Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm trùng do Leptospira tại Việt Nam

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc chẩn đoán nhiễm trùng do… 55 trang · Viện Đại học Mở Hà Nội · 2015.

• Tác giả: Vũ Thị Thùy Linh
• Người hướng dẫn: BS. Hoàng Thị Thu Hà
• Trường học: Viện Đại học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira tại Việt Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG, HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lịch sử về bệnh Leptospira
• 1.2. Đặc điểm vi khuẩn học của xoắn khuẩn Leptospira
• 1.2.1. Hình thể, cấu tạo và tính chất
• 1.2.2. Độc tố vi khuẩn và kháng nguyên
• 1.2.3. Khả năng gây bệnh
• 1.3. Đặc điểm lâm sàng
• 1.4. Dịch tễ học của bệnh
• 1.4.1. Phương thức lây truyền
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Các chủng Leptospira chuẩn
• 2.3. Hóa chất, môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 2.4. Các trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp thu thập, xử lý bệnh phẩm
• 2.5.2. Vận chuyển bệnh phẩm
• 2.5.3. Xử lý bệnh phẩm (tại phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2)
• 2.5.4. Tách chiết ADN
• 2.5.5. Tiến hành phản ứng PCR
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nuôi cấy vi khuẩn
• 3.2. Tạo bệnh phẩm mô phỏng với vi khuẩn Leptospira
• 3.3. Chuẩn hóa phương pháp flaB – PCR tổ
• 3.4. Xác định giá trị của phương pháp flaB – PCR tổ
• 3.5. Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng flaB – PCR tổ
• 3.6. Xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR
• 3.7. Phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm
• 3.8. Quy trình chuẩn của phương pháp flaB - PCR tổ
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc chẩn đoán nhiễm trùng do Leptospira tại Việt Nam. Phương pháp này cho phép phát hiện ADN của vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác, giúp nâng cao khả năng chẩn đoán sớm bệnh Leptospirosis. Việc áp dụng kỹ thuật PCR không chỉ giúp xác định nhanh căn nguyên bệnh mà còn hỗ trợ trong việc kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

1.1. Lịch sử phát triển kỹ thuật PCR trong y học

Kỹ thuật PCR được phát triển vào năm 1983 bởi Kary Mullis. Từ đó, nó đã được ứng dụng rộng rãi trong y học, đặc biệt trong chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng như Leptospirosis. Sự phát triển của PCR đã mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và điều trị bệnh.

1.2. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật PCR

Nguyên lý của PCR dựa trên khả năng khuếch đại ADN. Phương pháp này sử dụng enzyme DNA polymerase để tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn ADN mục tiêu, từ đó giúp phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn Leptospira trong mẫu bệnh phẩm.

II. Thách thức trong chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira tại Việt Nam

Chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira gặp nhiều thách thức do tính đa dạng của triệu chứng và sự tương đồng với các bệnh khác. Việc phát hiện bệnh thường bị ảnh hưởng bởi thời gian vận chuyển mẫu bệnh phẩm và điều kiện thực hiện xét nghiệm. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

2.1. Các triệu chứng lâm sàng khó phân biệt

Nhiều triệu chứng của Leptospirosis giống với các bệnh nhiễm trùng khác như sốt rét, viêm gan, và sốt xuất huyết. Điều này gây khó khăn trong việc chẩn đoán chính xác và kịp thời.

2.2. Hạn chế trong phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn và huyết thanh học thường mất nhiều thời gian và yêu cầu điều kiện phòng thí nghiệm an toàn. Điều này làm giảm khả năng phát hiện sớm bệnh.

III. Phương pháp PCR Giải pháp hiệu quả cho chẩn đoán Leptospira

Kỹ thuật PCR đã chứng minh là một giải pháp hiệu quả trong việc chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira. Phương pháp này không chỉ nhanh chóng mà còn có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phát hiện vi khuẩn ngay cả trong các mẫu bệnh phẩm khó khăn.

3.1. Quy trình thực hiện kỹ thuật PCR

Quy trình PCR bao gồm các bước tách chiết ADN, khuếch đại ADN mục tiêu và phân tích kết quả. Mỗi bước đều yêu cầu sự chính xác cao để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.

3.2. Lợi ích của việc sử dụng PCR trong chẩn đoán

Việc sử dụng PCR giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, tăng cường khả năng phát hiện sớm và chính xác bệnh Leptospirosis, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị và kiểm soát dịch bệnh.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu Leptospira

Kỹ thuật PCR không chỉ được áp dụng trong chẩn đoán mà còn trong nghiên cứu dịch tễ học và phát triển vaccine. Việc hiểu rõ về sự phân bố và tính chất của vi khuẩn Leptospira sẽ giúp xây dựng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

4.1. Nghiên cứu dịch tễ học với PCR

PCR giúp xác định nguồn lây nhiễm và phân bố địa lý của Leptospira, từ đó hỗ trợ các cơ quan y tế trong việc xây dựng chiến lược phòng chống dịch bệnh.

4.2. Phát triển vaccine dựa trên kết quả PCR

Kết quả từ các nghiên cứu PCR có thể được sử dụng để phát triển vaccine hiệu quả hơn, giúp bảo vệ cộng đồng khỏi bệnh Leptospirosis.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của kỹ thuật PCR tại Việt Nam

Kỹ thuật PCR đã và đang đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira tại Việt Nam. Với sự phát triển không ngừng của công nghệ, hy vọng rằng phương pháp này sẽ ngày càng được cải tiến và ứng dụng rộng rãi hơn trong y tế.

5.1. Tương lai của kỹ thuật PCR trong y tế

Kỹ thuật PCR có tiềm năng lớn trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn, không chỉ cho Leptospira mà còn cho nhiều bệnh nhiễm trùng khác.

5.2. Đề xuất nghiên cứu và cải tiến kỹ thuật

Cần tiếp tục nghiên cứu và cải tiến kỹ thuật PCR để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu, đồng thời giảm chi phí thực hiện, giúp mở rộng khả năng tiếp cận cho nhiều cơ sở y tế.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira (Leptospirosis) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây truyền từ động vật sang người, phân bố trên phạm vi toàn cầu và đặc biệt phổ biến tại các quốc gia nhiệt đới có mùa mưa kéo dài, điều kiện vệ sinh môi trường thấp và hoạt động chăn nuôi gia súc quy mô lớn xen lẫn khu dân cư. Mầm bệnh tồn tại chủ yếu trong ống thận của các loài gặm nhấm hoang dã và gia súc (lợn, trâu, bò, chó), được đào thải qua nước tiểu ra môi trường đất, nước ẩm ướt. Con người bị lây nhiễm chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp qua da trầy xước, niêm mạc mắt, mũi, miệng hoặc qua đường tiêu hóa khi sử dụng nguồn nước nhiễm khuẩn. Bệnh mang tính chất nghề nghiệp rõ rệt, thường gặp ở nông dân, công nhân chăn nuôi, công nhân hầm mỏ, lâm nghiệp, công nhân vệ sinh cống rãnh và nhân viên thú y.

Về mặt lâm sàng, bệnh có biểu hiện đa dạng từ sốt nhẹ đến các hội chứng tổn thương đa tạng nghiêm trọng như vàng da, suy thận cấp, xuất huyết phổi, viêm màng não và trụy tim mạch. Tỷ lệ tử vong ở các thể nặng có thể lên tới 20%–25%, riêng nhóm bệnh nhân có biểu hiện vàng da ghi nhận tỷ lệ tử vong từ 5%–10%. Việc chẩn đoán lâm sàng gặp nhiều khó khăn do triệu chứng ban đầu dễ nhầm lẫn với sốt xuất huyết Dengue, sốt rét, sốt vàng, cúm hoặc viêm gan siêu vi.

Các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm truyền thống tồn tại nhiều rào cản:

• Phương pháp soi tươi dưới kính hiển vi nền đen hoặc nhuộm thấm bạc có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, phụ thuộc chủ yếu vào chủ quan người đọc.
• Phương pháp nuôi cấy trên môi trường EMJH đòi hỏi thời gian kéo dài từ 4 đến 13 tuần, độ nhạy thấp và bắt buộc thực hiện tại phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 2.
• Phương pháp huyết thanh học Martin - Petit (MAT) được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng đòi hỏi lưu trữ thường xuyên bộ chủng sống gồm 24 chủng chuẩn, chỉ thực hiện được ở tuyến trung ương và cần lấy mẫu máu kép cách nhau 7–10 ngày.
• Kỹ thuật ELISA tuy nhanh hơn nhưng cần thời gian để cơ thể sinh kháng thể IgM (từ ngày thứ 6–8) và không định danh được serovar.

Trước thực trạng đó, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử như phản ứng chuỗi polymerase (PCR) cho phép phát hiện trực tiếp ADN của xoắn khuẩn trong giai đoạn sớm của bệnh (từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 26 sau khởi phát), cho kết quả nhanh và chính xác. Đề tài "Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR) trong chẩn đoán nhiễm trùng do Leptospira tại Việt Nam" được thực hiện nhằm giải quyết các yêu cầu cấp thiết về chẩn đoán sớm và giám sát dịch tễ.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Ứng dụng phương pháp PCR cho chẩn đoán sớm bệnh Leptospirosis.
2. Xây dựng thường quy chuẩn của phương pháp PCR phù hợp cho chẩn đoán Leptospira từ bệnh phẩm tại phòng thí nghiệm ở Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu bệnh phẩm thu thập từ người (25 mẫu máu, 25 mẫu nước tiểu của bệnh nhân sốt chưa rõ nguyên nhân kèm vàng da tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân y 103) và mẫu phủ tạng động vật (25 mẫu thận chuột, 30 mẫu thận lợn tại chợ Văn Giang, tỉnh Hưng Yên).
• Vật liệu sinh học: Bộ 22 chủng Leptospira chuẩn do Ngân hàng chủng của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp (gồm 21 serovar gây bệnh và 01 serovar không gây bệnh) và chứng dương chuẩn từ Viện Nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản (NIID).
• Phạm vi không gian và thời gian: Đề tài được triển khai từ tháng 11 năm 2014 đến ngày 28 tháng 2 năm 2015 tại Phòng Vi khuẩn Đặc biệt – Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (NIHE).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại sinh học

Leptospira là xoắn khuẩn thuộc chi Leptospira, họ Leptospiraceae, bộ Spirochaetales. Vi khuẩn có kích thước mảnh dài, đường kính 0,1–0,2 µm, dài 5–25 µm, cuộn xoắn dạng lò xo với hai đầu uốn cong hình móc câu, di động bằng các chuyển động lắc lư, co rút và lượn sóng. Vi khuẩn ưa khí, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 28°C–30°C, pH 6,8–7,2 trên môi trường bán tổng hợp EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) có bổ sung huyết thanh albumin bò (BSA) và Tween 80. Bộ gen của Leptospira có kích thước khoảng 5.000 kb gồm hai nhiễm sắc thể vòng (4.400 kb và 350 kb).

Trong nghiên cứu này, tác giả lựa chọn gen đích flaB (mã hóa protein cấu trúc sợi lông roi nằm trong khoang chu chất của xoắn khuẩn) để thiết kế phản ứng PCR tổ (flaB-nested PCR) theo thiết kế của Viện Nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản (NIID). Gen flaB có tính bảo tồn cao và hiện diện đặc hiệu ở tất cả các chủng Leptospira gây bệnh.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh phân tử kết hợp quy trình an toàn sinh học cấp độ 2:

1. Nuôi cấy và tạo mẫu mô phỏng: Chủng chuẩn được nuôi cấy trên môi trường EMJH lỏng ở 28°C–30°C. Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang học (quang phổ hấp phụ) ở bước sóng 260 nm ($OD_{260nm}$) và độ tinh sạch được đánh giá thông qua tỷ số $OD_{260nm}/OD_{280nm}$.
2. Xử lý bệnh phẩm và tách chiết ADN:
   • Mẫu phủ tạng (25 g) được nghiền trong 0,5 ml nước cất vô trùng tạo huyền dịch.
   • Mẫu nước tiểu (10 ml) được ly tâm phân đoạn (1.000 vòng/phút trong 5 phút lấy dịch nổi, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C thu cặn).
   • Mẫu máu được ly tâm 2.000 vòng/phút trong 10 phút lấy huyết thanh.
   • Tách chiết ADN bằng bộ kit thương mại QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) với enzyme Proteinase K và các dung dịch đệm ly giải ATL, AL, dung dịch rửa AW1, AW2 và dung dịch tách AE.
3. Kỹ thuật khuếch đại gen (flaB-PCR tổ): Phản ứng gồm 2 vòng nhiệt độc lập sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu:

Tên mồi	Trình tự Nucleotid (5' - 3')	Vai trò trong phản ứng
L-flaB F1	5’- CTC ACC GTT CTC TAA AGT TCA AC -3’	Mồi xuôi vòng 1 (PCR ngoài)
L-flaB R1	5’- TGA ATT CGG TTT CAT ATT TGC C -3’	Mồi ngược vòng 1 (PCR ngoài)
L-flaB F2	5’- TGT GCA CAA GAC GAT GAA AGC -3’	Mồi xuôi vòng 2 (PCR trong)
L-flaB R2	5’- AAC ATT GCC GTA CCA CTC TG -3’	Mồi ngược vòng 2 (PCR trong)

• Thành phần phản ứng cho mỗi ống (thể tích 20 µl): 10 µl Taq PCR Master Mix, 0,2 µl mồi xuôi, 0,2 µl mồi ngược, 8,6 µl $H_2O$ khử ion vô trùng và 1 µl ADN khuôn.
• Chu trình luân nhiệt trên máy MyCycler (Bio-Rad):
  • Vòng 1 (PCR 1): 94°C trong 1 phút; 25 chu kỳ (94°C/10 giây, 50°C/30 giây, 72°C/1 phút); kéo dài chuỗi ở 72°C trong 5 phút; giữ ở 12°C.
  • Vòng 2 (PCR 2): Sử dụng 1 µl sản phẩm PCR 1 làm khuôn; 94°C trong 1 phút; 30 chu kỳ (94°C/10 giây, 55°C/30 giây, 72°C/50 giây); kéo dài ở 72°C trong 7 phút; giữ ở 12°C.

4. Điện di và đọc kết quả: Sản phẩm PCR 2 được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm 0,5X TAE với hiệu điện thế 80V trong 45 phút, nhuộm bằng thuốc nhuộm SYBR Safe DNA Gel Stain và quan sát dưới đèn tia tử ngoại (UV) trên máy GelDoc (Bio-Rad). Kích thước sản phẩm khuếch đại đặc hiệu là 791 bp (so sánh với thang chuẩn 100 bp).
5. Kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu: Độ nhạy xác định bằng cách pha loãng bậc 10 mẫu ADN chuẩn ($10^0$ đến $10^5$). Độ đặc hiệu được kiểm chứng trên 21 serovar Leptospira gây bệnh, 01 serovar không gây bệnh (L. biflexa serovar Patoc) và 3 chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng đường ruột/ngoại nhiễm thông thường (Escherichia coli, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa).

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các y văn trong nước và quốc tế về xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis:

• Lịch sử nghiên cứu: Adolf Weil mô tả ca bệnh đầu tiên năm 1886; Inada và Ido tìm ra tác nhân năm 1914–1915 tại Nhật Bản; chuột được xác định là ổ chứa mầm bệnh năm 1917. Tại Việt Nam, bệnh được Ragiot và Souchard phát hiện năm 1931; các ổ dịch lớn được ghi nhận tại Lai Châu (1964, 1996).
• Tình hình dịch tễ: Năm 2009, Việt Nam đứng thứ 10 trong khu vực Châu Á – Thái Bình Dương về tỷ lệ mắc bệnh hàng năm (>10/100.000 dân), xếp cùng nhóm nguy cơ cao với Campuchia, Lào, Thái Lan, Ấn Độ. Tỷ lệ lưu hành kháng thể tại đồng bằng sông Cửu Long là 18,8% và tại Thanh Hóa đạt 78,6%. Giai đoạn 1996–2000 ghi nhận trung bình 56 ca mắc và 3 ca tử vong mỗi năm trên toàn quốc.
• Sinh lý bệnh và lâm sàng: Diễn biến lâm sàng chia làm 2 pha: pha 1 (pha xoắn khuẩn huyết, kéo dài 4–9 ngày với sốt cao 38°C–39°C, đau cơ dữ dội, xung huyết kết mạc); pha 2 (pha miễn dịch, xuất hiện tổn thương gan, suy thận cấp với tỷ lệ vô niệu 16%–40%, suy hô hấp cấp, trụy tim mạch).
• Đánh giá các phương pháp chẩn đoán: Phân tích ưu - nhược điểm của các kỹ thuật soi tươi nền đen, nhuộm Giemsa, nuôi cấy phân lập, phản ứng ngưng kết tan vi thể (MAT), kỹ thuật ELISA, điện di xung điện trường (PFGE), Real-time PCR và nested PCR.
• Phòng bệnh và điều trị: Nguyên tắc can thiệp dịch tễ 3 mắt xích (nguồn truyền nhiễm, đường lây, khối cảm nhiễm); phác đồ điều trị kháng sinh đặc hiệu bằng Penicillin G (5–10 triệu đơn vị/ngày cho người lớn trong 10–15 ngày) hoặc Doxycyclin, Ampicillin.

