Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nấm Lecanicillium lecanii Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Chi nấm Lecanicillium gồm nhiều loài như: Lecanicillium lecanii, L. lecanii trước đây được gọi là Verticillium lecanii.
lecanii được biết là một hình thức sinh sản vô tính trong nhóm trùng thảo Cordyceps confragosa [124]. Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [22], [47], [49], [60], [93]. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám vào cơ thể côn trùng, các bào tử nảy mầm và tạo thành sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể, tại đây chúng sinh trưởng và phá hủy mô.
Sau đó, sợi nấm sẽ phát triển xuyên qua các lớp biểu bì của côn trùng. Trong điều kiện độ ẩm cao, bào tử được tạo thành bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [95]. Dựa vào đặc tính diệt côn trùng của nấm L. lecanii, các nghiên cứu hiện nay đi theo hai hướng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học của chế phẩm bào tử nấm L.
lecanii sử dụng trong kiểm soát côn trùng; và tìm hiểu vai trò của hệ enzyme (chitinase, protease, lipase) hoặc độc tố do nấm L. lecanii sinh ra trong quá trình diệt côn trùng. Các nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium đã được các tác giả nghiên cứu theo các hướng chính là (i) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase; (ii) tinh sạch và xác định khả năng thủy phân lớp vỏ trứng của côn trùng và (iii) nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất thấp.
Mặt khác, chủng nấm L. lecanii nói riêng và các vi sinh vật nói chung thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi ở các e 5 điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh ra từ các chủng nấm là khác nhau. Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ bước lựa chọn điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii trong nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của chitinase và chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng là hướng nghiên cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học.
Chitinase Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được chia thành 2 loại chính là endochitinase (EC 3. Exochitinase gồm chitobiosidase (EC 3.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3. Mỗi loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine.
Cơ chất thủy phân của chitinase thường là chitin. Chitin là một polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn hồi được tạo nên từ các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết 1,4-β glycoside. Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose. Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là α, β và γ-chitin.
Trong đó, dạng α-chitin có cấu trúc đối song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen kẽ nhau và là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên. α-chitin là thành phần cấu tạo nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách tế bào của nấm. Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen kẽ nhau và tồn tại ở dạng liên kết với protein. Dạng γ-chitin được tạo nên từ 2 chuỗi song song xen kẽ với 1 chuỗi đối song song.
Dạng γ-chitin thường tồn tại ở các loài nấm [57]. e 6 Chitin nguyên bản thường có màu trắng đục, mềm dẻo, đàn hồi và khá dai nên khó bị thủy phân. Trong động vật chân đốt, chitin được sửa đổi và liên kết với protein giống như một ma trận và tạo thành bộ xương ngoài. Ở dạng tinh khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu tạo ở hầu hết các động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp.
Trong vỏ giáp xác và động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi cacbonat tạo thành hỗn hợp bền vững hơn. Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đặc hơn so với dạng tinh khiết, đồng thời bền vững và ít giòn hơn so với canxi cacbonat [27]. Nguồn gốc của chitinase Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự nhiên như thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật.
Chitinase được sinh ra từ vi sinh vật gồm 2 loại là endochitinase và exochitinase. Nấm mốc là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh nhất. Các loài nấm mốc thuộc các chi như Trichoderma [32], [37]; Glicocladium; Metharhizium [61], [128]; Beauveria, Lecanicillium [23], [42], [91]; Aspergillus [145]; Penicillium [80] đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh. Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng được xem là đối tượng có khả năng sinh chitinase khá phong phú.
Chitinase được sinh ra từ vi khuẩn thuộc các chi như Serratia [148], Aeromonas [139], Arthrobacter [100], Micrococcus [19], Clostridium, Bacillus [24], [137] và đặc biệt là nhóm Streptomycetes [72], [144]. Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự nhiên. Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin và các hợp chất khác (manan, glucan, cellulose). Tuy nhiên, cấu trúc chitin này so với chitin trong tự nhiên có sự khác nhau về tính không tan, kích thước, độ nhớt, độ phức tạp phân tử và tính không đồng nhất nên không bị thủy phân bởi chitinase của cơ thể.
e 7 Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài như khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan. Chitinase được sinh ra trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trò tham gia vào quá trình hình thành và phát triển phôi. Chitinase trong cây được sinh ra khi có sự kích thích của mầm bệnh giúp cây chống lại sự tấn công của các nấm kí sinh gây bệnh. Ở thực vật, chitinase chủ yếu thuộc loại endochitinase và có kích thước nhỏ hơn so với các nhóm khác.
Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như ruột khoang, giun tròn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của các loài chim, thú ăn sâu bọ [89], [90]. Ngoài ra, hệ chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác.
Phân loại chitinase Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm 1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; http://www.org/GH18_structure. Chitinase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ chitinase được xếp thành các nhóm khác nhau. Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất, chitinase được chia thành 2 dạng: dạng 1 là endochitinase (EC.14), dạng 2 là exochitinase gồm 2 loại là chitobiosidase (EC.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.
e 8 Endochitinase thủy phân điểm cắt bên trong của phân tử chitin và chitodextrin tạo ra các phân tử có khối lượng thấp như chitotriose, chitotetraose và diacetyl chitobiose. Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu không khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose. N-acetylglucosaminidase phân cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine [106]. Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào 3 họ là glycosyl hydrolase 18, 19 và 20 [52].
Họ glycosyl hydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các chitinase này hoạt động thông qua các cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm β-anomer. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 rất nhạy cảm với chất ức chế mạnh allosamidin [73].
Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens. Họ glycosyl hydrolase 19 có hơn 130 chi, chủ yếu ở thực vật (như cà chua, cải, đậu Hà lan); xạ khuẩn Streptomyces griceus và một số vi khuẩn (Haemophillus influenzae). Họ glycosyl hydrolase 19 có cấu trúc giống với lysozyme và chitosanase, chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế dịch chuyển. Chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 19 từ vật bậc cao thì không bị ức chế bởi allosamidin [73].
Họ glycosyl hydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người. Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là nhóm I, II, III, IV và V. Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan e 9 trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác.