Luận văn thạc sĩ hus ứng dụng phương pháp realtime pcr trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại bệnh viện bạch mai năm 2016

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus ứng dụng phương pháp realtime pcr trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại bệnh viện bạch, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Tô Đức Linh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hội
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Ứng dụng phương pháp Realtime PCR trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Dịch tễ học bệnh sốt mò
• 1.2. tsutsugamushi – tác nhân gây bệnh sốt mò
• 1.3. Mò Leptotrobidium - ổ bệnh và trung gian truyền bệnh
• 1.4. tsutsugamushi ở động vật
• 1.5. Tình hình sốt mò trên thế giới
• 1.6. Tình hình sốt mò ở Việt Nam
• 1.7. Sinh bệnh học sốt mò
• 1.8. Sự xâm nhập và nhân lên của O. tsutsugamushi trong tế bào vật chủ
• 1.9. Tính nhạy cảm của cơ thể vật chủ với nhiễm O.
• 1.10. Đáp ứng miễn dịch trong sốt mò
• 1.11. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán bệnh sốt mò
• 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Chủng vi khuẩn nghiên cứu
• 2.4. Mẫu bệnh phẩm
• 2.5. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC)
• 2.6.2. Tách chiết DNA tổng số
• 2.6.3. Thiết kế cặp mồi và probe
• 2.6.4. Thành phần phản ứng (Master mix)
• 2.6.5. Tối ƣu chu kỳ nhiệt của phản ứng Realtime – PCR
• 2.6.6. Nhận định và phân tích kết quả
• 2.6.7. Phƣơng pháp xác đinh độ đặc hiệu phản ứng
• 2.6.8. Phƣơng pháp xác đinh độ nhạy của phản ứng
• 2.6.9. Đạo đức nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Quy trình tối ƣu phản ứng Realtime – PCR
• 3.2. Thiết kế mồi
• 3.3. Tối ƣu nhiệt độ gắn Taqman probe
• 3.4. Kết quả tối ƣu nồng độ magie của phản ứng Realtime-PCR
• 3.5. Xây dựng quy trình chẩn đoán O. tsutsugamushi bằng Realtime – PCR
• 3.6. Tách chiết DNA
• 3.7. Ứng dụng phản ứng Realtime PCR chẩn đoán O.
• 3.8. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR
• 3.9. Đánh giá độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
• 3.10. Một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nghi mắc bệnh sốt mò
• 3.11. Kết quả khảo sát các yếu tố liên quan đến nhiễm O. tsutsugamushi ở các bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016
• 3.12. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi về tuổi
• 3.13. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi theo giới tính
• 3.14. Phân bố nhiễm bệnh theo nhóm nghề nghiệp
• 3.15. Phân bố nhiễm bệnh theo vùng miền, địa phƣơng
• 3.16. Phân bố nhiễm bệnh theo các khoảng thời gian trong năm 2016
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về ứng dụng Realtime PCR trong bệnh sốt mò

Phương pháp Realtime PCR đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc chẩn đoán và đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại các cơ sở y tế. Bệnh sốt mò, do vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây ra, là một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới. Việc áp dụng Realtime PCR giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc điều trị kịp thời.

1.1. Đặc điểm của bệnh sốt mò và tác nhân gây bệnh

Bệnh sốt mò là một bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây ra. Vi khuẩn này thường lây truyền qua vết đốt của các loài mò. Triệu chứng của bệnh rất đa dạng, từ sốt cao, phát ban đến các triệu chứng nghiêm trọng khác. Việc nhận diện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh là rất quan trọng để điều trị hiệu quả.

1.2. Lợi ích của phương pháp Realtime PCR trong chẩn đoán

Phương pháp Realtime PCR cho phép phát hiện vi khuẩn gây bệnh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, từ đó nâng cao khả năng điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Ngoài ra, Realtime PCR còn giúp xác định tỉ lệ nhiễm bệnh trong cộng đồng, từ đó hỗ trợ các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai

Mặc dù phương pháp Realtime PCR mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc áp dụng tại Bệnh viện Bạch Mai. Các vấn đề như thiếu thiết bị hiện đại, nhân lực chưa được đào tạo đầy đủ và sự phức tạp trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm có thể ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán.