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu sinh học, hóa chất, trang thiết bị và các bước thực nghiệm:

• Bộ chủng vi khuẩn chuẩn: 22 chủng chuẩn thuộc 22 serovar khác nhau (Australis, Autumnalis, Bataviae, Canicola, Castellonis, Copenhageni, Pyrogenes, Tonkini, Icterohaemorrhagiae, Cynopterie, Gryppotyphosa, Hardjo Bovis, Hebdomadis, Javanica, Panama, Tarassovi, Vughia, Hardjoprajitno, Saxkoebing, Canicola Chiffon, Louisiana và chủng không gây bệnh Patoc I).
• Mẫu bệnh phẩm thực tế: Thu thập 50 mẫu lâm sàng người (25 máu, 25 nước tiểu) và 55 mẫu phủ tạng động vật (25 thận chuột, 30 thận lợn).
• Quy trình thu thập và bảo quản: Mẫu bệnh phẩm được chứa trong ống vô trùng, vận chuyển trong thùng 3 lớp tiêu chuẩn quốc tế ở điều kiện 15°C trong vòng 24 giờ về Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và bảo quản tại tủ âm sâu -80°C.
• Thông số kỹ thuật: Chi tiết nồng độ hóa chất, thể tích phản ứng Master Mix, chu trình nhiệt 2 vòng PCR và các bước tách chiết ADN bằng màng silica theo giao thức QIAamp DNA Mini Kit.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm chuẩn hóa kỹ thuật và thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm:

• Tạo mẫu mô phỏng: Dung dịch ADN chiết xuất từ huyền dịch nuôi cấy đạt nồng độ 782,275 µg/ml ($50 \times 3,1291 \times 5$), tỷ số $OD_{260nm}/OD_{280nm} = 1,9$ ($3,1291 / 1,6465$), đáp ứng tiêu chuẩn độ tinh sạch (khoảng cho phép 1,8–2,0).
• Chuẩn hóa phản ứng flaB-PCR tổ: Phản ứng khuếch đại cho sản phẩm kích thước chính xác 791 bp trên giếng chứng dương NIID và các mẫu ADN chủng chuẩn (L. Panama, L. Gryppotyphosa). Giếng chứng âm và serovar không gây bệnh L. Patoc không xuất hiện vạch.
• Xác định giới hạn phát hiện: Thử nghiệm pha loãng bậc 10 cho thấy phản ứng phát hiện được ADN vi khuẩn ở nồng độ tối thiểu là $10^1$ vi khuẩn/ml.
• Xác định độ đặc hiệu: Thử nghiệm trên 21 serovar gây bệnh đều cho kết quả dương tính (vạch 791 bp). Phản ứng âm tính hoàn toàn với serovar Patoc và các chủng đối chứng E. coli, C. perfringens, P. aeruginosa.
• Phát hiện trên mẫu bệnh phẩm thực tế: Phân tích 100 mẫu bệnh phẩm (50 mẫu người và 50 mẫu động vật đưa vào thử nghiệm), ghi nhận:
  • Mẫu động vật: 3/50 mẫu dương tính (chiếm 6,0%), gồm 2 mẫu thận chuột (ML003, ML004) và 1 mẫu thận lợn (PL026). Mẫu thận lợn PL026 cho phản ứng ngưng kết MAT dương tính và được xác định là serovar L. bataviae.
  • Mẫu người: 1/50 mẫu dương tính (mã số bệnh nhân HL002), trong khi kết quả nuôi cấy của mẫu này là âm tính.
• Xây dựng quy trình chuẩn (SOP): Thiết lập quy trình vận hành tiêu chuẩn gồm 4 bước (xử lý mẫu, tách ADN, phản ứng PCR tổ, điện di - chụp ảnh gel) cùng các quy định kiểm soát chất lượng (QC) và an toàn sinh học cấp 2.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

Các kết quả thực nghiệm thu được phản ánh tính hiệu quả của kỹ thuật flaB-nested PCR:

Chỉ số / Thông số đánh giá	Kết quả thực nghiệm đạt được	Ghi chú kỹ thuật
Kích thước đoạn gen khuếch đại	791 bp	Đặc hiệu cho gen flaB của Leptospira gây bệnh
Nồng độ ADN mẫu mô phỏng	782,275 µg/ml	Đo bằng quang phổ hấp phụ bước sóng 260 nm
Độ tinh sạch ADN ($OD_{260}/OD_{280}$)	1,9	Nằm trong giới hạn chuẩn (1,8 – 2,0)
Ngưỡng phát hiện (Độ nhạy)	$10^1$ vi khuẩn/ml (hoặc $10^1$ vi khuẩn/phản ứng)	Xác định qua chuỗi pha loãng bậc 10
Độ đặc hiệu chủng gây bệnh	21/21 serovar dương tính (100%)	Âm tính với serovar không gây bệnh Patoc I
Phản ứng chéo vi khuẩn khác	0/3 chủng (0%)	Âm tính với E. coli, C. perfringens, P. aeruginosa
Tỷ lệ dương tính trên mẫu người	1/50 mẫu (2,0%)	Mẫu HL002 (nuôi cấy âm tính)
Tỷ lệ dương tính mẫu động vật	3/50 mẫu (6,0%)	2 thận chuột (ML003, ML004), 1 thận lợn (PL026)
Thời gian thực hiện phản ứng	Khoảng 3 giờ	Nhanh hơn nhiều so với nuôi cấy (4–13 tuần)

