 kiểm soát bởi promoter AOX1 là nền tảng tối ưu cho phép tái tạo chính xác hoạt tính sinh học và cấu trúc monomer tự nhiên (45-46 kDa) của chitinase ngoại bào từ nấm sợi ký sinh côn trùng.

2. Điểm đổi mới phương pháp luận khi so sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm? Trả lời: So với nghiên cứu của Zhu et al. (2008) biểu hiện trong E. coli bị dimer hóa bất thường (88,4 kDa) và hoạt tính thấp (53,1 mU/ml), hoặc nghiên cứu của Gan et al. (2007) trên L. psalliotae dùng vector pPIC9K, luận án đã sử dụng vector tích hợp pPICZαA chứa peptide tín hiệu α-factor biến nạp vào P. pastoris X33. Cải tiến này giúp enzyme tái tổ hợp rChit được tiết hoàn toàn ra ngoài môi trường ở dạng hòa tan, loại bỏ bước phá vỡ tế bào phức tạp và nâng cao hiệu suất thu hồi qua tinh sạch.

3. Phát hiện bất ngờ và có ý nghĩa nhất trong quá trình thực nghiệm? Trả lời: Đó là hoạt tính chitinase được kích hoạt mạnh mẽ bởi ion $\text{Co}^{2+}$ và $\text{Mn}^{2+}$ cũng như sự bền bỉ của enzyme trước các dung môi hữu cơ phân cực và chất hoạt động bề mặt (Tween 20, Triton X-100 ở nồng độ 0,1-1,0%). Điều này cho phép enzyme duy trì hoạt lực tối đa khi phối trộn vào các công thức phụ gia nhũ hóa của chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học thương mại.

4. Nghiên cứu có cung cấp quy trình nhân bản thực nghiệm (Replication Protocol) hoàn chỉnh không? Trả lời: Có. Luận án mô tả chi tiết, minh bạch toàn bộ các thông số: thành phần các loại môi trường (BMM, BMMY, YP, LB low salt), chu trình nhiệt phản ứng PCR/RT-PCR, nồng độ Zeocin chọn lọc ($100,\mu\text{g/ml}$), các bước tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE-Sephadex A-50, và quy trình định lượng hoạt tính bằng DNS đo mật độ quang ở bước sóng $540,\text{nm}$.

5. Định hướng lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào? Trả lời: Lộ trình 10 năm tập trung vào: (1) Ứng dụng kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 và đột biến định hướng tăng độ bền nhiệt của rChit lên $>60^\circ\text{C}$; (2) Nâng quy mô lên men bioreactor công nghiệp 500L; (3) Phối chế chế phẩm nano-bioformulation kết hợp bào tử L. lecanii 43H, enzyme rChit và màng bọc chống UV; (4) Khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng đạt chuẩn đăng ký lưu hành thuốc bảo vệ thực vật sinh học quốc gia.

Kết luận

1. Tuyển chọn và định danh thành công chủng nấm Lecanicillium lecanii 43H có năng lực sinh tổng hợp chitinase cao nhất ($R_{\text{halo}} = 12,5,\text{mm}$), tương đồng 99-100% về trình tự gen 28S rRNA với các chủng chuẩn quốc tế.
2. Xác lập bộ thông số tối ưu cho quá trình lên men sinh tổng hợp chitinase tự nhiên: môi trường MT, $28^\circ\text{C}$, pH 5,0, thời gian 144 giờ, bổ sung 0,75% chitin huyền phù và 0,5% pepton.
3. Tinh sạch thành công chitinase tự nhiên bằng sắc ký DEAE-Sephadex A-50 thu được protein đơn băng trên SDS-PAGE với khối lượng phân tử ~45 kDa, hoạt động tối ưu ở $45-50^\circ\text{C}$ và pH 6,0-7,0.
4. Tách dòng và giải mã hoàn chỉnh gen Chit (1272 bp mã hóa 423 amino acid) thuộc họ Glycosyl Hydrolase 18, đăng ký thành công trên GenBank với mã số JX665045.
5. Thiết kế thành công vector tái tổ hợp pPChit và biểu hiện ngoại bào hiệu năng cao chitinase tái tổ hợp (rChit) trong nấm men Pichia pastoris X33 dưới sự cảm ứng của methanol 1,0%.
6. Chứng minh rõ ràng bằng thực nghiệm khả năng phân giải lớp vỏ chitin của rệp muội (Myzus persicae) và ức chế sinh trưởng mạnh mẽ đối với hai loài nấm bệnh nguy hiểm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, tạo cơ sở khoa học và công nghệ vững chắc cho việc sản xuất chế phẩm sinh học diệt trừ sâu nấm hại cây trồng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nấm Lecanicillium lecanii Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Chi nấm Lecanicillium gồm nhiều loài như: Lecanicillium lecanii, L. lecanii trước đây được gọi là Verticillium lecanii.

lecanii được biết là một hình thức sinh sản vô tính trong nhóm trùng thảo Cordyceps confragosa [124]. Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [22], [47], [49], [60], [93]. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám vào cơ thể côn trùng, các bào tử nảy mầm và tạo thành sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể, tại đây chúng sinh trưởng và phá hủy mô.

