ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO NGHIỆM THU TÊN ĐỀ TÀI Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (Plateletderived growth factor – PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường TÊN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS. Đặng Thị Phương Thảo THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chính sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu) TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (Plateletderived growth factor-PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường Mã số đề tài: 219/2013/HĐĐH-SKHCN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016 MỤC LỤC TÓM TẮT DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH Bảng tóm tắt các nội dung công việc đã đăng ký và kết quả đạt được……. Báo cáo thống kê kết quả thực nghiệm của đề tài…………………. Tổng quan tài liệu………………………………………………………….1 Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu- Platelet-derived growth factor (PDGF) 1.
Thụ thể của PDGF (PDGFR)………………. Con đường tác động của PDGF……………. Con đường PI3K/Akt (Phosphatidylinositol-3-Kinase/ Protein kinase B)………………………. Con đường RAS-MAPK………………….
Chức năng in vivo của PDGF……………………. Quá trình lành hóa vết thương……………. Hoạt động của hệ thống mạch máu………. Sự hình thành và phát triển phôi…….
Tiềm năng ứng dụng và tình hình nghiên cứu rhPDGF-BB……. Tiềm năng ứng dụng…………………………………. Tình hình nghiên cứu………………………………. Thử nghiệm sinh học PDGF in vitro………………….
Thử nghiệm hoạt tính sinh học……………. Thử nghiệm sinh học in vitro………. Các yếu tố ảnh hưởng đến thử ngiệm sinh học tăng sinh……. Hệ thống biểu hiện P.5 Thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp……………….
Các phương pháp thu nhận protein……………. Phương pháp sử dụng amicon………………. Phương pháp tủa protein bằng ammonium sulfate…. Phương pháp lọc tiếp tuyến……………………….
Tinh chế protein tái tổ hợp……………………. Giới thiệu chung…………………………. Các phương pháp sắc ký dung trong tinh chế protein tái tổ hợp………………………………………………………………………………. Các yếu tố cần khảo sát để tối ưu hóa quy trình tinh chế….
Các phương pháp tinh chế hPDGF đã được nghiên cứu và ứng dụng…. Tình hình nghiên cứu sản xuất rhPDGF-BB ở VN……. Kết quả và thảo luận Nội dung 1: Tạo dòng tế bào nấm men P. pastoris mang và biển hiện gene pdgf.
Vật liệu – Phương pháp………………. Hóa chất và môi trường… ……………………. Phương pháp. Kết quả - Biện luận.
Tạo dòng plasmid mang và biểu hiện gene hpdgf trong Pichia pastoris. Cấu trúc chủng nấm men P. Pastoris X33 biểu hiện protein PDGF. Kiểm tra kiểu hình và kiểu gen của các thể biến nạp.
Xác định số bản sao của gen pdgf trong bộ gen của P. pastoris bằng phương pháp PCR bán định lượng…………………………………. Đánh giá khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp. Kiểm tra khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến nạp67 2.71 Nội dung 2: Nghiên cứu thu nhận hPDGF tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp……………………….
Phương pháp…………………………. Kết quả - Biện luận…………………………………………. Kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng P. Khảo sát các điều kiện biểu hiện hPDGF-BB…….3 Khảo sát quy trình thu nhận rhPDGF-BB bằng phương pháp tủa ammonium sulfate (NH4)2SO4 và lọc tiếp tuyến…………….97 Nội dung 3: Nghiên cứu tinh sạch protein hPDGF tái tổ hợp………….
Phương pháp………………………………………………. Khảo sát quy trình tinh chế rhPDGF-BB bằng sắc kí trao đổi cation và sắc kí kị nước…………………………………………………. Khảo sát một số yếu tố trong quy trình tinh chế rhPDGF- BB bằng sắc kí trao đổi cation……………………………………………………100 4. Kết quả, Biện luận………………………………….
Bước đầu khảo sát quy trình tinh chế rhPDGF-BB bằng sắc kí trao đổi cation và sắc kí kị nước………………………………………. Khảo sát điều kiện bám cột và li giải trong sắc kí trao đổi cation106 4.……118 Nội dung 4: Kiểm tra hoạt tính sinh học của protein PDGF tái tổ hợp…. Nguyên vật liệu, phương pháp……………………………. Kết quả, thảo luận ……………………………………….
Khảo sát ảnh hưởng của bước đồng bộ hoá lên đáp ứng của tế bào khi kích thích bằng rhPDGF-BB ……………. Khảo sát và tối ưu hóa các thông số cho quy trình định tính hoạt tính của rhPDGF-BB in vitro………………………………………. Khảo sát tối ưu và đánh giá hiệu quả của quy trình định lượng hoạt tính rhPDGF-BB……………………………………………………. Ứng dụng quy trình định tính và định lượng rhPDGF- BB in vitro đã xây dựng được vào đánh giá hoạt tính rhPDGF-BB được sản xuất tại phòng thí nghiệm…………………………….……,,,152 Nội dung 5: Xây dựng tiêu chuẩn cho protein PDGF tái tổ hợp theo qui định của dược điển……………………………………….
Cơ sở để xây dựng bộ tiêu chuẩn đánh giá sản phẩm hPDGF-BB tái tổ hợp………………………………………………………………………………. Bộ tiêu chuẩn đánh giá sản phẩm hPDGF-BB và các kết quả kiểm định sản phẩm PDGF của đề tài……………………………………. Bước đầu thử ứng dụng protein PDGF tái tổ hợp để chữa trị vết thương trên mô hìnhchuột đái tháo đường……………………………. Phương pháp…160 7.
Xây dựng tiêu chí đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe chuột…160 7. Khảo sát quy trình cảm ứng bằng streptozotocin tạo mô hình chuột đái tháo đường…. Đánh giá mô hình chuột đái tháo đường mang vết thương ngoài da…. Thử ứng dụng điều trị tăng cường làm lành vết thương trên mô hình chuột đái tháo đường của rhPDGF-BB….165 Sản phẩm của đề tài…………………………………………………….168 Kết luận và đề nghị……………………………………………………….……169 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ ATCC American Type Culture Collection CS Calf serum CV Coefficient of variation CV Column Volume DMEM/F12 Dulbecco’s modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 DMSO Dimethyl sulfoxide ĐTĐ Đái tháo đường FBS Fetal bovine serum FPLC Fast Protein Liquid Chromatography IS International Standard LMW Low Molecular Weight LOD Limit of detection LOQ Limit of quantification MAPK Mitogen-activated protein kinase MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide Native-PAGE Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis NP-HPLC Normal-Phase High-performance Liquid Chromatography OD Optical Density PBS Phosphate buffer saline PDGF Platelet-derived growth factor PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase rhPDGF Recombinant human platelet-derived growth factor rhPDGF-BB Recombinant human platelet-derived growth factor-BB RP-HPLC Reverse-Phase High-performance Liquid Chromatography RS Reference Standard SD Standard deviation SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis STZ Streptozotocin TEMED Tetramethylethylenediamine TFA Trifluoroacetic acid TGF-β Transforming Growth Factor beta TNF-α Tumor Necrosis Factors alpha UV Ultraviolet VEGF Vascular endothelial growth factor v/v volume/volume w/v weight/weight DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 2.1 Kết quả hiệu suất biến nạp 59 2.2 Thống kê kiểu hình sử dụng methanol của 20 thể biến nạp 62 2.3 Số lượng bản sao của pPICZα/pdgf trong bộ gen của 20 thể biến 65 nạp 3.1 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của hPDGF-BB khi tủa ở các 92 nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa khác nhau 3.2 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB sau khi lọc tiếp tuyến ở các tốc độ 95 lọc khác nhau 4.1 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB sau tinh chế trên cột SP FF 5ml 104 bằng phương pháp dung li theo dạng gradient 4.2 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB sau tinh chế trên cột Phenyl 105 Sepharose 5ml bằng phương pháp dung li theo dạng gradient 4.3 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB trên cột