Đóng góp của đề tài

1. Giá trị kỹ thuật: Đề tài đã chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật flaB-PCR tổ phát hiện trực tiếp Leptospira gây bệnh từ các loại bệnh phẩm khác nhau (máu, nước tiểu, phủ tạng) với độ nhạy cao ($10^1$ vi khuẩn/ml) và độ đặc hiệu tuyệt đối giữa các nhóm gây bệnh và không gây bệnh.
2. Khắc phục hạn chế của phương pháp cổ điển: Phương pháp PCR tổ khắc phục được tình trạng âm tính giả của nuôi cấy do bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước khi lấy mẫu hoặc do vi khuẩn bị chết trong quá trình vận chuyển bệnh phẩm; đồng thời rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống còn 3 giờ.
3. Đóng góp ứng dụng: Xây dựng bản quy trình chuẩn (SOP) chi tiết, quy định rõ điều kiện trang thiết bị, chu trình luân nhiệt, hóa chất và an toàn sinh học. Đây là cơ sở thực tiễn để chuyển giao kỹ thuật cho các phòng thí nghiệm vi sinh y học tuyến tỉnh và trung ương mà không đòi hỏi chi phí đầu tư quá lớn như Real-time PCR hay việc duy trì ngân hàng vi khuẩn sống phức tạp như phương pháp MAT.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Số lượng mẫu nghiên cứu còn hạn chế: Do giới hạn về thời gian thực tập (tháng 11/2014 – 02/2015), kinh phí nghiên cứu và nguồn cung cấp hóa chất, số lượng mẫu bệnh phẩm thu thập và phân tích chỉ dừng lại ở 100 mẫu (50 mẫu người và 50 mẫu động vật).
• Khó khăn trong phân lập vi khuẩn: Leptospira là xoắn khuẩn có tốc độ sinh trưởng chậm, đòi hỏi điều kiện nuôi cấy nghiêm ngặt và dễ bị tác động bởi kháng sinh trước đó, dẫn đến tỷ lệ phân lập vi khuẩn sống từ mẫu lâm sàng người đạt kết quả thấp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Triển khai kỹ thuật flaB-PCR tổ trong các chương trình giám sát dịch tễ chủ động tại các vùng trọng điểm có nguy cơ cao (khu vực ngập lụt, vùng nông thôn có ổ dịch lưu hành cũ).
• Mở rộng thu thập và phân tích các mẫu bệnh phẩm môi trường (đất, bùn, nguồn nước sinh hoạt tại ổ dịch) nhằm đánh giá đầy đủ dịch tễ học phân tử và mối liên hệ truyền bệnh giữa động vật gặm nhấm – gia súc – con người – môi trường trong cùng hệ sinh thái.
• Nghiên cứu sâu hơn về các gen quy định yếu tố độc lực của các chủng Leptospira phân lập tại Việt Nam, phục vụ định hướng sản xuất sinh phẩm chẩn đoán nhanh và nghiên cứu vắc xin phòng bệnh đặc hiệu.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

• Sinh viên và học viên sau đại học ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Y học dự phòng, Thú y: Cung cấp tài liệu tổng quan chi tiết về đặc tính sinh học, cơ chế gây bệnh, dịch tễ học của Leptospira và nguyên lý thiết kế mồi, tối ưu hóa phản ứng nested PCR.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm và cán bộ nghiên cứu tại các trung tâm y tế dự phòng, bệnh viện tuyến tỉnh, viện nghiên cứu truyền nhiễm: Tham khảo trực tiếp quy trình thao tác chuẩn (SOP) tại Chương 3 để triển khai chẩn đoán phân tử xoắn khuẩn vàng da từ mẫu máu, nước tiểu hoặc mô động vật.
• Các nhà nghiên cứu dịch tễ học động vật truyền sang người: Tham khảo phương pháp thu thập, đóng gói bệnh phẩm 3 lớp theo tiêu chuẩn quốc tế và quy trình xử lý an toàn sinh học cấp độ 2 đối với mẫu phủ tạng chuột và gia súc.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi nào được sử dụng trong kỹ thuật flaB-PCR tổ và kích thước sản phẩm khuếch đại là bao nhiêu?

Nghiên cứu sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu do Viện Nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) thiết kế:

• Mồi vòng 1 (PCR ngoài): L-flaB F1 (5’-CTC ACC GTT CTC TAA AGT TCA AC-3’) và L-flaB R1 (5’-TGA ATT CGG TTT CAT ATT TGC C-3’).
• Mồi vòng 2 (PCR trong): L-flaB F2 (5’-TGT GCA CAA GAC GAT GAA AGC-3’) và L-flaB R2 (5’-AAC ATT GCC GTA CCA CTC TG-3’). Kích thước sản phẩm khuếch đại đặc hiệu sau vòng 2 là 791 bp.

2. Giới hạn phát hiện (độ nhạy) và độ đặc hiệu của phương pháp flaB-PCR tổ trong khóa luận đạt mức nào?

• Độ nhạy: Giới hạn phát hiện tối thiểu đạt mức $10^1$ vi khuẩn/ml (hoặc $10^1$ vi khuẩn/phản ứng) qua thử nghiệm pha loãng bậc 10.
• Độ đặc hiệu: Phản ứng cho kết quả dương tính với toàn bộ 21/21 serovar Leptospira gây bệnh thử nghiệm, âm tính hoàn toàn với serovar không gây bệnh (Patoc I) và không xảy ra phản ứng chéo với các vi khuẩn đường ruột/ngoại nhiễm khác (E. coli, C. perfringens, P. aeruginosa).

3. Tỷ lệ phát hiện Leptospira trên các mẫu bệnh phẩm thực tế tại Hà Nội và Hưng Yên là bao nhiêu?

Trên tổng số 100 mẫu bệnh phẩm được thử nghiệm:

• Mẫu người: Phát hiện 1/50 mẫu dương tính (chiếm 2,0%, mẫu bệnh nhân HL002 tại Hà Nội).
• Mẫu động vật: Phát hiện 3/50 mẫu dương tính (chiếm 6,0%), gồm 2 mẫu thận chuột (ML003, ML004) và 1 mẫu thận lợn (PL026) tại chợ Văn Giang, Hưng Yên. Mẫu PL026 được định danh huyết thanh học bằng MAT là Leptospira serovar Bataviae.

4. Thiết lập chu trình luân nhiệt cho hai vòng phản ứng flaB-PCR tổ như thế nào?

• Vòng 1: 94°C trong 1 phút (1 chu kỳ); 25 chu kỳ gồm 94°C trong 10 giây, 50°C trong 30 giây, 72°C trong 1 phút; kéo dài 72°C trong 5 phút; giữ ở 12°C.
• Vòng 2: 94°C trong 1 phút (1 chu kỳ); 30 chu kỳ gồm 94°C trong 10 giây, 55°C trong 30 giây, 72°C trong 50 giây; kéo dài 72°C trong 7 phút; giữ ở 12°C.

5. Tại sao mẫu bệnh nhân HL002 cho kết quả PCR dương tính nhưng nuôi cấy lại âm tính?

Hiện tượng này phản ánh ưu thế của kỹ thuật PCR so với nuôi cấy truyền thống. Vi khuẩn Leptospira trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng có thể đã bị bất hoạt hoặc suy giảm khả năng sống do bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước khi nhập viện, hoặc do ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian vận chuyển mẫu. Trong khi nuôi cấy bắt buộc vi khuẩn phải còn sống và nhân lên được, phản ứng PCR vẫn phát hiện được đoạn ADN đặc hiệu của mầm bệnh tồn lưu trong bệnh phẩm.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Vũ Thị Thùy Linh đã chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật flaB-PCR tổ dùng trong chẩn đoán sớm và phát hiện trực tiếp xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh từ mẫu máu, nước tiểu và phủ tạng động vật. Phương pháp đạt giới hạn phát hiện ở mức $10^1$ vi khuẩn/ml, độ đặc hiệu tuyệt đối với 21 serovar gây bệnh và cho kết quả nhanh chóng trong vòng 3 giờ. Thử nghiệm trên thực địa đã phát hiện mầm bệnh trên 1 mẫu bệnh nhân và 3 mẫu động vật tại Hà Nội và Hưng Yên, chứng minh tính khả thi trong việc ứng dụng quy trình tại các phòng thí nghiệm vi sinh y học tuyến tỉnh và trung ương nhằm nâng cao hiệu quả giám sát dịch tễ và chẩn đoán điều trị Leptospirosis tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lịch sử về bệnh Leptospira Trước năm 1886, bệnh do Leptospira thường được chẩn đoán nhầm với bệnh sốt vàng, sốt rét, sốt xuất huyết Dengue, viêm gan…[27]. Năm 1886, Adolf Weil (bác sĩ người Đức) lần đầu tiên mô tả bệnh do Leptospira là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây vàng da, viêm thận và sau đó bệnh này được mang tên ông – bệnh Weil. Năm 1914 – 1915, tác nhân gây bệnh đồng thời được phát hiện bởi các nhà khoa học Nhật Bản và Đức bằng các nghiên cứu khác nhau.

Inada và Ido tìm thấy xoắn khuẩn và kháng thể đặc hiệu ở những người thợ mỏ Nhật Bản bị bệnh vàng da truyền nhiễm. Năm 1917, chuột được phát hiện là ổ chứa mầm bệnh cho người. Đến những năm 1930 – 1940, Leptospira gây bệnh cho chó và gia súc đã được ghi nhận [11]. Tại Việt Nam, bệnh được Ragiot và Souchard phát hiện lần đầu tiên trên người năm 1931.

Sau đó, xảy ra vụ dịch ở Lai Châu (1964) gây thiệt hại nhiều gia súc và nhiễm cho cả người (1996). Đến nay, bệnh có ở tất cả các vùng miền trong cả nước [30]. Theo số liệu trong nghiên cứu của Ann Florence B Victoriano [26] năm 2009 thì Việt Nam đứng thứ 10 trong khu vực Châu Á Thái Bình Dương về tỉ lệ mắc hàng năm. Vũ Thị Thùy Linh 3 Lớp 11 - 03 Bảng 1.

Tình hình mắc Leptospirosis khu vực Châu Á Thái Bình Dương năm 2009 [26]. Tỉ lệ mắc/100.000 dân hàngnăm Quốc gia/vùng lãnh thổ Cao (>10) Bangladesh Campuchia Fiji French Polynesia Ấn Độ Lào Nêpal Srilanka Thái Lan Việt Nam Wallis và Futuna Trung bình (1-10) Samoa Trung Quốc Indonesia Malaysia New Zealand Philippine Vanuatu Thấp (<1) Úc Hồng Kông Nhật Bản Hàn Quốc Đài Loan Số liệu trong bảng 1 cho thấy Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ mắc Leptospirosis hàng năm trên 100. Cũng theo số liệu từ nghiên cứu, Campuchia và Lào là hai nước trên bán đảo Đông Dương cũng nằm trong nhóm có tỉ lệ mắc rất cao, với vị trí lần lượt là thứ 2 và thứ 6 trong khu vực [26]. Vũ Thị Thùy Linh 4 Lớp 11 - 03 1.

Đặc điểm vi khuẩn học của xoắn khuẩn Leptospira 1. Phân loại Leptospira là xoắn khuẩn, thuộc nhóm được phân chia rất sớm trong sự tiến hóa của vi khuẩn [12]. Leptospira là một trong năm chi thuộc họ Leptospiraceae, bộ Spirochaetales [11]. Sự phân loại của Leptospira cơ bản dựa trên hình thái học.

Năm 1981, Pillot và Ryter dựa trên hình thể và đặc điểm nuôi cấy đã phân chia họ Leptospiraceaebao gồm 2 chi chính là Leptospira và Leptonema. Trong đó, các loài được xác định theo tính đồng nhất đến 70% về thành phần ADN của chúng. Đến năm 1989, chi của Leptospira được chia làm 2 loài: L. Đến nay, Leptospira được xác định bao gồm 12 loài: L.

Tuy nhiên tới nay chỉ có L. fainei được xác định là nguyên nhân gây bệnh ở người [12]. Hình thể, cấu tạo và tính chất. Leptospira là xoắn khuẩn mảnh, dài, đường kính 0,1 – 0,2µm, dài 5–25µm, có dạng hình xoắn lò xo, các vòng xoắn đều nhưng rất nhỏ, phần cuối vòng xoắn có hình móc câu [7,10,11,12].

Leptospira có khả năng di động, mặc dù không có lông nhưng xoắn khuẩn di động được ở dạng lắc lư, co rút, lượn sóng [29]. Nó có thể di chuyển 20 µm trong 2 – 3 giây ở điều kiện nhiệt độ phòng [12]. Leptospira là vi khuẩn Gram âm nhưng khó phát hiện bằng phương pháp nhuộm Gram. Phương pháp truyền thống để phát hiện xoắn khuẩn dưới kính hiển vi là nhuộm Fontana – Tribondeau (nhuộm thấm bạc), vi khuẩn có màu vàng nâu [11].

Thực tế, người ta thường dùng kính hiển vi nền đen để quan sát hình thể và tính chất di động của Leptospira [11].