2.1. Thiếu hụt thiết bị và công nghệ

Việc thiếu hụt thiết bị hiện đại có thể làm giảm hiệu quả của phương pháp Realtime PCR. Các máy móc cần thiết cho việc thực hiện xét nghiệm này thường đòi hỏi chi phí đầu tư lớn và bảo trì thường xuyên.

2.2. Đào tạo nhân lực và quy trình thu thập mẫu

Đào tạo nhân lực là một yếu tố quan trọng để đảm bảo quy trình xét nghiệm diễn ra suôn sẻ. Nhân viên y tế cần được trang bị kiến thức và kỹ năng cần thiết để thực hiện các bước trong quy trình Realtime PCR một cách chính xác.

III. Phương pháp Realtime PCR trong nghiên cứu tỉ lệ bệnh sốt mò

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp Realtime PCR tại Bệnh viện Bạch Mai đã chỉ ra rằng kỹ thuật này có thể xác định tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi một cách hiệu quả. Nghiên cứu được thực hiện trên nhiều mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh sốt mò, cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong một tỷ lệ đáng kể.

3.1. Quy trình thực hiện Realtime PCR

Quy trình thực hiện Realtime PCR bao gồm các bước như tách chiết DNA, thiết kế mồi và probe, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Kết quả nghiên cứu và phân tích

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi tại Bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016 là khá cao. Các yếu tố dịch tễ học liên quan cũng được phân tích, giúp hiểu rõ hơn về sự lây lan của bệnh trong cộng đồng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Realtime PCR trong điều trị bệnh sốt mò

Việc áp dụng Realtime PCR không chỉ giúp chẩn đoán bệnh mà còn hỗ trợ trong việc điều trị. Nhờ vào khả năng phát hiện nhanh chóng, bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị kịp thời, giảm thiểu biến chứng và nguy cơ tử vong cho bệnh nhân.

4.1. Tác động của chẩn đoán sớm đến điều trị

Chẩn đoán sớm giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị. Việc phát hiện kịp thời O. tsutsugamushi giúp giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng.

4.2. Kinh nghiệm từ các ca bệnh thực tế

Nhiều ca bệnh đã được điều trị thành công nhờ vào việc áp dụng Realtime PCR trong chẩn đoán. Các bác sĩ đã có thể theo dõi tình trạng bệnh nhân và điều chỉnh phác đồ điều trị một cách linh hoạt.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp Realtime PCR trong đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai đã mở ra nhiều triển vọng cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Tương lai, cần tiếp tục đầu tư vào công nghệ và đào tạo nhân lực để nâng cao hiệu quả của phương pháp này.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện quy trình xét nghiệm và mở rộng quy mô nghiên cứu để có cái nhìn tổng quát hơn về tình hình bệnh sốt mò tại Việt Nam.

5.2. Định hướng phát triển công nghệ chẩn đoán

Cần phát triển thêm các công nghệ chẩn đoán mới, kết hợp với Realtime PCR để nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện bệnh sốt mò.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt mò (Scrub typhus) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính,bệnh truyền qua côn trùng, tiết túc do vi khuẩn ký sinh nội bào Orientia tsutsugamushi (trƣớc kia gọi là Ricketsia orientalis hoặc Ricketsia tsutsugamushi) gây nên. Đây là bệnh sốt cấp tính lƣu hành và gây dịch ở nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Ƣớc tính có khoảng 1 tỷ ngƣời có nguy cơ bị mắc bệnh và khoảng 1 triệu ca bệnh mỗi năm [32,44]. Trong những năm gần đây, sốt mò đƣợc phát hiện và tái phát hiện ở nhiều nƣớc trong vùng dịch tễ nhƣ: Lào, Ấn Độ, Sri Lanka, Maldives.

Sốt mò là bệnh của động vật, chủ yếu là các động vật gặm nhấm và các động vật có xƣơng sống nhỏ khác thuộc lớp thú. Ổ bệnh và trung gian truyền bệnh là mò Leptotrumbidium, một loài chân đốt thuộc họ ve bét. tsutsugamushi truyền vi khuẩn cho đời sau qua trứng và qua các giai đoạn phát triển. Ấu trùng mò nhiễm O.

tsutsugamushitruyền mầm bệnh cho động vật và ngƣời khi đốt[36,37,49]. Sốt mò ở ngƣời có các biểu hiện lâm sàng đa dạng, rất giống với nhiều bệnh truyền nhiễm cấp tính khác. Các ca bệnh điển hình có vết đố t đặc hiệu ngoài da có giá trị chẩn đoán nhƣng chỉ có ở một số bệnh nhân, không đại diện đầy đủ cho phổ bệnh thực sự của sốt mò và đôi khi không đƣợc phát hiện. Bệnh có thể tiến triển nặng và gây tử vong nếu không đƣợc chẩn đoán sớm, đúng và điều trị đặc hiệu [52].

Các xét nghiệm chẩn đoán xác định bệnh sốt mò có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định ca bệnh trên lâm sàng, định hƣớng điều trị sớm và điều trị đặc hiệu nhằm giảm thiểu biến chứng và nguy cơ tử vong cho ngƣời bệnh.Tuy nhiên, viê ̣c phát hiê ̣n ra bệnh sốt mò rất khó nếu không có phƣơng pháp chẩn đoán phù hợp. Trƣớc khi có phƣơng pháp chẩn đoán hiện đại, việc chẩn đoán phụ thuộc rất nhiều vào trình độ của bác sĩ cũng nhƣ sự xuất hiện của vectơ truyền bệnh hay vết đốt. Nhiều ngƣời bệnh có triệu chứng không điển hình, sốt kéo dài làm cho chẩn đoán bị nhầm lẫn. Nếu đƣợc chẩn đoán đúng thì việc điều trị rất đơn giản.

Do đó, chẩn đoán bệnh bằng các xét nghiệm chính xác và kịp thời sẽ hỗ trợ rất nhiều cho các bác sĩ trong việc điều trị bệnh ricketssia. Ngày nay trên thế giới, có ba phƣơng 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 pháp chính đƣợc sử dụng để chẩn đoán bệnh sốt mò, đó là: phƣơng pháp nuôi cấy, phƣơng pháp miễn dịch và phƣơng pháp sinh học phân tử. Tuy nhiên, phƣơng pháp nuôi cấy không thể thực hiện đƣợc ở các cơ sở khám chữa bệnh do yêu cầu về phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp ba, do tínhphức tạp và tốn nhiều thời gian. Phƣơng pháp miễn dịch đòi hỏi phải có hai mẫu huyết thanh của ngƣời bệnh ở hai thời điểm khác nhau, một mẫu trong giai đoạn cấp tính, một mẫu trong giai đoạn hồi phục.Điề u này gây khó khăn cho việc lấy mẫu, phát hiện và chữa trị bệnh kịp thời.

Do đó, áp dụng phƣơng pháp PCR trong chẩn đoán bệnh sốt mò là công cụ hữu ích nhất hiện nay trong các bệnh viện và cơ sở y tế tại Việt Nam. Đây cũng là phƣơng pháp giúp cải thiện đƣợc các hạn chế của hai phƣơng pháp trƣớc, tiết kiệm thời gian và trả kết quả nhanh nhất, kịp thời cho công tác chẩn đoán và chữa bệnh. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME PCR TRONG ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TỈ LỆ BỆNH SỐT MÒ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2016” với các mục tiêu nghiên cứu nhƣ sau: 1. Xây dựng đƣợc quy trình tối ƣu để xác định tình trạng nhiễm O.

tsutsugamushi gây bệnh sốt mò bằng kĩ thuật Realtime PCR. Xác định đƣợc tỉ lệ bệnh nhân nhiễm O. tsutsugamushi tại bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016 và một số yếu tố dịch tễ học có liên quan. Đề tài nghiên cứu này đƣợc thực hiện với các nội dung sau: Xây dựng quy trình tối ƣu để xác định tình trạng nhiễm O.

tsutsugamushi gây bệnh sốt mò bằng kĩ thuật Realtime PCR bao gồm các bƣớc: Thiết kế mồi, tối ƣu nhiệt độ gắn Taqman probe, Tối ƣu nồng độ Mg2+ của phản ứng Realtime PCR, tách chiết DNA, tiến hành phản ứng Realtime PCR, đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 Ứng dụng phƣơng pháp Realtime PCR để xác định tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016 và điều tra một số yếu tố dịch tễ học có liên quan. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sốt mò đƣợc biết đến từ rất sớm. Những mô tả đầu tiên về một bệnh nhân có triệu chứng tƣơng tự sốt mò đƣợc tìm thấy tại Trung Quốc vào thế kỉ thứ IV sau công nguyên; bệnh đƣợc cho là có liên quan đến một loại côn trùng màu đỏ. Tại Nhật Bản, bệnh đƣợc Hashimoto mô tả lần đầu tiên vào năm 1810 nhƣng đến năm 1878 mới đƣợc biết đến rộng rãi qua thông báo của bác sỹ Theodor Palm với tên địa phƣơng là “shima mushi”. Vai trò lây truyền bệnh của ấu trùng mò Leptotrobidium đƣợc Brumpt đề cập đến lần đầu tiên vào năm 1910.

Bản chất của vi khuẩn gây sốt mò đƣợc xác định vào cuối những năm 1920. Dịch tễ học bệnh sốt mò 1. tsutsugamushi – tác nhân gây bệnh sốt mò 1. Đặc điểm của vi khuẩn O.

tsutsugamushi Vi khuẩn gây bệnh sốt mò – O. tsutsugamushi có kích thƣớc 0,5 – 0,8µm x 1,2 – 3,0µm, là vi khuẩn Gram âm, kí sinh nội bào. Mỗi tế bào vi khuẩn đƣợc bao bọc bởi một lớp thành tế bào rất mềm và một lớp màng tế bào. Vỏ vi khuẩn không chứa các peptidoglycan và lipopolysaccaride, lá ngoài của thành tế bào dày hơn đáng kể so với lá trong.

tsutsugamushi bắt màu Giemsa, mọc trong túi thể vàng của phôi gà hoặc một loạt các dòng tế bào nuôi cấy. tsutsugamushi xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua cơ chế thực bào, đi vào nguyên sinh chất và phát triển chủ yếu ở vùng cận nhân tế bào. Vi khuẩn đƣợc giải phóng ra khỏi tế bào vật chủ bằng phƣơng pháp nẩy chồi và đƣợc bao bọc bởi một lớp màng của tế bào vật chủ tƣơng tự nhƣ những virus có vỏ. tsutsugamushi nhân lên bằng phƣơng pháp chia đôi, chu kì nhân bản kéo dài khoảng 9 – 18 giờ [47].

Trƣớc năm 1995, Ricketsia tsutsugamushi(nay gọi là O. tsutsugamushi) đƣợc xếp ở trong giống Ricketsia, là loài duy nhất trong giống sốt mò. Tuy nhiên, những nghiên cứu về cấu trúc và di truyền học cho thấy sự khác biệt lớn giữa Ricketsia 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 tsutsugamushi và các Ricketsia khác. Cấu trúc thành tế bào của O.

tsutsugamushi có lá ngoài dày hơn lá trong, không chứa peptidoglycan và lipopolysaccaride; O. tsutsugamushi đề kháng cao tự nhiên với Penicillin. Khi phân tích trình tự gen 16S rARN, khoảng khác biệt giữa R.tsutsugamushi và các vi khuẩn khác trong giống Ricketsia gần bằng với khoảng khác biệt tiến hóa giữa các giống trong họ Ricketsiale. Vì những lí do này, R.tsutsugamushi đƣợc tách ra thành một giống riêng, mang tên O.

Tính đa dạng của các chủng O. tsutsugamushi Tất cả các chủng vi khuẩn sốt mò có cấu trúc kháng nguyên rất khác nhau và độc tính với chuột cũng rất khác nhau [47]. Sự khác biệt về mặt kháng nguyên đƣợc xác định chủ yếu qua cấu trúc của các protein vỏ, và có thể đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp huyết thanh học và kĩ thuật sinh học phân tử [26]. tsutsugamushi cổ điển là: Karp, Kato và Gilliam; ngoài ba chủng này còn có hơn ba mƣơi chủng huyết thanh khác đƣợc xác định tại các nƣớc khác nhau và các địa phƣơng khác nhau tại vùng dịch tễ.

Một vùng địa lý có thể có nhiều chủng O. tsutsugamushi cùng tồn tại. Tính đa dạng này có vai trò quan trọng trong dịch tễ học của sốt mò tại địa phƣơng. Mò Leptotrobidium - ổ bệnh và trung gian truyền bệnh 1.

Một số đặc điểm sinh học của mò Leptotrobidium Mò Leptotrobidiumlà một chi động vật trong họ ve mò(Trombiculidae), lớp Nhện (arachnida), ngành chân đốt (arthropoda). Mò có kích thƣớc bé, không quá 1mm, màu sắc từ vàng đến da cam nên còn gọi là mò đỏ[3]. Vòng đời của mò bao gồm bốn giai đoạn phát triển: trứng, ấu trùng, nymph và giai đoạn trƣởng thành[37]. Mò trƣởng thành sống trong đất xốp và ẩm.

Mò cái đẻ trứng trên các lớp đất bề mặt. Âú trùng nở ra từ trứng bò lên cây cỏ hoặc tàn cây, một số nấp trong các khe nứt hoặc trần hang chuột để chờ bám vào động vật và đốt. Sau khi đốt động vật, ấu trùng quay trở lại mặt đất trải qua các giai đoạn phát triển tiếp theo và phát triển đến giai đoạn trƣởng thành, sẵn sàng sản sinh ra thế hệ mò sau. Thời gian sống của mò 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 trƣởng thành có thể kéo dài 15 tháng hoặc lâu hơn.

Chu kì sinh trƣởng của mò kéo dài 2 – 3 tháng ở những vùng có khí hậu ấm và có thể kéo dài hơn 8 tháng ở những vùng có khí hậu lạnh[37,39]. Ấu trùng là giai đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở các động vật có xƣơng sống, chủ yếu là chuột và các thú nhỏ khác trong lớp gặm nhấm, có thể đốt ngƣời. Thời gian đốt động vật của ấu trùng mò kéo dài 48 – 72 giờ (có thể kéo dài đến 12 ngày ở một số loài). Ấu trùng mò chƣa đốt động vật có thể sống đến 30 ngày và có tầm di chuyển rất hạn chế.

Khi đốt động vật chúng thƣờng tập trung thành từng đám vài trăm cá thể ở những nơi rất hẹp nhƣ tai và vùng hậu môn – sinh dục của động vật, có thể bị gãi văng ra hoặc rời vật chủ gần nhƣ cùng một lúc. Những yếu tố này góp phần hình thành các “đảo mò” hay các “điểm nóng” lây truyền sốt mò đƣợc mô tả trong các nghiên cứu dịch tễ học của bệnh [37, 39]. Phân bố của mò Leptotrombidium Những loài mò đƣợc xác định là ổ bệnh và trung gian truyền bệnh sốt mò bao gồm: L.arenicula và 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 một số loài khác.akamushi là vector lây truyền sốt mò mùa hè ở các vùng dịch truyền thống của Nhật Bản nhƣ: Niigata, Yamagata và Akita [30].