Sau đó, sợi nấm sẽ phát triển xuyên qua các lớp biểu bì của côn trùng. Trong điều kiện độ ẩm cao, bào tử được tạo thành bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [95]. Dựa vào đặc tính diệt côn trùng của nấm L. lecanii, các nghiên cứu hiện nay đi theo hai hướng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học của chế phẩm bào tử nấm L.

lecanii sử dụng trong kiểm soát côn trùng; và tìm hiểu vai trò của hệ enzyme (chitinase, protease, lipase) hoặc độc tố do nấm L. lecanii sinh ra trong quá trình diệt côn trùng. Các nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium đã được các tác giả nghiên cứu theo các hướng chính là (i) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase; (ii) tinh sạch và xác định khả năng thủy phân lớp vỏ trứng của côn trùng và (iii) nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất thấp.

Mặt khác, chủng nấm L. lecanii nói riêng và các vi sinh vật nói chung thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi ở các e 5 điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh ra từ các chủng nấm là khác nhau. Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ bước lựa chọn điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii trong nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của chitinase và chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng là hướng nghiên cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học.

Chitinase Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được chia thành 2 loại chính là endochitinase (EC 3. Exochitinase gồm chitobiosidase (EC 3.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3. Mỗi loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine.

Cơ chất thủy phân của chitinase thường là chitin. Chitin là một polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn hồi được tạo nên từ các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết 1,4-β glycoside. Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose. Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là α, β và γ-chitin.

Trong đó, dạng α-chitin có cấu trúc đối song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen kẽ nhau và là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên. α-chitin là thành phần cấu tạo nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách tế bào của nấm. Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen kẽ nhau và tồn tại ở dạng liên kết với protein. Dạng γ-chitin được tạo nên từ 2 chuỗi song song xen kẽ với 1 chuỗi đối song song.

Dạng γ-chitin thường tồn tại ở các loài nấm [57]. e 6 Chitin nguyên bản thường có màu trắng đục, mềm dẻo, đàn hồi và khá dai nên khó bị thủy phân. Trong động vật chân đốt, chitin được sửa đổi và liên kết với protein giống như một ma trận và tạo thành bộ xương ngoài. Ở dạng tinh khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu tạo ở hầu hết các động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp.

Trong vỏ giáp xác và động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi cacbonat tạo thành hỗn hợp bền vững hơn. Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đặc hơn so với dạng tinh khiết, đồng thời bền vững và ít giòn hơn so với canxi cacbonat [27]. Nguồn gốc của chitinase Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự nhiên như thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật.

Chitinase được sinh ra từ vi sinh vật gồm 2 loại là endochitinase và exochitinase. Nấm mốc là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh nhất. Các loài nấm mốc thuộc các chi như Trichoderma [32], [37]; Glicocladium; Metharhizium [61], [128]; Beauveria, Lecanicillium [23], [42], [91]; Aspergillus [145]; Penicillium [80] đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh. Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng được xem là đối tượng có khả năng sinh chitinase khá phong phú.

Chitinase được sinh ra từ vi khuẩn thuộc các chi như Serratia [148], Aeromonas [139], Arthrobacter [100], Micrococcus [19], Clostridium, Bacillus [24], [137] và đặc biệt là nhóm Streptomycetes [72], [144]. Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự nhiên. Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin và các hợp chất khác (manan, glucan, cellulose). Tuy nhiên, cấu trúc chitin này so với chitin trong tự nhiên có sự khác nhau về tính không tan, kích thước, độ nhớt, độ phức tạp phân tử và tính không đồng nhất nên không bị thủy phân bởi chitinase của cơ thể.

e 7 Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài như khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan. Chitinase được sinh ra trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trò tham gia vào quá trình hình thành và phát triển phôi. Chitinase trong cây được sinh ra khi có sự kích thích của mầm bệnh giúp cây chống lại sự tấn công của các nấm kí sinh gây bệnh. Ở thực vật, chitinase chủ yếu thuộc loại endochitinase và có kích thước nhỏ hơn so với các nhóm khác.

Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như ruột khoang, giun tròn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của các loài chim, thú ăn sâu bọ [89], [90]. Ngoài ra, hệ chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác.

Phân loại chitinase Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm 1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; http://www.org/GH18_structure. Chitinase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ chitinase được xếp thành các nhóm khác nhau. Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất, chitinase được chia thành 2 dạng: dạng 1 là endochitinase (EC.14), dạng 2 là exochitinase gồm 2 loại là chitobiosidase (EC.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.

e 8 Endochitinase thủy phân điểm cắt bên trong của phân tử chitin và chitodextrin tạo ra các phân tử có khối lượng thấp như chitotriose, chitotetraose và diacetyl chitobiose. Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu không khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose. N-acetylglucosaminidase phân cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine [106]. Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào 3 họ là glycosyl hydrolase 18, 19 và 20 [52].

Họ glycosyl hydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các chitinase này hoạt động thông qua các cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm β-anomer. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 rất nhạy cảm với chất ức chế mạnh allosamidin [73].

Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens. Họ glycosyl hydrolase 19 có hơn 130 chi, chủ yếu ở thực vật (như cà chua, cải, đậu Hà lan); xạ khuẩn Streptomyces griceus và một số vi khuẩn (Haemophillus influenzae). Họ glycosyl hydrolase 19 có cấu trúc giống với lysozyme và chitosanase, chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế dịch chuyển. Chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 19 từ vật bậc cao thì không bị ức chế bởi allosamidin [73].

Họ glycosyl hydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người. Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là nhóm I, II, III, IV và V. Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan e 9 trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác.