Luận văn thạc sĩ hus ứng dụng phương pháp realtime pcr trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại bệnh viện bạch mai năm 2016

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus ứng dụng phương pháp realtime pcr trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại bệnh viện bạch, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Tô Đức Linh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hội
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Ứng dụng phương pháp Realtime PCR trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Dịch tễ học bệnh sốt mò
• 1.2. tsutsugamushi – tác nhân gây bệnh sốt mò
• 1.3. Mò Leptotrobidium - ổ bệnh và trung gian truyền bệnh
• 1.4. tsutsugamushi ở động vật
• 1.5. Tình hình sốt mò trên thế giới
• 1.6. Tình hình sốt mò ở Việt Nam
• 1.7. Sinh bệnh học sốt mò
• 1.8. Sự xâm nhập và nhân lên của O. tsutsugamushi trong tế bào vật chủ
• 1.9. Tính nhạy cảm của cơ thể vật chủ với nhiễm O.
• 1.10. Đáp ứng miễn dịch trong sốt mò
• 1.11. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán bệnh sốt mò
• 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Chủng vi khuẩn nghiên cứu
• 2.4. Mẫu bệnh phẩm
• 2.5. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC)
• 2.6.2. Tách chiết DNA tổng số
• 2.6.3. Thiết kế cặp mồi và probe
• 2.6.4. Thành phần phản ứng (Master mix)
• 2.6.5. Tối ƣu chu kỳ nhiệt của phản ứng Realtime – PCR
• 2.6.6. Nhận định và phân tích kết quả
• 2.6.7. Phƣơng pháp xác đinh độ đặc hiệu phản ứng
• 2.6.8. Phƣơng pháp xác đinh độ nhạy của phản ứng
• 2.6.9. Đạo đức nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Quy trình tối ƣu phản ứng Realtime – PCR
• 3.2. Thiết kế mồi
• 3.3. Tối ƣu nhiệt độ gắn Taqman probe
• 3.4. Kết quả tối ƣu nồng độ magie của phản ứng Realtime-PCR
• 3.5. Xây dựng quy trình chẩn đoán O. tsutsugamushi bằng Realtime – PCR
• 3.6. Tách chiết DNA
• 3.7. Ứng dụng phản ứng Realtime PCR chẩn đoán O.
• 3.8. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR
• 3.9. Đánh giá độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
• 3.10. Một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nghi mắc bệnh sốt mò
• 3.11. Kết quả khảo sát các yếu tố liên quan đến nhiễm O. tsutsugamushi ở các bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016
• 3.12. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi về tuổi
• 3.13. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi theo giới tính
• 3.14. Phân bố nhiễm bệnh theo nhóm nghề nghiệp
• 3.15. Phân bố nhiễm bệnh theo vùng miền, địa phƣơng
• 3.16. Phân bố nhiễm bệnh theo các khoảng thời gian trong năm 2016
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về ứng dụng Realtime PCR trong bệnh sốt mò

Phương pháp Realtime PCR đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc chẩn đoán và đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại các cơ sở y tế. Bệnh sốt mò, do vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây ra, là một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới. Việc áp dụng Realtime PCR giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc điều trị kịp thời.

1.1. Đặc điểm của bệnh sốt mò và tác nhân gây bệnh

Bệnh sốt mò là một bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây ra. Vi khuẩn này thường lây truyền qua vết đốt của các loài mò. Triệu chứng của bệnh rất đa dạng, từ sốt cao, phát ban đến các triệu chứng nghiêm trọng khác. Việc nhận diện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh là rất quan trọng để điều trị hiệu quả.

1.2. Lợi ích của phương pháp Realtime PCR trong chẩn đoán

Phương pháp Realtime PCR cho phép phát hiện vi khuẩn gây bệnh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, từ đó nâng cao khả năng điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Ngoài ra, Realtime PCR còn giúp xác định tỉ lệ nhiễm bệnh trong cộng đồng, từ đó hỗ trợ các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai

Mặc dù phương pháp Realtime PCR mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc áp dụng tại Bệnh viện Bạch Mai. Các vấn đề như thiếu thiết bị hiện đại, nhân lực chưa được đào tạo đầy đủ và sự phức tạp trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm có thể ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán.

2.1. Thiếu hụt thiết bị và công nghệ

Việc thiếu hụt thiết bị hiện đại có thể làm giảm hiệu quả của phương pháp Realtime PCR. Các máy móc cần thiết cho việc thực hiện xét nghiệm này thường đòi hỏi chi phí đầu tư lớn và bảo trì thường xuyên.