SP FF 5ml với các đệm cân 109 bằng: A1, A2, A3 và A4 4.4 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB trên cột SP FF 5ml với đệm cân 112 bằng: A5, A1 và A6 4.5 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB trên cột SP FF 5ml với đệm li giải: 115 B1 và B3 5.1 Bốn nhóm quy trình thử nghiệm được áp dụng trong khảo sát ảnh 126 hưởng bước đồng bộ hoá tế bào lên đáp ứng của tế bào khi kích thích với rhPDGF-BB 5.2 Thiết kế 18 nghiệm thức cho khảo sát ma trận ba yếu tố: nồng độ 130 FBS trong môi trường thử nghiệm, thời gian xử lý rhPDGF-BB và mật độ tế bào đầu vào 5.3 Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 khi được xử lý với 136 rhPDGF-BB so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) ở bố n quy triǹ h khảo sát ảnh hưởng của bước đồ ng hoá tế bào 5.4 Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 được xử lý với rhPDGF- 140 BB so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) của quy trình ở các môi trường thử nghiê ̣m chứa nồ ng đô ̣ FBS khác nhau.5 Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 khi được xử lý rhPDGF- 142 BB so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) của quy trình khi sử dụng mật độ tế bào đầu vào khác nhau.6 Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 so với chứng âm và đô ̣ ổ n 143 định (%CV) của quy trình khi xử lý tế bào với rhPDGF-BB ở thời gian khác nhau 5.7 Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 so với chứng âm và đô ̣ ổ n 146 định (%CV) của quy trình ở các cách kết hợp khác nhau của thông số mật độ tế bào đầu vào và thời gian ủ rhPDGF-BB trong môi trường thử nghiệm chứa 0,5%FBS 5.8 Giá trị độ nghiêng của đường cong đáp ứng ở hai bộ thông số sử 147 dụng mật độ tế bào đầu vào là 5x103 và 104 tế bào/giếng 5.9 Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 so với chứng âm và đô ̣ ổ n 149 định (%CV) của quy trình khi cho tế bào đáp ứng với các mẫu rhPDGF-BB khác nhau.1 Phiếu đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe chuột 161 7.2 Tổng hợp số liệu đánh giá của các thành viên về màu da, tình 162 trạng long và khả năng di chuyển của chuột 7.3 Đánh giá tình trạng vết thương điều trị với phân đoạn nước và 166 cao phối trộn DANH SÁCH HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.
Bốn loại đơn phân PDGF và các domain của chúng 10 1. Cấu trúc nhị phân của PDGFR 11 1.3 Sự tương tác chuyên biệt của năm dạng đồng phân nhị phân 12 PDGF với ba dạng đồng phân nhị phân của PDGFR 1.4 Sự hoạt hoá con đường PI3K/ Akt bởi thụ thể tyrosine 14 1.5 Các tín hiệu được hoạt hoá bởi PKB/Akt và các hoạt động của 14 tế bào được điều hoà bởi PKB/ 1.6 Con đường Ras/MAPK được hoạt hoá bởi RTK 16 1.7 Các giai đoạn của quá trình lành hoá vết thương 18 1.8 Nguyên tắc chung của thử nghiệm sinh học in vitro 23 1.9 Nguyên tắc của các phương pháp tinh sạch protein 30 2.1 Các thang phân tử lượng 44 2.2 Kết quả xử lý pPICZαA/pdgf với SacI 58 2.3 Kết quả biến nạp pPICZαA/pdgf vào P.4 Kết quả kiểm tra kiểu hình thể biến nạp 61 2.5 Kết quả kiểm tra kiểu gen của thể biến nạp 62 2.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR với lượng DNA bộ gen khác 64 nhau 2.7 Đường chuẩn bộ gen X33 ứng với lượng DNA bộ gen khác 64 nhau 2.7A Vị trí mồi AOX1 trên bộ gene Mut+ và các sản phẩm PCR dự 65 kiến 2.7B Kết quả điện di xác định số lượng bản sao của các thể biến nạp 66 2.8 Số lượng bản sao của pPICZα/pdgf trong bộ gen của 20 thể 66 biến nạp 2.9 Đường cong tăng trưởng của X33 hoang dại, X33 chứa 67 pPICZα và các thể biến nạp 2.10 Kết quả điện di SDS-PAGE 68 2.