2.2. Đào tạo nhân lực và quy trình thu thập mẫu

Đào tạo nhân lực là một yếu tố quan trọng để đảm bảo quy trình xét nghiệm diễn ra suôn sẻ. Nhân viên y tế cần được trang bị kiến thức và kỹ năng cần thiết để thực hiện các bước trong quy trình Realtime PCR một cách chính xác.

III. Phương pháp Realtime PCR trong nghiên cứu tỉ lệ bệnh sốt mò

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp Realtime PCR tại Bệnh viện Bạch Mai đã chỉ ra rằng kỹ thuật này có thể xác định tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi một cách hiệu quả. Nghiên cứu được thực hiện trên nhiều mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh sốt mò, cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong một tỷ lệ đáng kể.

3.1. Quy trình thực hiện Realtime PCR

Quy trình thực hiện Realtime PCR bao gồm các bước như tách chiết DNA, thiết kế mồi và probe, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Kết quả nghiên cứu và phân tích

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi tại Bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016 là khá cao. Các yếu tố dịch tễ học liên quan cũng được phân tích, giúp hiểu rõ hơn về sự lây lan của bệnh trong cộng đồng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Realtime PCR trong điều trị bệnh sốt mò

Việc áp dụng Realtime PCR không chỉ giúp chẩn đoán bệnh mà còn hỗ trợ trong việc điều trị. Nhờ vào khả năng phát hiện nhanh chóng, bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị kịp thời, giảm thiểu biến chứng và nguy cơ tử vong cho bệnh nhân.

4.1. Tác động của chẩn đoán sớm đến điều trị

Chẩn đoán sớm giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị. Việc phát hiện kịp thời O. tsutsugamushi giúp giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng.

4.2. Kinh nghiệm từ các ca bệnh thực tế

Nhiều ca bệnh đã được điều trị thành công nhờ vào việc áp dụng Realtime PCR trong chẩn đoán. Các bác sĩ đã có thể theo dõi tình trạng bệnh nhân và điều chỉnh phác đồ điều trị một cách linh hoạt.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp Realtime PCR trong đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai đã mở ra nhiều triển vọng cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Tương lai, cần tiếp tục đầu tư vào công nghệ và đào tạo nhân lực để nâng cao hiệu quả của phương pháp này.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện quy trình xét nghiệm và mở rộng quy mô nghiên cứu để có cái nhìn tổng quát hơn về tình hình bệnh sốt mò tại Việt Nam.

5.2. Định hướng phát triển công nghệ chẩn đoán

Cần phát triển thêm các công nghệ chẩn đoán mới, kết hợp với Realtime PCR để nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện bệnh sốt mò.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sốt mò (Scrub typhus) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi khuẩn ký sinh nội bào Orientia tsutsugamushi gây ra, lây truyền qua ấu trùng mò thuộc chi Leptotrombidium. Trên phạm vi toàn cầu, ước tính có khoảng 1.000.000.000 người sống trong vùng nguy cơ dịch tễ và ghi nhận xấp xỉ 1.000.000 ca mắc mới mỗi năm tại khu vực châu Á - Thái Bình Dương. Tại Việt Nam, sốt mò là bệnh lưu hành phổ biến nhưng thường xuyên bị chẩn đoán muộn hoặc nhầm lẫn với sốt xuất huyết, sốt rét và nhiễm trùng huyết do biểu hiện lâm sàng đa dạng như sốt cao kéo dài, đau đầu dữ dội, phát ban và hạch sưng to. Vết loét hoại tử đặc trưng (eschar) chỉ xuất hiện ở khoảng 40% đến 65% trường hợp, dẫn đến nguy cơ biến chứng suy đa tạng và tử vong nếu không được điều trị kịp thời bằng kháng sinh đặc hiệu.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là xây dựng quy trình TaqMan Realtime PCR tối ưu nhắm vào gen mã hóa protein màng ngoài 47 kDa (HtrA) của O. tsutsugamushi, đồng thời điều tra xác định tỷ lệ nhiễm khuẩn và các yếu tố dịch tễ học liên quan trên 156 bệnh nhân sốt cấp tính điều trị nội trú tại Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/2016 đến tháng 12/2016. Đề tài mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định từ 7-14 ngày của phương pháp huyết thanh học xuống còn dưới 3 giờ, đạt độ đặc hiệu tuyệt đối 100%, tạo tiền đề vững chắc cho việc can thiệp y khoa sớm và giảm thiểu tỷ lệ tử vong tại các cơ sở y tế tuyến đầu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết sinh bệnh học vi sinh vật nội bào và mô hình lan truyền bệnh qua véc-tơ tiết túc. Vi khuẩn Orientia tsutsugamushi là vi khuẩn Gram âm có kích thước 0,5–0,8 µm x 1,2–3,0 µm, chu kỳ nhân bản kéo dài từ 9 đến 18 giờ trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ. Vòng truyền bệnh phụ thuộc hoàn toàn vào ấu trùng mò Leptotrombidium (như L. deliense, L. akamushi), trong đó vi khuẩn có khả năng truyền dọc qua trứng sang thế hệ sau với tỷ lệ đạt tới 100%. Khi xâm nhập vào máu người qua vết đốt, vi khuẩn nhanh chóng định cư và nhân lên bên trong các tế bào đơn nhân ngoại vi (PBMC) và đại thực bào.

Về mặt kỹ thuật, đề tài áp dụng nguyên lý phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (Realtime PCR) kết hợp công nghệ mẫu dò huỳnh quang TaqMan probe (sử dụng chất phát huỳnh quang FAM ở đầu 5' và chất dập tắt TAMRA ở đầu 3'). Khi DNA polymerase thực hiện kéo dài chuỗi, hoạt tính 5'-3' exonuclease sẽ thủy phân probe, giải phóng phân tử FAM phát tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao mục tiêu. Gen đích được lựa chọn là gen HtrA mã hóa kháng nguyên bề mặt 47 kDa, có tính bảo tồn rất cao giữa các chủng lưu hành phổ biến như Karp, Kato, Boryong và TH1817. Các khái niệm then chốt bao gồm: chu kỳ ngưỡng (Ct ≤ 35 quy định mẫu dương tính), nhiệt độ nóng chảy (Tm), năng lượng tự do cấu trúc thứ cấp (ΔG > -9 kcal/mol) và hiệu quả khuếch đại (E%).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thu thập 156 mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA từ các bệnh nhân nghi ngờ mắc sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai trong suốt 12 tháng của năm 2016. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu thuận tiện có chủ đích dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng: sốt cấp tính chưa rõ nguyên nhân kèm theo ít nhất một triệu chứng như nổi hạch, phát ban hoặc có vết đốt nghi ngờ.

Quy trình phân tích thực nghiệm bao gồm:

• Tách chiết lớp tế bào đơn nhân ngoại vi (PBMC): Trộn 4 ml máu toàn phần với 4 ml dung dịch Ficoll trong ống Falcon 15 ml, ly tâm phân đoạn ở tốc độ 1.800 vòng/phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng để thu nhận toàn bộ lớp tế bào PBMC chứa vi khuẩn.
• Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) với 200 µl đệm ly giải AL, 20 µl Proteinase K và 20 µl Carrier RNA, ủ ở 65°C trong 10 phút, sau đó tinh sạch qua cột silica và thu hồi bằng 50 µl đệm AE. Độ tinh sạch được kiểm định qua tỷ số quang phổ OD260/OD280 đạt chuẩn từ 1,8 đến 2,0.
• Thiết kế mồi và probe: Thiết kế cặp mồi xuôi (26 bp, Tm 53,5°C), mồi ngược (26 bp, Tm 53,1–54,9°C) và mẫu dò TaqMan (25 bp, Tm 58,5°C) bằng phần mềm BioEdit, ClustalX và Beacon Designer, kiểm tra độ đặc hiệu qua BLAST trên NCBI.
• Tối ưu hóa điều kiện phản ứng: Khảo sát 4 mức nhiệt độ gắn mồi (52°C, 55°C, 58°C, 60°C) và 3 nồng độ MgSO4 (4 mM, 5 mM, 6 mM) trên hệ thống máy ABI 7500 Fast.

Lý do lựa chọn Realtime PCR trên nền mẫu PBMC là nhằm khắc phục triệt để nhược điểm của phương pháp nuôi cấy vi khuẩn vốn đòi hỏi phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3), đồng thời loại bỏ nhu cầu lấy mẫu huyết thanh kép của phương pháp ELISA/IFA, đáp ứng yêu cầu trả kết quả khẩn cấp cho điều trị lâm sàng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm và khảo sát trên tập mẫu bệnh nhân tại Bệnh viện Bạch Mai đã đem lại các kết quả định lượng cụ thể:

Thứ nhất, nghiên cứu đã chuẩn hóa thành công các thông số phản ứng Realtime PCR. Nhiệt độ bắt cặp và kéo dài tối ưu được xác định chính xác là 60°C, tại đó đường cong huỳnh quang có độ dốc cao và tín hiệu nền thấp nhất. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 5 mM MgSO4, cho chu kỳ ngưỡng Ct sớm ở mức 27,6 chu kỳ, rút ngắn đáng kể so với nồng độ 4 mM (Ct = 30,7 chu kỳ) và 6 mM (Ct = 30,2 chu kỳ). Đánh giá độ đặc hiệu trên các chủng vi khuẩn đối chứng gồm Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii và Escherichia coli cho kết quả âm tính hoàn toàn (undetermined), xác nhận độ đặc hiệu đạt 100%. Thử nghiệm độ nhạy phân tử trên thang pha loãng 10 lần plasmid chuẩn chứa gen HtrA từ 10^6 đến 10^0 bản sao/ml cho thấy hệ số tương quan tuyến tính R^2 đạt trên 0,98 với hiệu suất phản ứng đạt trên 90%.

Thứ hai, trong tổng số 156 bệnh nhân nghi ngờ được đưa vào xét nghiệm, có đúng 78 mẫu dương tính với Orientia tsutsugamushi, tương ứng với tỷ lệ nhiễm bệnh là 50,0%.

Thứ ba, về mặt dịch tễ giới tính, trong 156 mẫu ban đầu có 81 nam (chiếm 51,9%) và 75 nữ (chiếm 48,1%). Trong 78 bệnh nhân có kết quả xét nghiệm dương tính, ghi nhận 41 bệnh nhân nam (chiếm 52,7%) và 37 bệnh nhân nữ (chiếm 47,3%). Xét riêng trong từng nhóm giới tính, tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới đạt 50,6% (41/81) và ở nữ giới đạt 49,3% (37/75).

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ dương tính 50,0% ở các bệnh nhân nghi ngờ phản ánh mức độ lưu hành cao của mầm bệnh sốt mò trong cộng đồng các tỉnh phía Bắc đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu dịch tễ học rickettsia tại khu vực Đông Nam Á, nơi tỷ lệ phát hiện dao động từ 30% đến 60% ở các ca sốt cấp tính chưa rõ nguồn gốc.

Sự tương đồng về tỷ lệ nhiễm giữa nam giới (52,7%) và nữ giới (47,3%) chứng minh rằng tính cảm nhiễm với O. tsutsugamushi không phụ thuộc vào yếu tố sinh học giới tính mà chịu chi phối bởi nguy cơ phơi nhiễm môi trường. Trong thực tế lao động nông nghiệp và lâm nghiệp tại Việt Nam, cả nam và nữ đều tham gia vào các hoạt động canh tác nương rẫy, phát quang bụi rậm hoặc thu hoạch hoa màu, nơi tập trung các "đảo mò" sinh sống trong thảm thực vật thấp và đất ẩm xốp.

Dữ liệu nghiên cứu được trình bày trực quan và khoa học thông qua bảng thống kê chu kỳ ngưỡng theo nồng độ hóa chất và biểu đồ cột kép so sánh tỷ lệ thu thập mẫu với tỷ lệ dương tính theo giới tính. Đồ thị khuếch đại huỳnh quang (Amplification Plot) minh chứng rõ ràng sự phân tách rõ rệt giữa mẫu bệnh nhân dương tính (Ct nằm trong khoảng 25,31 đến 34,18) và các mẫu đối chứng âm tính, khẳng định tính ổn định và độ tin cậy vượt trội của quy trình.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm đạt độ chính xác cao, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát sốt mò:

• Chuẩn hóa và chuyển giao kỹ thuật: Cục Y tế Dự phòng phối hợp với Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương hoàn thiện quy trình chuẩn (SOP) xét nghiệm TaqMan Realtime PCR phát hiện gen HtrA, đặt mục tiêu chuyển giao và vận hành thành công tại 100% bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh và trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) trọng điểm trong giai đoạn 2024–2026.
• Rút ngắn thời gian chẩn đoán sớm: Các cơ sở y tế tuyến cuối và tuyến tỉnh áp dụng xét nghiệm phân tử PBMC Realtime PCR ngay trong vòng 24 giờ đầu sau khi tiếp nhận bệnh nhân có hội chứng sốt cấp tính trên 3 ngày tại các vùng dịch tễ, hướng tới mục tiêu giảm 40% tỷ lệ biến chứng nặng do dùng sai kháng sinh trước năm 2025.
• Xây dựng hệ thống giám sát phân tử định kỳ: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương chủ trì thiết lập ngân hàng dữ liệu gen và theo dõi định kỳ biến đổi trình tự gen 47 kDa và 56 kDa của các chủng O. tsutsugamushi lưu hành, đảm bảo giám sát 100% các biến chủng kháng thuốc hoặc biến đổi kháng nguyên tại miền Bắc từ năm 2025 đến năm 2028.
• Đào tạo và truyền thông phòng ngừa: Trung tâm truyền thông giáo dục sức khỏe các địa phương triển khai tập huấn cho 100% cán bộ y tế cơ sở về dấu hiệu lâm sàng sớm, đồng thời hướng dẫn người dân sử dụng hóa chất xua côn trùng (như DMP, DEET) và bảo hộ lao động khi đi rừng, phấn đấu giảm 30% số ca mắc mới ngoài cộng đồng trước năm 2027.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là nguồn tài liệu học thuật và kỹ thuật giá trị cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Bác sĩ chuyên khoa Truyền nhiễm và Hồi sức Cấp cứu: Cung cấp bằng chứng thực tế về tỷ lệ lưu hành 50,0% của sốt mò ở nhóm bệnh nhân sốt cấp tính, giúp nâng cao cảnh giác lâm sàng, chỉ định xét nghiệm phân tử kịp thời và lựa chọn phác đồ Doxycycline hoặc Azithromycin sớm.
• Kỹ thuật viên và Chuyên viên Xét nghiệm Sinh học Phân tử: Hướng dẫn chi tiết từng bước tách lớp PBMC bằng Ficoll, tách DNA bằng cột silica và tối ưu hóa hệ master mix chứa 5 mM MgSO4, nhiệt độ gắn mồi 60°C để thiết lập xét nghiệm chẩn đoán thường quy tại phòng lab.
• Cán bộ Dịch tễ học và Cơ quan Y tế Công cộng: Nắm bắt dữ liệu phân bố dịch tễ học, mối liên hệ sinh cảnh với mò Leptotrombidium và tỷ lệ mắc tương đồng giữa nam và nữ để xây dựng kế hoạch khoanh vùng dập dịch và phân bổ nguồn lực y tế dự phòng.
• Học viên Cao học, Nghiên cứu sinh ngành Di truyền học và Vi sinh học: Tham khảo phương pháp luận khoa học trong việc phân tích trình tự gen bảo tồn, thiết kế mồi/probe bằng phần mềm chuyên dụng (Beacon Designer, BLAST) và phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu chuẩn quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại lựa chọn gen mã hóa protein 47 kDa (HtrA) làm đích khuếch đại?
Gen HtrA mã hóa protein màng ngoài 47 kDa của O. tsutsugamushi có mức độ bảo tồn rất cao giữa các kiểu hình huyết thanh khác nhau như Karp, Kato, Boryong và TH1817. Việc chọn gen này giúp cặp mồi và probe bắt cặp chính xác với hầu hết các chủng lưu hành tại Việt Nam, hạn chế tối đa nguy cơ âm tính giả do đột biến kháng nguyên.

Tại sao cần phải tách chiết lớp tế bào đơn nhân ngoại vi (PBMC) bằng Ficoll thay vì dùng máu toàn phần?
O. tsutsugamushi là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, cư trú và nhân lên chủ yếu trong tế bào bạch cầu đơn nhân và đại thực bào. Tách lớp PBMC từ 4 ml máu toàn phần giúp làm giàu mật độ vi khuẩn lên hàng chục lần và loại bỏ hemoglobin trong hồng cầu – một chất ức chế mạnh phản ứng PCR, từ đó nâng cao độ nhạy xét nghiệm.

Ngưỡng chu kỳ Ct nào được sử dụng để khẳng định mẫu bệnh nhân dương tính?
Nghiên cứu quy định giá trị ngưỡng là Ct ≤ 35 chu kỳ trên kênh tín hiệu huỳnh quang FAM. Mọi mẫu có đường cong khuếch đại vượt tín hiệu nền trước hoặc tại chu kỳ 35 được xác định là dương tính với O. tsutsugamushi, trong khi các mẫu không xuất hiện tín hiệu hoặc có Ct > 35 được đánh giá là âm tính.

Nồng độ ion magie (Mg2+) tối ưu ảnh hưởng như thế nào đến phản ứng Realtime PCR?
Nồng độ 5 mM MgSO4 được xác định là tối ưu vì cho giá trị Ct sớm nhất (27,6 chu kỳ), sớm hơn khoảng 2 chu kỳ so với nồng độ 4 mM (Ct = 30,7) và 6 mM (Ct = 30,2). Nồng độ Mg2+ thích hợp giúp tối ưu hóa hoạt tính của enzyme Taq DNA polymerase và tăng cường tính ổn định khi bắt cặp của probe TaqMan.

Tỷ lệ nhiễm sốt mò xác định bằng Realtime PCR tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016 là bao nhiêu?
Xét nghiệm Realtime PCR trên 156 bệnh nhân nghi ngờ đã xác định được 78 ca dương tính, chiếm tỷ lệ 50,0%. Trong đó, số ca mắc ở nam giới là 41 ca (chiếm 52,7% số ca dương tính) và ở nữ giới là 37 ca (chiếm 47,3% số ca dương tính).

Kết luận

• Luận văn đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình TaqMan Realtime PCR đơn mồi nhắm vào gen HtrA (47 kDa) của Orientia tsutsugamushi với độ đặc hiệu đạt 100% khi thử nghiệm đối chứng vi sinh.
• Xác định được điều kiện phản ứng tối ưu tại nhiệt độ bắt cặp/kéo dài 60°C và nồng độ MgSO4 5 mM, giúp chu kỳ ngưỡng Ct đạt sớm ở mức 27,6.
• Ứng dụng quy trình trên 156 bệnh nhân nghi ngờ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016 đã phát hiện 78 mẫu dương tính, xác định tỷ lệ nhiễm sốt mò là 50,0%.
• Phân tích dịch tễ cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh phân bố cân bằng giữa nam giới (52,7%) và nữ giới (47,3%), phản ánh nguy cơ phơi nhiễm môi trường tương đương nhau trong sinh hoạt và lao động.
• Cung cấp một công cụ chẩn đoán sinh học phân tử có độ nhạy cao, rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống dưới 3 giờ, tạo bước đột phá trong điều trị lâm sàng và kiểm soát dịch bệnh sốt mò tại Việt Nam.

Trong giai đoạn tiếp theo (2024–2026), các đơn vị y tế cần sớm triển khai áp dụng quy trình Realtime PCR này vào hoạt động xét nghiệm thường quy tại các bệnh viện tuyến tỉnh và cơ sở khám chữa bệnh trọng điểm. Hãy liên hệ với các trung tâm nghiên cứu y sinh và bệnh viện đầu ngành để nhận chuyển giao công nghệ, góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt mò (Scrub typhus) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính,bệnh truyền qua côn trùng, tiết túc do vi khuẩn ký sinh nội bào Orientia tsutsugamushi (trƣớc kia gọi là Ricketsia orientalis hoặc Ricketsia tsutsugamushi) gây nên. Đây là bệnh sốt cấp tính lƣu hành và gây dịch ở nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Ƣớc tính có khoảng 1 tỷ ngƣời có nguy cơ bị mắc bệnh và khoảng 1 triệu ca bệnh mỗi năm [32,44]. Trong những năm gần đây, sốt mò đƣợc phát hiện và tái phát hiện ở nhiều nƣớc trong vùng dịch tễ nhƣ: Lào, Ấn Độ, Sri Lanka, Maldives.

Sốt mò là bệnh của động vật, chủ yếu là các động vật gặm nhấm và các động vật có xƣơng sống nhỏ khác thuộc lớp thú. Ổ bệnh và trung gian truyền bệnh là mò Leptotrumbidium, một loài chân đốt thuộc họ ve bét. tsutsugamushi truyền vi khuẩn cho đời sau qua trứng và qua các giai đoạn phát triển. Ấu trùng mò nhiễm O.

tsutsugamushitruyền mầm bệnh cho động vật và ngƣời khi đốt[36,37,49]. Sốt mò ở ngƣời có các biểu hiện lâm sàng đa dạng, rất giống với nhiều bệnh truyền nhiễm cấp tính khác. Các ca bệnh điển hình có vết đố t đặc hiệu ngoài da có giá trị chẩn đoán nhƣng chỉ có ở một số bệnh nhân, không đại diện đầy đủ cho phổ bệnh thực sự của sốt mò và đôi khi không đƣợc phát hiện. Bệnh có thể tiến triển nặng và gây tử vong nếu không đƣợc chẩn đoán sớm, đúng và điều trị đặc hiệu [52].

Các xét nghiệm chẩn đoán xác định bệnh sốt mò có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định ca bệnh trên lâm sàng, định hƣớng điều trị sớm và điều trị đặc hiệu nhằm giảm thiểu biến chứng và nguy cơ tử vong cho ngƣời bệnh.Tuy nhiên, viê ̣c phát hiê ̣n ra bệnh sốt mò rất khó nếu không có phƣơng pháp chẩn đoán phù hợp. Trƣớc khi có phƣơng pháp chẩn đoán hiện đại, việc chẩn đoán phụ thuộc rất nhiều vào trình độ của bác sĩ cũng nhƣ sự xuất hiện của vectơ truyền bệnh hay vết đốt. Nhiều ngƣời bệnh có triệu chứng không điển hình, sốt kéo dài làm cho chẩn đoán bị nhầm lẫn. Nếu đƣợc chẩn đoán đúng thì việc điều trị rất đơn giản.

Do đó, chẩn đoán bệnh bằng các xét nghiệm chính xác và kịp thời sẽ hỗ trợ rất nhiều cho các bác sĩ trong việc điều trị bệnh ricketssia. Ngày nay trên thế giới, có ba phƣơng 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 pháp chính đƣợc sử dụng để chẩn đoán bệnh sốt mò, đó là: phƣơng pháp nuôi cấy, phƣơng pháp miễn dịch và phƣơng pháp sinh học phân tử. Tuy nhiên, phƣơng pháp nuôi cấy không thể thực hiện đƣợc ở các cơ sở khám chữa bệnh do yêu cầu về phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp ba, do tínhphức tạp và tốn nhiều thời gian. Phƣơng pháp miễn dịch đòi hỏi phải có hai mẫu huyết thanh của ngƣời bệnh ở hai thời điểm khác nhau, một mẫu trong giai đoạn cấp tính, một mẫu trong giai đoạn hồi phục.Điề u này gây khó khăn cho việc lấy mẫu, phát hiện và chữa trị bệnh kịp thời.

Do đó, áp dụng phƣơng pháp PCR trong chẩn đoán bệnh sốt mò là công cụ hữu ích nhất hiện nay trong các bệnh viện và cơ sở y tế tại Việt Nam. Đây cũng là phƣơng pháp giúp cải thiện đƣợc các hạn chế của hai phƣơng pháp trƣớc, tiết kiệm thời gian và trả kết quả nhanh nhất, kịp thời cho công tác chẩn đoán và chữa bệnh. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME PCR TRONG ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TỈ LỆ BỆNH SỐT MÒ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2016” với các mục tiêu nghiên cứu nhƣ sau: 1. Xây dựng đƣợc quy trình tối ƣu để xác định tình trạng nhiễm O.

tsutsugamushi gây bệnh sốt mò bằng kĩ thuật Realtime PCR. Xác định đƣợc tỉ lệ bệnh nhân nhiễm O. tsutsugamushi tại bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016 và một số yếu tố dịch tễ học có liên quan. Đề tài nghiên cứu này đƣợc thực hiện với các nội dung sau: Xây dựng quy trình tối ƣu để xác định tình trạng nhiễm O.

tsutsugamushi gây bệnh sốt mò bằng kĩ thuật Realtime PCR bao gồm các bƣớc: Thiết kế mồi, tối ƣu nhiệt độ gắn Taqman probe, Tối ƣu nồng độ Mg2+ của phản ứng Realtime PCR, tách chiết DNA, tiến hành phản ứng Realtime PCR, đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 Ứng dụng phƣơng pháp Realtime PCR để xác định tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016 và điều tra một số yếu tố dịch tễ học có liên quan. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sốt mò đƣợc biết đến từ rất sớm. Những mô tả đầu tiên về một bệnh nhân có triệu chứng tƣơng tự sốt mò đƣợc tìm thấy tại Trung Quốc vào thế kỉ thứ IV sau công nguyên; bệnh đƣợc cho là có liên quan đến một loại côn trùng màu đỏ. Tại Nhật Bản, bệnh đƣợc Hashimoto mô tả lần đầu tiên vào năm 1810 nhƣng đến năm 1878 mới đƣợc biết đến rộng rãi qua thông báo của bác sỹ Theodor Palm với tên địa phƣơng là “shima mushi”. Vai trò lây truyền bệnh của ấu trùng mò Leptotrobidium đƣợc Brumpt đề cập đến lần đầu tiên vào năm 1910.

Bản chất của vi khuẩn gây sốt mò đƣợc xác định vào cuối những năm 1920. Dịch tễ học bệnh sốt mò 1. tsutsugamushi – tác nhân gây bệnh sốt mò 1. Đặc điểm của vi khuẩn O.

tsutsugamushi Vi khuẩn gây bệnh sốt mò – O. tsutsugamushi có kích thƣớc 0,5 – 0,8µm x 1,2 – 3,0µm, là vi khuẩn Gram âm, kí sinh nội bào. Mỗi tế bào vi khuẩn đƣợc bao bọc bởi một lớp thành tế bào rất mềm và một lớp màng tế bào. Vỏ vi khuẩn không chứa các peptidoglycan và lipopolysaccaride, lá ngoài của thành tế bào dày hơn đáng kể so với lá trong.

tsutsugamushi bắt màu Giemsa, mọc trong túi thể vàng của phôi gà hoặc một loạt các dòng tế bào nuôi cấy. tsutsugamushi xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua cơ chế thực bào, đi vào nguyên sinh chất và phát triển chủ yếu ở vùng cận nhân tế bào. Vi khuẩn đƣợc giải phóng ra khỏi tế bào vật chủ bằng phƣơng pháp nẩy chồi và đƣợc bao bọc bởi một lớp màng của tế bào vật chủ tƣơng tự nhƣ những virus có vỏ. tsutsugamushi nhân lên bằng phƣơng pháp chia đôi, chu kì nhân bản kéo dài khoảng 9 – 18 giờ [47].

Trƣớc năm 1995, Ricketsia tsutsugamushi(nay gọi là O. tsutsugamushi) đƣợc xếp ở trong giống Ricketsia, là loài duy nhất trong giống sốt mò. Tuy nhiên, những nghiên cứu về cấu trúc và di truyền học cho thấy sự khác biệt lớn giữa Ricketsia 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 tsutsugamushi và các Ricketsia khác. Cấu trúc thành tế bào của O.

tsutsugamushi có lá ngoài dày hơn lá trong, không chứa peptidoglycan và lipopolysaccaride; O. tsutsugamushi đề kháng cao tự nhiên với Penicillin. Khi phân tích trình tự gen 16S rARN, khoảng khác biệt giữa R.tsutsugamushi và các vi khuẩn khác trong giống Ricketsia gần bằng với khoảng khác biệt tiến hóa giữa các giống trong họ Ricketsiale. Vì những lí do này, R.tsutsugamushi đƣợc tách ra thành một giống riêng, mang tên O.

Tính đa dạng của các chủng O. tsutsugamushi Tất cả các chủng vi khuẩn sốt mò có cấu trúc kháng nguyên rất khác nhau và độc tính với chuột cũng rất khác nhau [47]. Sự khác biệt về mặt kháng nguyên đƣợc xác định chủ yếu qua cấu trúc của các protein vỏ, và có thể đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp huyết thanh học và kĩ thuật sinh học phân tử [26]. tsutsugamushi cổ điển là: Karp, Kato và Gilliam; ngoài ba chủng này còn có hơn ba mƣơi chủng huyết thanh khác đƣợc xác định tại các nƣớc khác nhau và các địa phƣơng khác nhau tại vùng dịch tễ.

Một vùng địa lý có thể có nhiều chủng O. tsutsugamushi cùng tồn tại. Tính đa dạng này có vai trò quan trọng trong dịch tễ học của sốt mò tại địa phƣơng. Mò Leptotrobidium - ổ bệnh và trung gian truyền bệnh 1.

Một số đặc điểm sinh học của mò Leptotrobidium Mò Leptotrobidiumlà một chi động vật trong họ ve mò(Trombiculidae), lớp Nhện (arachnida), ngành chân đốt (arthropoda). Mò có kích thƣớc bé, không quá 1mm, màu sắc từ vàng đến da cam nên còn gọi là mò đỏ[3]. Vòng đời của mò bao gồm bốn giai đoạn phát triển: trứng, ấu trùng, nymph và giai đoạn trƣởng thành[37]. Mò trƣởng thành sống trong đất xốp và ẩm.

Mò cái đẻ trứng trên các lớp đất bề mặt. Âú trùng nở ra từ trứng bò lên cây cỏ hoặc tàn cây, một số nấp trong các khe nứt hoặc trần hang chuột để chờ bám vào động vật và đốt. Sau khi đốt động vật, ấu trùng quay trở lại mặt đất trải qua các giai đoạn phát triển tiếp theo và phát triển đến giai đoạn trƣởng thành, sẵn sàng sản sinh ra thế hệ mò sau. Thời gian sống của mò 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 trƣởng thành có thể kéo dài 15 tháng hoặc lâu hơn.

Chu kì sinh trƣởng của mò kéo dài 2 – 3 tháng ở những vùng có khí hậu ấm và có thể kéo dài hơn 8 tháng ở những vùng có khí hậu lạnh[37,39]. Ấu trùng là giai đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở các động vật có xƣơng sống, chủ yếu là chuột và các thú nhỏ khác trong lớp gặm nhấm, có thể đốt ngƣời. Thời gian đốt động vật của ấu trùng mò kéo dài 48 – 72 giờ (có thể kéo dài đến 12 ngày ở một số loài). Ấu trùng mò chƣa đốt động vật có thể sống đến 30 ngày và có tầm di chuyển rất hạn chế.

Khi đốt động vật chúng thƣờng tập trung thành từng đám vài trăm cá thể ở những nơi rất hẹp nhƣ tai và vùng hậu môn – sinh dục của động vật, có thể bị gãi văng ra hoặc rời vật chủ gần nhƣ cùng một lúc. Những yếu tố này góp phần hình thành các “đảo mò” hay các “điểm nóng” lây truyền sốt mò đƣợc mô tả trong các nghiên cứu dịch tễ học của bệnh [37, 39]. Phân bố của mò Leptotrombidium Những loài mò đƣợc xác định là ổ bệnh và trung gian truyền bệnh sốt mò bao gồm: L.arenicula và 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 một số loài khác.akamushi là vector lây truyền sốt mò mùa hè ở các vùng dịch truyền thống của Nhật Bản nhƣ: Niigata, Yamagata và Akita [30].